Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun râu mèo

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 123 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG SINENSETIN TRONG CAO KHÔ SẤY PHUN RÂU MÈO Nguyễn Thị Thu Thùy*, Huỳnh Trần Quốc Dũng**, Nguyễn Đức Hạnh*, Nguyễn Minh Đức***, Nguyễn Phương Dung**** TÓM TẮT Mở đầu - mục tiêu: Râu mèo là dược liệu cổ truyền được sử dụng trong nhiều bài thuốc với công dụng chính là lợi tiểu. Sinensetin là thành phần chính có tác dụng sinh học quan trọng của Râu mèo, được Dược điển Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu. Định lượng sinensetin đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm cao chiết từ Râu mèo. Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và Phương pháp: Phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo được thẩm định theo hướng dẫn của ICH với các chỉ tiêu gồm tính tương tích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. Kết quả: Điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo gồm: Cột Thermo Syncronis RP18 (250 × 4,6 mm; 5 μm), bước sóng phát hiện 258 nm, nhiệt độ 30oC, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl. Pha động gồm acetonitril và nước với tỷ lệ acetonitril là 42%, 65% lần lượt trong các khoảng thời gian 0 - 20 phút, 21 - 30 phút. Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính (ŷ = 50,53x với R2 = 0,9988), độ chính xác trung gian (% RSD = 1,51%), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 95,98% - 102,43%. Kết luận: Phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đã được thẩm định và có thể được ứng dụng để xây dựng chỉ tiêu định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo. Từ khóa: Sinensetin, HPLC, Râu mèo, thẩm định. ABSTRACT DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN HPLC METHOD FOR SINENSETIN ANALYSIS FROM ORTHOSIPHON STAMINEUS SPRAY-DRIED EXTRACT Nguyen Thu Thu Thuy, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Hanh, Nguyen Minh Duc, Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 123 - 128 Objectives: Orthosiphon stamineus is a traditional herbal medicine with the well-known diuretic activity. Sinensetin, a major bioactive compound of O. stamineus, is officially used as a biomarker for O. stamineus by British Pharmacopoeia 2016. For quality control of O. stamineus extract and its products, it is important to determine sinensetin content. This study aimed at developing and validating an HPLC method for sinensetin analysis from O. stamineus spray-dried extract. Methods: HPLC conditions for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract were screened and the best condition was selected. The HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines for its system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy. Results: The best HPLC condition for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract employed Thermo Syncronis RP18 column (250 × 4.6 mm; 5 μm), a detection wavelength of 258 nm, a column Khoa Dược - Đại Học Y Dược TP. HCM ** Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP. HCM *** Khoa Dược - Đại Học Tôn Đức Thắng **** Khoa Y Học Cổ Truyền - Đại Học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0913576748 Email: duchanh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 124 temperature of 30oC, a flow rate of 1 ml/min, and an injection volume of 20 μl. Mobile phase was mixtures of acetonitrile and water with a gradient program. The ratios of acetonitrile were 42% and 65% at 0 – 20 min and 21 – 30 min, respectively. The specificity and suitability of the analytical method were found to meet the requirement. A good correlation between peak areas and sinensetin concentrations was obtained with R2 = 0.9988. The % RSD value of inter-day precision was found to be at 1.51%. The HPLC method accuracy met the requirement with recovery percentages of 95.98 – 102.43%. Conclusions: An HPLC method for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract successfully developed. This method met the requirements of validation and could be useful for improving the quality of O. stamineus spray-dried extract and the related products. Keywords: Sinensetin, HPLC, Orthosiphon stamineus, Râu mèo, validation. ĐẶT VẤN ĐỀ Râu mèo là một dược liệu cổ truyền được sử dụng với tác dụng chính là lợi tiểu. Râu mèo được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc dân gian, đồng thời cũng là một thành phần quan trọng trong nhiều chế phẩm Đông dược trên thị trường hiện nay dùng điều trị các bệnh về thận, bàng quang cũng như một số bệnh về khớp(2). Sinensetin (Hình 1) là một trong những thành phần hóa học quan trọng của Râu mèo, được Dược điển Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng cho dược liệu này(1). Việc áp dụng các dạng bào chế hiện đại và tiêu chuẩn kiểm nghiệm vào các sản phẩm từ thiên nhiên đang là xu hướng chung của nền y học cổ truyền nhằm tạo ra sản phẩm thuận tiện và chất lượng phục vụ cho người tiêu dùng. Trong đó, cao chiết là một trong những bán thành phẩm quan trọng trong quá trình sản xuất các thuốc từ dược liệu, việc đánh giá chất lượng thông qua hàm lượng hoạt chất là yếu yếu tố cần thiết, quyết định cho hiệu quả điều trị của sản phẩm cuối cùng. O OMe OMe O MeO OMe MeO Hình 1. Công thức cấu tạo của sinensetin Nhằm hướng đến mục tiêu bào chế các sản phẩm từ Râu mèo với tiêu chuẩn chất lượng được đánh giá thông qua hàm lượng hoạt chất sinensetin. Nhóm nghiên cứu bước đầu thực hiện đề tài với nội dung “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo bằng phương pháp HPLC”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng và nguyên liệu Cao khô sấy phun Râu mèo (số lô 0041117) được cung cấp bởi PGS.TS. Nguyễn Phương Dung. Sinensetin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,63% tính theo dạng khan) do Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Ethanol (EtOH) đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức). Acetonitril (Scharlau, Tây Ban Nha) và nước cất 2 lần đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC. Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo sử dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức), detector UVD 2,1L (Đức), cột sắc ký Thermo Syncronis RP18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột HQ 105 C18 (10×4,6 mm; 5 µm) (Thermo Scientific, Mỹ), nhiệt độ 30oC, bước sóng phát hiện 258 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl. Thăm dò một số chương trình pha động gồm: 3 chương trình gradient sử dụng hỗn hợp acetonitril - nước làm dung môi. Chọn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 125 điều kiện HPLC sao cho pic sinensetin tách khỏi các pic tạp và các thông số sắc ký đạt yêu cầu. Quy trình định lượng Mẫu thử Cân chính xác khoảng 263 mg cao khô sấy phun Râu mèo, cho vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 3 ml EtOH 30%, siêu âm trong 15 phút, để nguội, bổ sung EtOH 30% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,2 µm. Mẫu chuẩn Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 1,9 mg chuẩn sinensetin cho vào bình định mức 10 ml, thêm 3 ml ethanol, siêu âm trong 15 phút, để nguội rồi thêm ethanol đến vạch, lắc đều. Dung dịch chuẩn (nồng độ sinensetin khoảng 13,6 µg/ml): Cho chính xác 360 µl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 5 ml, thêm ethanol đến vạch, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,2 µm. Điều kiện HPLC Hệ thống HPLC: Knauer Azura đầu dò UV D 2.1L (Đức). Cột sắc ký: Thermo Syncronis RP18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). Bước sóng phát hiện: UV 258 nm. Chương trình pha động: Dựa trên kết quả khảo sát điều kiện. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Nhiệt độ cột 30oC. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Hàm lượng sinensetin (X, µg/g) trong cao khô sấy phun Râu mèo được tính theo công thức: St, Sc: Diện tích pic sinensetin của mẫu thử và mẫu chuẩn. C: Nồng độ dung dịch sinensetin chuẩn (µg/ml). mt: Khối lượng cân của cao khô sấy phun Râu mèo. a (%): Hàm lượng của sinensetin chuẩn. Thẩm định quy trình định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo Thẩm định quy trình định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo theo hướng dẫn của ICH(3) về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo Khảo sát các điều kiện pha động với các tỷ lệ dung môi acetonitril – nước khác nhau trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Các điều kiện pha động HPLC định lượng sinensetin Chương trình Thời gian (phút) Tỷ lệ dung môi pha động CH3CN-H2O (tt/tt) I 0 – 15 50:50 16 – 25 65:35 II 0 – 20 46:54 21 – 30 65:35 III 0 – 20 42-58 21 – 30 65:35 Kết quả khảo sát các điều kiện pha động được trình bày trong Hình 2. Chọn điều kiện pha động III để thẩm định quy trình định lượng. Thẩm định quy trình định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo Tính tương thích hệ thống Bảng 2. Tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong mẫu thử (n=6) STT tR (phút) S (mAU.s) As Rs N 1 14,7 790,2 1,12 3,5 60387 2 14,8 786,0 1,10 3,7 58392 3 14,7 792,5 1,08 3,5 59983 4 14,7 778,3 1,08 3,3 60377 5 14,6 800,3 1,12 3,5 61837 6 14,7 793,9 1,03 3,6 57268 TB 14,7 790,2 1,09 3,5 59707 SD 0,063 7,487 0,8 ≤ As≤ 1,2 Rs ≥ 1,5 - %RSD 0,39% 0,60% Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng sinensetin Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 126 cao khô sấy phun Râu mèo theo điều kiện sắc ký pha động III được trình bày trong Bảng 2. Thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) của pic sinensetin đều nhỏ hơn 2%. Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,2. Độ phân giải lớn hơn 1,5. Vì vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt tính tương thích hệ thống. Tính đặc hiệu Chuẩn bị các mẫu khảo sát tính đặc hiệu gồm: Mẫu trắng (EtOH 30%), mẫu chuẩn (như trên), mẫu thử (như trên), mẫu thử thêm chuẩn (thêm sinensetin chuẩn vào dung dịch mẫu thử). Tiến hành: Sắc ký các mẫu trên theo phương pháp HPLC đã chọn, kết quả được trình bày trong Hình 3. Hình 2. Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với các điều kiện pha động khác nhau Hình 3. Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo: (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, (c) mẫu thử và (d) mẫu thử thêm chuẩn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 127 Mẫu trắng (Hình 3a) không cho pic trùng với thời gian lưu của sinensetin trong mẫu chuẩn (Hình 3b) và mẫu thử (Hình 3c). Sắc ký đồ mẫu thử (Hình 3c) cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của sinensetin trong mẫu chuẩn (Hình 3b). Pic sinensetin tách hoàn toàn các pic khác trong mẫu chuẩn (Hình 3b) và mẫu thử (Hình 3c). Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn (Hình 3d) có chiều cao và diện tích pic sinensetin tăng lên so với mẫu thử (Hình 3c). Phổ UV – Vis tại thời gian lưu của sinensetin trong mẫu thử trùng với phổ UV – Vis tại thời gian lưu của pic tương ứng trong mẫu chuẩn (Hình 4). Hình 4. Phổ UV – Vis của (a) sinensetin chuẩn và (b) sinensetin trong mẫu thử Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic với đầu dò PDA trên hệ thống HPLC Water cho thấy pic sinensetin trong mẫu chuẩn và mẫu thử đạt yêu cầu về độ tinh khiết pic. Vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt tính đặc hiệu. Tính tuyến tính Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo được trình bày trong Hình 5. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của sinensetin được xử lý bằng phần mềm Ms – Excel 2010 và các trắc nghiệm thống kê cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ sinensetin. Kết quả xử lý thống kê được trình bày trong Bảng 3. Kết quả xử lý thống kê cho thấy giá trị F thực nghiệm lớn hơn giá trị F0,05 nên phương trình hồi quy tương thích. Giá trị t của hệ số B lớn hơn t0,05 nên hệ số B có ý nghĩa. Giá trị t của hệ số B0 nhỏ hơn t0,05 nên hệ số B0 không có ý nghĩa. Vậy, phương trình hồi quy tuyến tính là: ŷ = 50,53x với (R2 = 0,9988). Bảng 3. Kết quả xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính của phương pháp HPLC định sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo R 2 0,9988 Phương trình hồi quy ŷ = Bx + B0 ŷ = 50,535x Hệ số B 50,535 Giá trị t của hệ số B 57,21 Hệ số B0 0,1236 Giá trị t của hệ số B0 0,0034 Giá trị F 3273,9 Giá trị F0,05 7,71 Giá trị t0,05 2,74 Khoảng nồng độ khảo sát (μg/ml) 3,22 – 66,40 Hình 5. Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ sinensetin (n=6) Độ chính xác Bảng 4. Độ lặp lại và độ lặp lại trung gian của phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo STT Hàm lượng sinensetin (μg/g) Giá trị thống kê 3 ngày Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 1 297,26 294,49 295,36 TB: 296,88 (μg/g) SD: 4,49 RSD: 1,51% 2 289,85 286,62 294,79 3 295,97 298,02 300,00 4 301,67 296,31 293,21 5 300,19 302,09 304,12 6 294,49 297,03 302,42 TB 296,57 295,76 296,12 SD 4,23 5,15 4,49 RSD 1,43% 1,74% 1,51% Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 128 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ lặp lại trung gian của phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo được trình bày trong Bảng 4. RSD % ứng với độ lặp lại và độ lặp lại trung gian của sinensetin đều dưới 2%. Vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu về độ lặp lại và độ lặp lại trung gian. Độ đúng Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5. Độ đúng của phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo (n=9) STT Tỉ lệ chuẩn thêm vào (%) Lượng sinensetin trong mẫu thử (μg) Lượng sinensetin chuẩn cho vào (μg) Lượng sinensetin tìm thấy (μg) Tỉ lệ hồi phục (%) Tỉ lệ hồi phục trung bình (%) %RSD 1 80 78,20 62,48 61,60 98,59 98,51 1,26 2 78,80 62,48 62,30 99,71 3 76,15 62,48 60,75 97,23 4 100 78,25 78,10 78,80 100,90 101,64 0,76 5 77,25 78,10 79,35 101,60 6 76,20 78,10 80,00 102,43 7 120 78,35 93,72 89,95 95,98 97,01 1,24 8 76,70 93,72 90,65 96,72 9 77,45 93,72 92,15 98,32 TB 99,05 1,08 BÀN LUẬN Trong thử nghiệm khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo, các điều kiện I và II, pic sinensetin dính với các tạp phân cực, không đạt độ tinh khiết pic. Ở điều kiện III, pic sinensetin tách hoàn toàn với các tạp khác, các thông số của pic đạt yêu cầu. Do vậy, điều kiện III được chọn để tiến hành định lượng sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo. Theo yêu cầu của ICH, phương pháp HPLC định lượng sinensetin ứng với nồng độ khảo sát đạt yêu cầu khi độ phục hồi trong khoảng 90 - 107%(3) và % RSD ≤ 5,3%. Kết quả thẩm định cho thấy, phương pháp kiểm nghiệm đạt yêu cầu về độ đúng. Như vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng và có thể ứng dụng để định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo. KẾT LUẬN Phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đã được thẩm định các tiêu chí theo hướng dẫn của ICH. Kết quả thẩm định đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ chính xác cao (RSD% độ lặp lại trung gian là 1,51%), độ đúng với độ phục hồi trong khoảng 95,98% - 102,43%. Vì vậy, phương pháp này có thể được ứng dụng để định lượng sinensetin trong mẫu cao sấy phun Râu mèo, hướng tới tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bristish Pharmacopoeia Commisssion (2016). Bristish Pharmacopoeia 2016. The Stationery Office, pp. 237-238. 2. Đỗ Huy Bích (2006). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập II. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 623-625. 3. International Conference on Hamonization (1997). “Guideline on Validation of Analytical Procedures: Methodology”. Fed. Regist; 62:27464-27467. Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018