Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độc tố biển saxitoxin (thuộc nhóm psp) trong phần ăn được của loài nghêu trắng (meretrix lyrata) bằng phương pháp lc-Ms/Ms - Lê Anh Tuấn

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 446 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ BIỂN SAXITOXIN (THUỘC NHÓM PSP) TRONG PHẦN ĂN ĐƯỢC CỦA LOÀI NGHÊU TRẮNG (MERETRIX LYRATA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS Lê Anh Tuấn*, Nguyễn Hữu Phát* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các loài vi tảo là thực phẩm chủ yếu cho các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc (hàu, vẹm, điệp và nghêu). Có khoảng 75 loài vi tảo có khả năng sản sinh các độc tố mạnh. Chúng gây độc cho con người thông qua chuỗi thức ăn gây nên một số bệnh về dạ dày, ruột và thần kinh với con người. Trên thế giới có 5 nhóm độc tố nhuyễn thể chính bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây mất trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) và nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA). Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Saxitoxin trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 để phân tích. Kết quả: Giới hạn định lượng của Saxitoxin là 0,015 mg/kg với độ thu hồi từ 83 – 86%. Kết luận: Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL do EU công bố, có độ ổn định và độ đúng đáp ứng với các thông số theo yêu cầu của quá trình thẩm định phương pháp. Từ khóa: saxitoxin, meretrix lyratab ABSTRACT VALIDATION OF A LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE ANALYSIS OF SAXITOXIN (PSP GROUP) IN EDIBLE PART OF WHITE CLAM (MERETRIX LYRATA) Le Anh Tuan, Nguyen Huu Phat * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 446 – 452 Background: Microscopic planktonic algae of the world’s oceans are critical food for filter-feeding bivalve shellfish (oysters, mussels, scallops, clams). Some species (about 75) which have the capacity to produce potent toxins (called phycotoxins) that can find their way through levels of the food chain (e.g: molluscs, crustaceans and finfish) and are ultimately consumed by humans causing a variety of gastrointestinal and neurological illnesses. Until now, five groups of shellfish toxins have been distinguished, namely: paralytic shellfish toxins causing paralytic shellfish poisoning (PSP); diarrhoeic shellfish toxins causing diarrhoeic shellfish poisoning (DSP); amnesic shellfish toxins causing amnesic shellfish poisoning (ASP); neurotoxic shellfish toxins causing neurotoxic shellfish poisoning (NSP); and azaspiraxit shellfish toxins causing azaspiraxit shellfish poisoning (AZP). Objectives: Validation of method for the analysis of Saxitoxin (PSP group) in edible part of Meretrix lyrata. Methods: Chemical method is based on liquid chromatography (LC) coupled with (tandem) mass spectrometry (MS/MS). *Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Hữu Phát ĐT: 0969241883 Email: huuphatk@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 447 Results: The accuracy ranged from 83 to 86%, and the detection limit is 0.005 mg/kg. Conclusions: Results of the validation process confirmed its fitness for purpose as a quantitative method. Based on these values for precision and recovery, it was concluded that the method is suitable for official control purposes to quantitatively determine Saxitoxin. Key words: saxitoxin, meretrix lyrata ĐẶT VẤN ĐỀ Các loài vi tảo là thực phẩm chủ yếu cho các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc (hàu, vẹm, điệp và nghêu). Trong số 5000 loài tảo biển đã được biết, có khoảng 300 loài có thể xuất hiện với số lượng lớn và nở hoa có khả năng làm thay đổi màu nước biển hay còn được gọi là “thủy triều đỏ”. Một vài loài làm biến đổi màu nước nhưng về cơ bản là vô hại. Mặt khác, một số loài có thể nở hoa quá dày đặc nên chúng làm chết cá và các động vật không xương sống do sự suy giảm oxy. Một số loài tảo khác có thể gây hại cho cá và các động vật không xương sống bằng cách phá hủy hoặc gây tắt nghẽn mang của chúng. Hơn thế nữa, có khoảng 75 loài vi tảo có khả năng sản sinh các độc tố mạnh. Chúng gây độc cho con người thông qua chuỗi thức ăn gây nên một số bệnh về dạ dày, ruột và thần kinh với con người. Đến nay, năm nhóm độc tố nhuyễn thể đã được biết gồm: Nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (Paralytic Shellfish poisoning - PSP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây mất trí nhớ (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP); Nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP); Các độc tố nhóm Azaspiraxit (AZP) – có tác động tương tự DSP. Trong số các độc tố biển đã được biết đến, độc tố thuộc nhóm ASP, DSP và PSP là những độc tố được các quốc gia và tổ chức quốc tế quan tâm nhiều nhất. Nhóm độc tố PSP từng được xác định dựa trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang. Các độc tố PSP được chiết ra khỏi mẫu thử bằng acetic axit. Dịch chiết chứa các độc tố PSP được bơm vào thiết bị HPLC. Tại hệ thống phản ứng sau cột, các độc tố PSP được ôxy hoá bởi periodic axit trong môi trường kiềm tạo thành dẫn xuất có tính huỳnh quang. Các dẫn xuất này được phân tích trên HPLC với detector huỳnh quang. Phương pháp này được hướng dẫn thực hiện trong TCVN 8339:2010(5). Hiện nay, trong bối cảnh các độc chất tồn dư trong thực phẩm xuất hiện với tần suất ngày càng nhiều, chủng loại đa dạng và cấu trúc phức tạp. Sự xuất hiện của những độc chất này gây khó khăn trong quá trình kiểm nghiệm dựa trên nguyên lý sắc ký ghép nối đầu do quang phổ (tử ngoại – khả kiến, huỳnh quang), vốn có độ đặc hiệu thấp và dễ gây dương tính giả. Do đó, việc sử dụng phương pháp kiểm nghiệm dựa trên nguyên lý sắc ký ghép khối phổ đa tầng là lựa chọn hữu hiệu nhất hiện nay đối với các kiểm nghiệm có liên quan đến độc chất cũng như chất cấm trong thực phẩm. Trong số các thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ hiện nay thì hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò 3 tứ cực là lựa chọn tối ưu cho các kiểm nghiệm định tính và định lượng các độc chất trong thực phẩm. Do đó, nghiên cứu sẽ được thực hiện xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Saxiton trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500. Mục tiêu nghiên cứu Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) các độc tố biển trong nhuyễn thể được EU ban hành vào năm 2004(4) áp dụng cho các độc tố PSP, ASP (tính theo domoic axit) và Okadaic lần lượt là 800 µg/kg, 20 mg/kg và 160 µg/kg. Bên cạnh đó, giới hạn hàm lượng các độc tố PSP, ASP và DSP đối với nhuyễn thể ở Việt Nam đã được quy định trong “TCVN 8681:2011 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”(6) với mức cho phép (mg/kg) lần lượt là 0,8; 20 và “không phát hiện”. Trong giới hạn của nghiên cứu này, quy trình Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 448 phân tích xác định Saxitoxin (đại diện cho nhóm PSP) trong phần ăn được của loài Nghêu trắng (Meretrix lyrata) sẽ được tập trung nghiên cứu. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghêu trắng hay còn gọi là Nghêu Bến Tre (Sowerby, 1851), có tên khoa học là Meretrix lyrata, và còn có tên gọi khác là Lyrate Asiatic, phân bố phía Tây Thái Bình Dương, từ Đài Loan đến Việt Nam. Ở Việt Nam, Nghêu thường phân bố nhiều ở vùng ven biển phía Nam, bao gồm các tỉnh: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Nghêu là loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ, sống trong lớp trầm tích đáy ở vùng cửa sông, có nguồn thức ăn là những loài vi tảo và các hạt rắn chứa chất hữu cơ lơ lửng trong nước hoặc tích lũy ở bề mặt lớp trầm tích. Nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (Paralytic Shellfish poisoning - PSP) là nhóm chất có độc tính cao được tạo ra bởi dinoflagellates và cyanobacteria. Sự tích lũy độc tố PSP qua chuỗi thức ăn gây nguy cơ ảnh hưởng cho sức khỏe của con người nếu ăn phải. Độc tố PSP khóa kênh natri (sodium channels) của màng thần kinh, do đó gây nên các triệu chứng như tê liệt, khó thở, suy cơ, trường hợp ngộ độc nặng có thể dẫn đến tử vong. Trường hợp đầu tiên ngộ độc được ghi nhận đã làm ít nhất 6 người chết vào năm 1920 ở California (Mỹ). Saxitoxin (STX) là chất có độc tính cao, và có liều gây chết trung bình LD50 cho người là 5,7 µg/kg(1) (Bảng 1, Hình 1). Bảng 1: Công thức cấu tạo nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 Saxitoxin (STX) H H H OCONH2 Decarbamoyl saxitoxin (dcSTX) H H H OH Neosaxitoxin (NEO) OH H H OCONH2 Gonyautoxin 1 (GTX1) OH H OSO3H OCONH2 Gonyautoxin 2 (GTX2) H H OSO3H OCONH2 Gonyautoxin 3 (GTX3) H OSO3H H OCONH2 Gonyautoxin 4 (GTX4) OH OSO3H H OCONH2 Gonyautoxin 5 (GTX5) H H H OCONHSO3H Hình 1: Công thức cấu tạo nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) Phương pháp nghiên cứu Quy trình vận hành thiết bị và xử lý mẫu sẽ được tối ưu từ thông số ban đầu của Luckas et al (2015)(2) và Mcnabb et al (2005)(3). Các bước tiến hành cụ thể như sau: (1) Mẫu nghêu được tách bỏ vỏ, thu lấy phần thịt ăn được sau đó xay nhuyễn bằng máy đồng nhất mẫu và cân 4 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL; (2) Thêm 10 mL HCl 0,1 N, đồng nhất bằng máy trong 1 phút; (3) Đậy kín nắp, đun sôi 15 phút trên bếp cách thủy; (4) Để nguội về nhiệt độ phòng, ly tâm, chuyển dịch ly tâm vào bình 20 mL; (5) Thực hiện tương tự bước (iv) với 5 mL HCl 0,1 N; (6) Gộp dịch chiết lần 2 vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch bằng nước cất; (7) Lọc dịch chiết qua phin lọc có đường kính lỗ lọc là 0,45 µm, pha loãng 2 lần bằng pha động. Trước khi áp dụng bất kỳ phương pháp phân tích nào vào thực tế, cần phải tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (hay thẩm định) nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả thu được. Các bước tiến hành và tiêu chí đánh giá kết quả của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của tài liệu “Thẩm định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật”(7), bao gồm các thông số như: xác định số điểm IP; xây dựng đường chuẩn; xác định giới hạn phát hiện – giới hạn định lượng của phương pháp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 449 (LOD - LOQ); độ lặp lại; độ tái lặp và độ đúng. Các bước thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp cụ thể như sau: Khoảng tuyến tính Tiến hành đo dung dịch chuẩn chất Saxitoxin. Khoảng tuyến tính được lựa chọn sao cho khi thiết lập phương trình đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu đo vào nồng độ có hệ số R2 ≥0,99. Giới hạn định luợng (MLOQ) của phương pháp Ước lượng LOD lý thuyết bằng cách: (1) Phân tích các mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần, LOD lý thuyết là giá trị nồng độ mà tại đó có Signal/Noise ≥ 3; (2) Phân tích 6 mẫu thêm ở nồng độ 5-7 lần LOD lý thuyết (nồng độ LOQ lý thuyết); (3) Tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ 6 kết quả phân tích, (4) MLOD được tính theo công thức: MLOD =3×SD; (5) Đánh giá MLOD tính được theo tỉ số R, với: R = XTB/(3xSD); (6) Nếu 4 < R< 10 ta chấp nhận giá trị MLOD vừa tính được, nếu R <4 chứng tỏ MLOD thực tế lớn hơn giá trị vừa tính được và cần thêm chuẩn ở nồng độ cao hơn và tính toán lại giá trị MLOD, nếu R > 10 chứng tỏ MLOD thực tế nhỏ hơn giá trị vừa tính được, cần thêm chuẩn ở nồng độ thấp hơn và tính toán lại giá trị MLOD; (7) Giới hạn định lượng được tính theo công thức MLOQ = 3xMLOD. Độ lặp lại Lựa chọn 3 giá trị nồng độ phân bố đều trong khoảng làm việc để đánh giá độ lặp lại, trong đó có một giá trị nồng độ tại MLOQ, ở mỗi nồng độ thực hiện phân tích lặp lại 6 lần, độ lặp lại được đánh giá thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD% = (SDx100)/XTB. Độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm Thực hiện phân tích lặp lại 6 mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ đã thực hiện khi đánh giá độ lặp lại với sự thay đổi một số điều kiện phân tích như: thiết bị phân tích, ngày phân tích, nhân viên phân tích. Tập hợp các kết quả phân tích trong điều kiện tái lặp nội bộ và lặp lại, ứng với mỗi giá trị nồng độ tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ 12 kết quả phân tích. Hiệu suất thu hồi Dựa vào kết quả nồng độ tính (Cthu hồi) được trên các mẫu thêm chuẩn trong quá trình đánh giá độ lặp lại và độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm với nồng độ lý thuyết (Clý thuyết) thêm vào, hiệu suất thu hồi được tính toán theo công thức: H% = Cthu hồix100/Clý thuyết. Độ không đảm bảo đo Mọi phép đo đều có sai số nhất định. Do vậy, ĐKĐBĐ là một phần quan trọng của kết quả đo, ĐKĐBĐ được tính thông qua độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm kết hợp với độ chệch của phương pháp. Cách tính ĐKĐBĐ gồm các bước sau: (1) Tính ĐKĐBĐ theo độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (n: số lần phân tích lặp lại ở mỗi nồng độ), RSD% là RSD% lớn nhất trong số 3 giá trị RSD ứng với 3 nồng độ khảo sát; (2) Tính bias của 3 nồng độ, sau đó tính ; (3) Độ không đảm bảo đo của mẫu thêm chuẩn , được ước lượng dựa trên độ không đảm bảo đo của thể tích thêm chuẩn và độ không đảm bảo đo của chất chuẩn ; (4) Tính ĐKĐBĐ theo độ chệch của phương pháp ; (5) Tính ĐKĐBĐ tổng hợp ; (6) Tính ĐKĐBĐ mở rộng ( hệ số phủ, độ tin cậy 95%). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 450 KẾT QUẢ Điều kiện phân tích Bảng 2: Thông số DP, CE, chỉ số IP và cặp ion mẹ / ion con của Saxitoxin ESI Ion mẹ Ion con DP CE IP Saxitoxin + 300 282 50 30 4 + 300 204 50 30 Bảng 3: Thông số sắc kí lỏng (LC) và khối phổ (MS/MS) trong phân tích Saxitoxin Thông số Giá trị Thông số sắc kí lỏng Hệ pha động (A) Acetonitrile chứa 10mM HFBA (B) H2O chứa 10mM HFBA Cột C18 Inertsil 150mm x 5µm Tốc độ dòng 0,8 mL/phút Chương trình gradient Thời gian %A %B 0,01 20 80 Thông số Giá trị 5 80 20 6 80 20 6,1->10,0 20 80 Thông số khối phổ CUR – Tốc độ dòng khí N2 làm sạch 20 psi IS – Thế ion hóa 5500 V CAD – Khí va đập medium TEM – Nhiệt độ hóa hơi dung môi 500 o C GS1 – Khí phun sương 40 psi GS2 – Khí thổi khô 40 psi Áp dụng các thông số đã lựa chọn vào phân tích dung dịch mẫu thêm chuẩn, kết quả cho thấy píc chất phân tích tách rời khỏi các píc nhiễu và có hình dạng sắc nét phù hợp để phân tích định lượng (Hình 2). XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/282.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) Max. 5485.0 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0 2000 4000 6000 6780 In te n s ity , c p s 4.78 7.79 8.635.644.94 6.43 6.84 7.34 8.136.15 7.24 8.862.84 4.02 4.42 9.70 XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/282.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) Max. 5485.0 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0 1000 2000 3000 4000 5000 In te n s ity , c p s 4.78 7.79 8.635.644.94 6.43 6.84 7.34 8.136.15 7.24 8.862.84 4.02 4.42 9.70 XIC of +MRM (3 pairs): 300.000/204.000 Da ID: STX from Sample 35 (C3-06) of Data20181119-STX.wiff (Turbo Spray) Max. 6780.0 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0 2000 4000 6000 6780 In te n s ity , c p s 4.77 Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Saxitoxin Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp Hợp chất Saxitoxin khi định lượng trên khối phổ MS/MS có số điểm IP là 4, phù hợp với yêu cầu cho độ đặc hiệu của phương pháp. Trong quá trình thực hiện xác định giá trị sử dụng phương pháp các mẫu blank đều cho kết quả không phát hiện và khi thêm chuẩn ở nồng độ gần LOQ các kết quả đều cho hiệu suất thu hồi tốt. Như vậy, phương pháp có độ chọn lọc cao cho Saxitoxin. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn Phương trình đường chuẩn (dạng đường tuyến tính bậc I) Saxitoxin có nồng độ từ 10 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 451 µg/L đến 100 µg/L cho hệ số R2 tốt (R2 >0,99), đó cũng là khoảng nồng độ làm việc. Bên cạnh đó, kết quả đánh giá hiệu ứng nền cũng cho thấy ảnh hưởng của nền lên sự thăng/gián tín hiệu đo đều nằm trong mức 20% ở tất cả các nồng độ (Hình 3). Hình 3: Phương trình đường chuẩn của Saxitoxin Giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả phân tích lặp lại 12 lần mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 15 µg/kg tương ứng với Saxitoxin được sử dụng cho việc xác định hệ số R. Ở nồng độ thêm chuẩn này đều cho giá trị 4<R<10, do vậy giá trị nồng độ này được lựa chọn là MLOQ của phương pháp. Bảng 4: Kết quả của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Thông số Saxitoxin MLOQ (μg/kg) 15 MLOD (μg/kg) 5 Độ không đảm bảo đo (%) 27,84 Độ tái lặp (%) 5,2 Nồng độ khảo sát (μg/kg) 15 45 70 Độ lặp lại (%) 3,7 2,5 4,6 Độ thu hồi (%) 83 83 86 MLOQ của phương pháp nhỏ hơn MRPL do EU đưa ra. Do đó, phương pháp đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy cho phân tích Saxitoxin (Bảng 4). Hiệu suất thu hồi (Recovery) và độ lặp lại (Repeatability) Kết quả phân tích lặp lại 6 mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 15, 45, 70 µg/kg (Saxitoxin) cho thấy ở cả ba nồng độ khảo sát có RSD% và H% đều đáp ứng được tiêu chí theo AOAC cho từng nồng độ. Như vậy, phương pháp cho độ lặp lại và hiệu suất thu hồi phù hợp với yêu cầu. Độ tái lặp nội bộ trong phòng thí nghiệm (Reproductibility within laboratory) Phương pháp cho độ tái lặp tốt khi phân tích với độ lệch chuẩn tương đối RSD% ≤10%, đạt được tiêu chí chấp nhận Rw =RSD% <30%. Độ không đảm bảo đo và phân tích mẫu thực Giá trị độ không đảm bảo đo của phương pháp cho Saxitoxin là 27,84%. BÀN LUẬN Quy trình phân tích mẫu Quy trình phân tích mẫu cho xác định Saxitoxin trên thiết bị LC-MS/MS tương đối đơn giản. Phần tối ưu hóa thông số thiết bị MS/MS và điều kiện chạy trên LC ảnh hưởng nhiều đến phân tích Saxitoxin. Với phương pháp xây dựng được, Saxitoxin được phân tách trên LC với hệ pha động ghép cặp ACN:HFBA. Đây là điểm mới của phương pháp so với các công trình nghiên cứu xác định Saxitoxin đã công bố. Các kết quả đánh giá thông số cho phương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 452 đều đạt chứng minh phương pháp xây dựng được phù hợp định lượng độc tố Saxitoxin trong nền mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Phân tích mẫu Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng được, tiến hành xác định dư lượng của Saxitoxin trong một số mẫu nghêu được mua tại các chợ trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh. Kết quả khảo sát bước đầu cho thấy toàn bộ các mẫu đều âm tính đối với Saxitoxin. Tuy nhiên, nghiên cứu chỉ hạn chế trong xét nghiệm chất đại diện của nhóm PSP vì vậy vẫn có khả năng tồn tại các chất độc khác thuộc nhóm này trong nghêu. Do đó để có thể kết luận chính hơn xác về sự hiện diện của các chất độc nhóm PSP trong nghêu, cần có một nghiên cứu sâu hơn trong tương lai về cả phạm vi lấy mẫu lẫn số lượng các chất độc thuộc nhóm PSP vừa nêu. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp cho phép xác định dư lượng Saxitoxin trong nghêu. Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL do EU công bố, có độ ổn định và độ đúng đáp ứng với các thông số theo yêu cầu của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Trong giới hạn của nghiên cứu, nhóm tác giả chỉ phân tích một hợp chất tiêu biểu đại diện tương ứng cho nhóm độc tố biển. Tuy nhiên, các độc tố trong cùng một nhóm có tính chất hóa học khá giống nhau, do đó phương pháp đã nghiên cứu hoàn toàn có khả năng phân tích được tất cả các độc tố trong cùng một nhóm độc tố biển. TAI LIỆU THAM KHẢO 1. Harju K, Rapinoja ML, Avondet MA, et al (2015). “Optimization of Sample Preparation for the Identification and Quantification of Saxitoxin in Proficiency Test Mussel Sample using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry”. Toxins, 7:4868– 4880. 2. Luckas B, Erler K and Krock B (2015). “Analysis of Marine Biotoxins Using LC-MS/MS”, Natural Products from Marine Algae: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, 1308:277-297. 3. Mcnabb P, Selwood AI and Holland PT (2005). “Multiresidue Method for Determination of Algal Toxins in Shellfish: Single- Laboratory Validation and Interlaboratory Study”. Journal of AOAC International, 88(3):761-772. 4. Official Journal of the European Union (2004). “Regulation (Ec) No 853/2004 of the European Parliament and of The Council”. Journal of AOAC International, 88(3):761-772. 5. Tiêu chuẩn Việt Nam (2010). “Nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) - Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao”. TCVN 8339:2010. 6. Tiêu chuẩn Việt Nam (2010). “Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”. TCVN 8681:2011. 7. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật. Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia Hà Nội, pp.10-59. Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019