Xây dựng quy trình xác định methyl thủy ngân trong cá bằng phương pháp LC – ICP –MS - Tống Lê Bảo Trâm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 615 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH METHYL THỦY NGÂN TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – ICP –MS Tống Lê Bảo Trâm*, Cù Hoàng Yến*, Nguyễn Hữu Phát* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Là một chất gây ô nhiễm toàn cầu, thủy ngân xâm nhập vào chuỗi thức ăn hai dạng hóa học vô cơ và hữu cơ: thủy ngân kim loại, mercuricsulfide (quặng cinnabar), Mercuric Clorua và Methyl thủy ngân. Methyl thủy ngân là dạng thủy ngân chủ yếu trong cá. Ở hầu hết các loài cá trưởng thành, 90% - 100% hàm lượng thủy ngân là Methyl thủy ngân (USEPA 2001). Để hỗ trợ cho việc giám sát chất lượng thủy sản, cần phải có một phương pháp phân tích nguyên dạng thủy ngân hữu cơ với độ nhạy, độ ổn định, độ tin cậy cao và hiệu quả. Trong bài báo, chúng tôi tập trung vào một số điểm quan trọng của quy trình phân tích thủy ngân nguyên dạng bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ. Mục tiêu: Nghiên cứu và xây dựng một quy trình tin cậy trong việc xác định hàm lượng Methyl thủy ngân trong cá. Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện phân tích nhằm tiết kiệm chi phí, hóa chất nhưng vẫn đảm bảo kết quả phân tích có độ chính xác và tin cậy cao. Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau khi xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị vào phương pháp xác định Methyl thủy ngân trong cá, nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp và đưa ra hướng phát triển mới của kỹ thuật pha loãng đồng vị. Phương pháp nghiên cứu: Tham khảo và tổng hợp tài liệu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài nghiên cứu nhằm định hướng cho việc nghiên cứu quy trình; khảo sát quy trình và tối ưu hóa thiết bị sử dụng LC–ICP– MS trong phân tích hàm lượng Methyl thủy ngân; thẩm định độ tin cậy và độ chính xác của quy trình. Kết quả: Phát triển phương pháp xác định Methyl thủy ngân trong cá sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (LC-ICP-MS). Methyl thủy ngân được ly trích trong dung dịch L-Cysteine.HCl.H2O 1% (w/v) trong 30 phút, ở 50 oC trong bể siêu âm. Dung dịch sau ly trích được ly tâm và lọc qua màng lọc 0,45 µm. Sự phân tách sắc ký của các dạng thủy ngân được thực hiện trên cột pha đảo C18 với pha động gồm L-Cysteine 0,1% (w/v), L-Cysteine.HCl.H2O 0,1% (w/v) và Methanol 5% (v/v). Kết quả của việc thẩm định phương pháp bao gồm: khoảng tuyến tính của Methyl thủy ngân từ 0,2 đến 10 µg/kg, giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp lần lượt là 5 µg/kg, và 15 µg/kg. Hiệu suất thu hồi của phương pháp đạt từ 100,54 % đến 101,68 %. Sử dụng mẫu chuẩn chứng nhận ERM-CE-464 để xác định độ đúng của phương pháp với độ chệch là 1,4 %. Độ không đảm bảo đo của phương pháp là 15 %. Kỹ thuật pha loãng đồng vị (cụ thể sử dụng 201Hg-CH3+), được dùng để định lượng Methyl thủy ngân trong mẫu chuẩn chứng nhận SRM 2976 và ERM-CE-464. Kết quả không có sự sai biệt đáng kể giữa hai phương pháp LC-ICP-MS và ID-LC-ICP-MS (28,80 µg/kg và 29,03 µg/kg đối với mẫu SRM 2976; 5544 µg/kg và 5582 µg/kg đối với mẫu ERM-CE-464). Kết luận: Phương pháp xác định hàm lượng Methyl thủy ngân trong cá bằng LC-ICP-MS với độ đúng, độ chính xác cao; tiết kiệm chi phí và hóa chất. Do đó, phương pháp này cung cấp kết quả đáng tin cậy trong việc đánh giá hàm lượng Methyl thủy ngân trong cá. Từ khóa: methyl thủy ngân, cá *Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Cù Hoàng Yến ĐT: 0384139754 Email: cuhoangyen@iph.org.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 616 ABSTRACT APPLICATION OF LC-ICP-MS FOR THE ANALYSIS OF METHYLMERCURY IN FISH Tong Le Bao Tram, Cu Hoang Yen, Nguyen Huu Phat * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 615 – 624 Background: As a global contaminant, mercury enters the food chain in both inorganic and organic chemical forms. The most common natural forms of mercury found in the environment are metallic mercury, mercuric sulfide (cinnabar ore), Mercuric Chloride and Methylmercury. Methylmercury is the predominant Mercury species in fish. The USEPA states in an updated Mercury overview paper that in most adult fish, 90– 100% of Mercury content is Methylmercury (USEPA 2001). In order to support the monitoring of seafood quality, it is necessary to have a method to analyse mercury species with high sensitivity, stability, reliability and efficiency. In the present paper, we focused on some crucial points of the analytical procedure of mercury speciation by liquid chromatography - inductively coupled plasma mass spectrometry. Objectives: To research and build a reliable process in determining the content of Methyl mercury in fish. Surveying and optimizing analytical conditions to save costs and chemicals but still ensuring analytical results with high accuracy and reliability. To apply the procedure to the actual sample analysis after validating the method. To apply isotope dilution technique for the method of determination of methyl mercury in fish, to evaluate the effectiveness of the method and giving a new method of isotope dilution technique. Methods: To consult and to synthesize domestic and foreign documents related to research topics to guide the research process; to process the survey and the optimization of equipment using LC - ICP - MS in analyzing methyl mercury; to validate the reliability and accuracy of the process. Results: A method of determination of methyl mercury in fish using liquid chromatography technique coupled with high frequency induction plasma source through spectral connection (LC-ICP-MS) was developed. Quantitative extraction of methyl mercury species was achieved in a 1% (w/v) L-Cysteine solution by sonication for 30 minutes at 50 oC. This solution was separated by using centrifugation and filtered through nylon filter membrane (pore size 0.45 µm). Chromatographic separation of mercury species was carried out on a C18 reverse phase column with 0.1% (w/v) L-Cysteine, 0.1% (w/v) L-Cysteine.HCl.H2O and 5% Methanol as the mobile phase. Method validation included: defining methyl mercury linearity up to 10 µg/kg, the method limit of detection and the method limit of quantitation for fish were 5 µg/kg and 15 µg/kg, respectively. Recoveries ranged from 100.54 % to 101.68 %. The trueness of method was determined by using a certified reference material ERM- CE-464, with good recovery and bias. The measurement uncertainty of the method was 15%. A species-specific isotope dilution analysis approach, using 201CH3Hg+ was employed for the quantification of methyl mercury. Two Certified Reference Materials (SRM 2976, ERM-CE-464) were analysed to assess the analytical performance. No significant differences were found between LC-ICP-MS and ID-LC-ICP-MS for CH3Hg+. Conclusions: Method of determining the content of methyl mercury in fish by LC-ICP-MS was high accurate and precise; saving costs and chemicals. Therefore, this method provides reliable results in assessing the content of methyl mercury in fish. Keywords: methyl mercury, fish ĐẶT VẤN ĐỀ Cá là thức ăn quan trọng của chế độ ăn uống khỏe mạnh. Tuy nhiên, một số loại cá chứa một hàm lượng thuỷ ngân tổng số. Thủy ngân có tính tích lũy và rất độc ngay cả khi tồn tại ở dạng vết. Nó tồn tại ở 3 dạng hóa học: nguyên tố, muối thủy ngân và Methyl thủy ngân, trong đó Methyl thủy ngân có tính độc cao nhất (7). Lượng Methyl thủy ngân tích luỹ trong cơ thể sinh vật cỡ µg/kg, nên việc xác định rất khó khăn. Các Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 617 phương pháp về xác định nguyên dạng ngày nay cho kết quả tách các dạng thủy ngân rất tốt, tuy nhiên việc lựa chọn được phương pháp phù hợp trong từng tình huống là phức tạp bởi những khó khăn về vấn đề thiết bị hay ảnh hưởng của nền mẫu phân tích. Nguyên tắc chung của quá trình phân tích nguyên dạng đó là sự kết nối giữa một hệ thống có nhiệm vụ phân tách như sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí (GC), tiêm dòng chảy, hóa hơi hydride dùng bẫy lạnh, với một hệ thống phân tích tín hiệu đóng vai trò đầu dò (AAS, ICP, MS, MS/MS, ICP/MS). GC và LC đều được sử dụng trong việc phân tích các dạng thủy ngân. Mặc dù sắc ký khí cho khả năng phân giải cao và có thể xác định nhanh nhiều dạng tồn tại hóa học hơn (thủy ngân vô cơ và các dạng alkyl-, aryl- thủy ngân), nhưng phương pháp này đòi hỏi các bước xử lý mẫu phức tạp, gây tốn thời gian, nhiễm bẩn mẫu, mất mẫu hoặc sự chuyển hóa giữa các dạng tồn tại lẫn nhau. Sắc ký lỏng là kỹ thuật được ưa chuộng hơn trong việc tách các dạng tồn tại của thủy ngân vì không cần phải tạo dẫn xuất cho các dạng thủy ngân thành các hợp chất dễ bay hơi trước khi đưa vào cột sắc ký lỏng (4). Khối phổ ghép cặp cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS) ra đời và trở thành một phương pháp phát hiện chọn lọc nguyên tố quan trọng sau quá trình phân tách. Bởi vì ICP-MS có thể dễ dàng kết nối với sắc ký lỏng (LC), nên LC-ICP-MS trở thành một công cụ mạnh trong việc phân tích các dạng của nguyên tố, đặc biệt ứng dụng trong các mẫu sinh học. Bên cạnh đó phương pháp pha loãng đồng vị là một phương pháp mới, xác định trực tiếp, đúng và chính xác nhất trong việc định lượng hàm lượng các nguyên tố. Nguyên cứu này sử dụng chất chuẩn đồng vị giàu 201Hg-Me của hãng sản xuất ISC-Science làm đồng vị được thêm vào và đồng vị 202Hg được chọn để xác định hàm lượng MeHg có trong mẫu nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp và đưa ra hướng phát triển mới của kỹ thuật pha loãng đồng vị. Thủy sản nói chung và cá nói riêng là một trong những ngành hàng xuất khẩu của Việt Nam. Để hỗ trợ cho việc giám sát chất lượng thủy sản, cần phải có một phương pháp phân tích nguyên dạng thủy ngân hữu cơ với độ nhạy, độ ổn định, độ tin cậy cao và hiệu quả. Do vậy, đề tài “Xây dựng quy trình xác định Methyl thủy ngân trong cá bằng phương pháp LC-ICP- MS” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu và xây dựng một quy trình tin cậy trong việc xác định hàm lượng Methyl thủy ngân trong cá. Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện phân tích nhằm tiết kiệm chi phí, hóa chất nhưng vẫn đảm bảo kết quả phân tích có độ chính xác và tin cậy cao. Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau khi xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị vào phương pháp xác định Methyl thủy ngân trong cá, nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp và đưa ra hướng phát triển mới của kỹ thuật pha loãng đồng vị. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thử Mẫu khảo sát quy trình: mẫu thịt cá loại bỏ da và được đánh giá độ đồng nhất theo ISO GUIDE 35, với hàm lượng thủy ngân tổng là (458±10) µg/kg.Mẫu chuẩn đối chứng: mẫu mô sò “SRM 2976” của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Hoa kỳ NIST, hàm lượng MeHg (28,09±0,31) µg/kg và mẫu cá ngừ ký hiệu “ERM–CE464” của Viện đo lường và vật liệu chuẩn IRMM, hàm lượng MeHg (5,50±0,17) mg/kg. Hóa chất Nước cất siêu sạch, loại ion, điện trở ≥ 18 MΩ.L-Cysteine.HCl.H2O, độ tinh khiết ≥99%, khối lượng phân tử 175,64 g/mol. L-Cysteine, độ tinh khiết ≥99%, khối lượng phân tử 121,16 g/mol. Acid Nitric HNO3 đậm đặc 65% (w/w). Acid Chlohydric HCl đậm đặc 37% (w/w). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 618 Hydrogen Peroxide H2O2 30%. Dung dịch ly trích L-Cysteine.HCl.H2O 0,3%; 0,5%; 0,7%; 1%; 1,3% (w/v). Dung dịch L-Cysteine.HCl.H2O 10% (w/v) dùng pha chuẩn. Pha động: L-Cysteine:L- Cysteine.HCl.H2O với các nồng độ 0,05%:0,05%; 0,1%:0,1%; 0,2%:0,2%; 0,5%:0,5%. Chất chuẩn Chuẩn CH3HgCl tinh thể, độ tinh khiết ≥95%, khối lượng phân tử 251,08 g/mol. Chuẩn HgCl2 tinh thể, độ tinh khiết ≥99,5%, khối lượng phân tử 271,50 g/mol. Chuẩn đồng vị giàu 201Hg- MeHg, hãng sản xuất ISC-Science, nồng độ (5,44 ± 0,05) µg/g. Dung dịch chuẩn gốc CH3HgCl trong nước khử ion, có thể chứa ≤20% methanol (v/v), nồng độ Hg 1000 mg/L, dung dịch được thanh lý khi hàm lượng Hg vô cơ >3% tính trên hàm lượng CH3HgCl lý thuyết, thao tác trong tủ hút. Dung dịch chuẩn gốc Hg vô cơ–HgCl2 trong HCl 0,1% (v/v), nồng độ Hg 2000 mg/L. Dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian, Hg trong CH3HgCl 1000 µg/L và Hg trong HgCl2 1000 µg/L trong L-Cysteine.HCl.H2O 0,02% (w/v). Đường chuẩn làm việc (0–10 µg/L) được pha trong L-Cysteine.HCl.H2O 1% (w/v). Các dung dịch chuẩn được pha hàng ngày và đựng trong chai thủy tinh tối màu. Dụng cụ Bình định mức 10 mL, 20 mL, 50 mL; micropippete 0,1–1mL, 20–200 µL; ống ly tâm 50 mL; đầu lọc (filter) 0,45 µm 30 mm; xy lanh 3 mL; lọ chứa mẫu nâu 2 mL. Thiết bị Hệ thống máy plasma cao tần ghép nối khối phổ (ICP/MS): có khả năng quét khối (m/z): 5– 240 amu, độ phân giải 0,9 amu tại 10% chiều cao peak; kết nối hệ thống sắc ký lỏng (LC): cột phân tích C18, 5 µm, 150 x 4,6 mm, cột bảo vệ C18, 5 µm, bơm 4 kênh, bộ tiêm mẫu tự động, vòng tiêm mẫu (loop) 100 µL; cân phân tích có độ chính xác 1 mg; máy xay mẫu 10000 vòng/phút; máy ly tâm 6000 vòng/phút; máy vortex (tốc độ tối đa 2500 vòng/phút); bể điều nhiệt 60±4oC; bể siêu âm có gia nhiệt; hệ thống lò phá mẫu vi sóng; máy lọc nước siêu sạch; tủ hút khí độc. Tối ưu chương trình vận hành thiết bị ICP–MS Sử dụng dung dịch hiệu chỉnh (set up solution) chứa hỗn hợp 1 µg/L của Be, Ce, In, Mg, U trong dung dịch HNO3 1% với dòng pha động sẽ được ghép vào chung với dòng hút dung dịch hiệu chỉnh trong suốt quá trình hiệu chỉnh nhằm tối ưu độ nhạy, độ phân giải và chuẩn hóa số khối, tối ưu tốc độ dòng khí Ar phun sương Sử dụng dung dịch chuẩn MeHg 5 µg/L làm dung dịch để khảo sát. Chọn công suất cho tín hiệu cường độ Hg tối ưu nhất để tối ưu công suất bộ phát sóng cao tần Tối ưu điều kiện vận hành sắc ký lỏng Tối ưu nồng độ pha động L-cysteine & L- cysteine.HCl.H2O (0,05%; 0,10%; 0,20%; 0,50%), thành phần pha động (L-cysteine+L-cysteine.HCl.H2O; L-cysteine+L-cysteine.HCl.H2O+Methanol- 1%, 2%, 3%, 4%, 5% (v/v)) thông qua yếu tố đánh giá là thời gian lưu của MeHg và độ phân giải giữa Hg vô cơ và MeHg. Tối ưu quy trình xử lý mẫu Thông qua tối ưu nồng độ dung môi ly trích, L-cysteine.HCl.H2O (0,5%, 1%, 2%, 3%, 4 %), Thời gian ly trích (10, 20, 30, 40, 50 phút). Nhiệt độ ly trích (30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC). Đánh giá bằng hàm lượng MeHg được ly trích ra từ mẫu cá khảo sát quy trình Xác định các thông số của phương pháp Tiến hành dựng đường chuẩn trong khoảng 0÷10g/L để khảo sát độ tuyến tính: dựng đường chuẩn của Hg2+, MeHg trên nền dịch ly trích từ mẫu cá không chứa thủy ngân (mẫu trắng) nhằm loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến tín hiệu đo, đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số hồi quy tuyến tính thoả yêu cầu 0,99 ≤ R2 ≤ 1. Để xác định độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp, chúng tôi phân tích lặp lại 06 lần dung môi chiết mẫu và 06 lần mẫu ERM CE464, độ chọn lọc của phương pháp đáp ứng yêu cầu khi sắc ký đồ của dung môi chiết không tồn tại Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 619 peak i-Hg và MeHg, còn sắc ký đồ của mẫu chuẩn thì có 2 peak này. Giá trị giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn định lượng (MLOQ) được khảo sát dựa trên thực hiện thí nghiệm và tính toán theo hệ số R trên nền mẫu SRM 2976. Giá trị MLOD, MLOQ được xác định: 2(C ) 1 i CSD n     MLOD = 3 × SD, MLOQ = 3 × MLOD R= . Với Ci là nồng độ MeHg phân tích được trong mẫu SRM 2976. Nếu 4 < R <10: giá trị MLOD phù hợp và đáng tin cậy. Khẳng định lại MLOQ bằng cách phân tích mẫu thêm chuẩn ở hàm lượng MLOQ tính toán vào nền mẫu cá không có thủy ngân. Độ đúng được xác định thông qua phân tích vật liệu chuẩn, kết quả đo phải nằm trong khoảng dao động cho phép được công bố của nhà sản xuất: mẫu ERM - CE464: hàm lượng MeHg là (5,50 ± 0,17) mg/kg và mẫu SRM 2976: hàm lượng MeHg là (28,09 ± 0,31) µg/kg. Khảo sát độ lặp lại, tiến hành phân tích 10 lần mẫu trong cùng một ngày thực nghiệm. Để tính độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm, tiến hành phân tích 10 lần mẫu bởi nhân viên thử nghiệm khác vào một thời điểm thử nghiệm khác. Độ không đảm bảo đo của phương pháp được tính dựa trên số liệu định trị phương pháp. Chúng tôi sử dụng tài liệu Appendix F, trang 9 AOAC 2016 và CAC/GL 54-2004 làm tiêu chí đánh giá các thông số định trị phương pháp(2,5). Phương pháp pha loãng đồng vị Dùng kỹ thuật pha loãng đồng vị để xác nhận lại độ tin cậy của phương pháp đã được tối ưu ở trên. Các bước tiến hành cụ thể như sau: cân mẫu ERM – CE 464 và mẫu SRM 2976 với khối lượng cân thích hợp vào ống ly tâm 50 mL, thêm chuẩn đồng vị MeHg giàu 201Hg với nồng độ thích hợp, tiến hành quy trình ly trích mẫu đã được tối ưu trước đó, đo mẫu và tính toán kết quả. Dùng phép kiểm t-test để đáng giá sự đồng nhất của 2 phương pháp. Phân tích mẫu thực Sau khi hoàn tất các thí nghiệm thẩm định giá trị sử dụng, tiến hành áp dụng phương pháp vào phân tích 20 mẫu cá gồm cá kiếm, cá ngừ các loại, cá lao không vảy, mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần. KẾT QUẢ Tối ưu chương trình vận hành thiết bị ICP–MS Công suất của máy phát cao tần RF là 1100W. Tốc độ dòng khí mang Argon là 0,86 L/phút. Độ nhạy, độ phân giải và chuẩn hóa số khối được trình bày ở Bảng 1. Tối ưu điều kiện vận hành sắc ký lỏng Nồng độ pha động Nồng độ pha động là L-Cysteine 0,1 % và L- Cysteine.HCl.H2O 0,1 % là nồng độ tối ưu (Hình 1 và Hình 2). Thành phần pha động Hàm lượng Methanol ở mức 5% là điều kiện tối ưu, đáp ứng được các yêu cầu: độ nhạy tăng, thời gian rửa giải nhanh nhưng vẫn duy trì độ phân tách tốt (Hình 3 và Hình 4). Bảng 1. Độ nhạy, độ chính xác khối và độ phân giải sau khi tối ưu Chất phân tích Độ nhạy (cps) Độ chính xác khối Độ phân giải Kết quả Yêu cầu Kết quả Yêu cầu Kết quả Yêu cầu 9 Be 10792 >3000 7,025 7,016±0,05 0,691 0,7±0,03 24 Mg 40120 >15000 23,985 24,025±0,05 0,673 0,7±0,03 115 In 136010 >50000 114,875 114,904±0,05 0,728 0,7±0,03 238 U 99973 >40000 238,025 238,050±0,05 0,708 0,7±0,03 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 620 Hình 1: Ảnh hưởng của nồng độ pha động đến thời gian lưu và diện tích peak của i-Hg Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ pha động đến thời gian lưu và diện tích peak của MeHg Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ Methanol đến thời gian lưu và diện tích peak của i-Hg Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ Methanol đến thời gian lưu và diện tích peak của MeHg Điều kiện tối ưu vận hành thiết bị Bảng 2. Điều kiện vận hành thiết bị tối ưu Điều kiện ICP/MS Điều kiện LC Công suất RF 1100 W Tốc độ dòng pha động 1 mL/phút Tốc độ dòng khí Ar tạo Plasma 17 L/phút Thể tích tiêm 50 µL Tốc độ dòng khí Ar phụ trợ 1,2 L/phút Thành phần pha động L-Cysteine 0,1% (w/v) + L-Cysteine.HCl.H2O 0,1% (w/v) + CH3OH 5%(v/v) Tốc độ khí Ar phun sương 0,86 L/phút Thời gian lấy tín hiệu 800 ms Khối lượng /điện tích 202 Chế độ chạy Standard Tối ưu quy trình xử lý mẫu Nồng độ dung môi trích ly Nồng độ L-Cysteine.HCl.H2O là 1% là nồng độ tối ưu (Hình 5). Thời gian ly trích Thời gian ly trích tối ưu là 30 phút (Hình 6). Nhiệt độ ly trích 50oC là điều kiện nhiệt độ tối ưu để ly trích MeHg ra khỏi nền mẫu cá (Hình 7). Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ L-Cysteine.HCl.H2O đến khả năng ly trích dạng MeHg trong mẫu cá Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 621 Hình 6. Ảnh hưởng thời gian ly trích đến hàm lượng MeHg trong mẫu khảo sát quy trình Hình7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng MeHg trong mẫu khảo sát quy trình Quy trình ly trích MeHg từ mẫu cá Cân 0,5 g mẫu cá vào ống thủy tinh Pyrex, thêm 10 mL L-Cysteine.HCl.H2O 1%,lắc mạnh. Đánh siêu âm 30 phút ở 50oC. Để nguội ở nhiệt độ phòng, định mức 50 mL. Ly tâm 5 phút, tốc độ 4500 vòng/phút. Lọc qua màng (0,45 µm) và đo sau khi lọc. Xác định các thông số của phương pháp Độ đặc hiệu/chọn lọc: Sau khi chạy mẫu trắng, chuẩn, mẫu CRM ERM464cho sắc ký đồ như Hình 8. Mẫu trắng không xuất hiện peak tại vị trí peak của chuẩn i-Hg và MeHg, mẫu CRM và chuẩn 1 µg/L có xuất hiện 2 peak (i-Hg và MeHg) như công bố của nhà sản xuất (Bảng 3). Phương pháp pha loãng đồng vị Kết quả đánh giá từ phép t-test của phương pháp pha loãng đồng vị và phương pháp xây dựng được trình bày ở Bảng 4. Hình 3. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu ERM-CE464, chuẩn i-Hg và MeHg 1 µg/L Bảng 2. Các thông số của quá trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Thông số Kết quả Thông số Kết quả Đường chuẩn – Khoảng tuyến tính 0,2–10 µg/L, R 2 =0,9999 Hiệu suất thu hồi 100,5–101,7% MLOD/ MLOQ (µg/kg) 5/15 Độ chệch (tính theo mẫu ERM464) 1,4% Độ lặp lại/ Độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (%) 4,9 %/7,2 % Độ không đảm bảo đo 15 % Bảng 4. So sánh kết quả phân tích hàm lượng MeHg trong mẫu chuẩn chứng nhận bằng LC-ICP-MS và ID-LC- ICP-MS Mẫu Giá trị chứng nhận LC-ICP-MS (µg/kg) ID-LC-ICP-MS (µg/kg) t - test t LT t TN p SRM 2976 28,09 ± 0,31 28,8 29,0 2,77 0,49 0,64 ERM-CE-464 500 ± 170 5544 5582 2,77 0,43 0,69 Phân tích mẫu thực Kết quả phân tích 20 mẫu cá trên thị trường cho thấy, hàm lượng MeHg có trong mẫu dao động từ 22,31 µg/kg đến 476,75 µg/kg, tùy từng loại cá (cá kiếm: 376,8-476,8 µg/kg; cá ngừ mắt to: 221,8-252,9 µg/kg; cá ngừ vây vàng: 304,8-357,0 µg/kg; cá lao không vảy: 88,8-201,9 µg/kg; cá ngừ chấm: 37,6-97,8 µg/kg; cá ngừ chú: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 622 19,3-102,3 µg/kg; cá ngừ bò: 22,3-29,8 µg/kg). BÀN LUẬN Tối ưu chương trình vận hành thiết bị ICP–MS Công suất của máy phát cao tần RF tối ưu là1100W cho cường độ tín hiệu của thủy ngân cao nhất. Khi công suất máy phát cao tần tăng thì tín hiệu Hg tăng nhưng đến một ngưỡng mà công suất tiếp tục tăng thì tín hiệu giảm. Việc thay đổi công suất làm cho nhiệt độ từng vùng trong plasma cũng thay đổi, ảnh hưởng đến độ nhạy của thủy ngân. Bên cạnh đó, do thủy ngân rất dễ bay hơi ngay cả khi ở nhiệt độ thường. Khi nhiệt độ tăng quá cao, thời gian thủy ngân tồn tại trong vùng plasma ngắn hơn, khó đến được sampler cone hơn do đó sẽ làm giảm độ nhạy. Tốc độ dòng khí mang Argon là 0,86 L/phút cho tín hiệu thu được tối ưu với CeO (156)/Ce (140) là 2288,18/97286,81=0,0234 thỏa điều kiện ≤0,25–3% và tín hiệu (cps) của In 115=1438834,56, thỏa điều kiện của nhà sản xuất. Độ nhạy, độ phân giải và chuẩn hóa số khối thông qua quá trình hiệu chỉnh đạt yêu cầu của nhà sản xuất. Tối ưu điều kiện vận hành sắc ký lỏng Nồng độ pha động Khi thay đổi nồng độ của pha động trong khoảng từ 0,05% đến 0,5%, thời gian lưu và diện tích peak của 2 dạng thủy ngân i-Hg và MeHg đều không thay đổi nhiều. Hơn nữa, hệ số phân giải Rs ở tất cả các trường hợp đều lớn hơn 2, chứng tỏ các peak đều tách tốt, không ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ của pha động. Như vậy có thể kết luận rằng nồng độ của pha động không ảnh hưởng đến khả năng tách cách chất phân tích. Do đó chọn nồng độ pha động là L-Cysteine 0,1% và L- Cysteine.HCl.H2O 0,1% là nồng độ tối ưu, và dùng cho các khảo sát tiếp theo. Thành phần pha động Hàm lượng methanol tăng sẽ làm giảm đáng kể thời gian lưu của MeHg và cũng có ảnh hưởng đến dạng Hg2+ phân cực hơn. Do đó có thể kết luận rằng, ngoài tương tác cation, tương tác pha động giữa phần polymer trên cột và hợp chất thủy ngân không phân cực cũng diễn ra. Hình dạng peak của cả 2 dạng i-Hg và MeHg đều được cải thiện khi thêm Methanol và đặc biệt, độ nhạy của ICP-MS tăng lên khi tăng hàm lượng methanol. Tuy nhiên, khi tăng hơn 5% lượng methanol, plasma không duy trì được. Nguyên nhân là do lượng carbon được đưa vào plasma khá nhiều. Khi đó, carbon trong plasma sẽ hấp thu năng lượng, làm giảm khả năng ion hóa của plasma, do đó làm suy giảm độ nhạy. Áp suất hơi hữu cơ cao gây khó khăn cho việc duy trì plasma. Điều kiện tối ưu vận hành thiết bị Sau khi tối ưu các điều kiện vận hành thiết bị LC-ICP-MS, tiến hành chạy chuẩn hỗn hợp gồm Hg2+ 1 µg/L và CH3Hg+ 1 µg/L, thu được sắc ký đồ theo Hình 8 (các mũi Hg2+ 1 µg/L và CH3Hg+ 1 µg/L tách tốt). Tối ưu quy trình xử lý mẫu Nồng độ dung môi trích ly Ở nồng độ 0,5% của dung môi ly trích, lượng MeHg trong mẫu khảo sát quy trình thấp hơn so với các giá trị nồng độ còn lại (389,05 µg/kg), điều này chứng tỏ lượng L-Cysteine.HCl.H2O chưa đủ để ly trích hết dạng MeHg ra khỏi nền mẫu cá. Khi tăng hàm lượng dung môi ly trích lên 1%, 2%, 3%, 4%, kết quả phân tích lượng MeHg trong mẫu lần lượt là 475,92 µg/kg, 478,85 µg/kg, 474,51 µg/kg, 477,18 µg/kg. Như vậy hàm lượng dung môi ly trích từ 1% đến 4% cho hiệu suất ly trích không sai khác đáng kể và MeHg có trong mẫu khảo sát quy trình hầu như được ly trích hết ra khỏi nền mẫu. Chọn nồng độ L- Cysteine.HCl.H2O là 1% là nồng độ tối ưu vì vừa tiết kiệm hóa chất, vừa đảm bảo hiệu suất ly trích tốt. Thời gian ly trích Thời gian ly trích 30 phút trong bể siêu âm sẽ giúp ly trích hoàn toàn các dạng thủy ngân ra khỏi nền mẫu cá. Khi tăng thời gian ly trích, hàm lượng MeHg vẫn không thay đổi. Do đó, chọn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 623 thời gian ly trích tối ưu là 30 phút cho các khảo sát tiếp theo. Nhiệt độ ly trích Ở nhiệt độ 30oC, hàm lượng MeHg được ly trích ra còn thấp. Lượng MeHg tăng khi nhiệt độ tăng từ 40oC, 50oC và 60oC. Nhưng khi tăng đến 70oC, hàm lượng thủy ngân lại giảm. Như vậy, chọn 50oC là điều kiện nhiệt độ tối ưu để ly trích MeHg ra khỏi nền mẫu cá. Xác định các thông số của phương pháp Kết quả từ Bảng 3 cho thấy các thông số đều đạt tiêu chí theo hai tài liệu Appendix F, trang 9 AOAC 2016 và CAC/GL 54-2004(1,2,5). Phương pháp pha loãng đồng vị Kết quả đánh giá từ phép t-test cho thấy, giá trị t thực nghiệm nhỏ hơn giá trị t lý thuyết. Giá trị p >0,05 nên chênh lệch giá trị trung bình của 2 phương pháp (phương pháp xây dựng và pha loãng đồng vị) không có ý nghĩa do xảy ra ngẫu nhiên, nói cách khác là kết quả phân tích MeHg của 2 phương pháp này không sai khác nhau đáng kể về mặt thống kê. Phân tích thủy ngân nguyên dạng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nền mẫu và phương pháp phân tích. Các quá trình ly trích tách hoặc tạo dẫn xuất có thể gây ra phản ứng methyl hóa và de-methyl hóa giữa các dạng thủy ngân, làm chúng không còn tồn tại ở dạng như ban đầu, gây khó khăn cho việc xác định chính xác hàm lượng thủy ngân nguyên dạng. Do thời gian có hạn nên đề tài này chưa nghiên cứu đến sự chuyển hóa giữa các dạng thủy ngân trong quy trình phân tích mẫu cá. Phân tích mẫu thực Tất cả các kết quả đều dưới giới hạn cho phép của Quy chuẩn Việt Nam(3), trong đó, cá kiếm là loại cá có hàm lượng MeHg cao hơn hết. Cá kiếm là một loài cá lớn, có thời gian sống lâu, vì vậy chúng có thời gian tích lũy MeHg nhiều hơn, hàm lượng MeHg có trong chúng cũng cao hơn so với các loài cá cỡ nhỏ khác. Kết quả trong đề tài này cũng có sự tương đồng với một số nghiên cứu trên thế giới như Alfredo Montero-Alvareza(1) và Susan C. Hight(9). Alfredo Montero-Alvareza và các cộng sự xác định hàm lượng MeHg trong 12 loại cá trên thị trường ở khu vực Cuba và chỉ ra rằng, hàm lượng MeHg có trong cá kiếm là cao hơn các loài cá khác, khoảng từ 180 µg/kg đến 604 µg/kg. Tương tự, Susan C Hight và các cộng sự đã xác định được hàm lượng MeHg có trong mẫu cá kiếm ở Đài Loan khoảng 193 µg/kg đến 474 µg/kg. Giá trị này khá tương đồng với kết quả của đề tài. KẾT LUẬN Đề tài này đã đưa ra một phương pháp xác định hàm lượng MeHg trong cá bằng LC- ICP- MS với độ đúng, độ chính xác cao, và do đó cung cấp kết quả đáng tin cậy trong việc đánh giá hàm lượng MeHg trong cá với giới hạn phát hiện (LOD) là 5 ng/g, giới hạn định lượng (LOQ) là 15 ng/g, hiệu suất thu hồi đạt từ 100,5–101,7%, độ lặp lại là 4,9%, độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm là 7,2% và độ không đảm bảo đo là 15 % trên nền mẫu cá. Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị để xác định hàm lượng MeHg có trong 2 mẫu SRM 2976 và ERM-CE-464. Kết quả phân tích không có sự sai lệch đáng kể so với giá trị đã được chứng nhận. Đề tài này chỉ mới áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị cơ bản để xác định hàm lượng MeHg có trong mẫu chuẩn chứng nhận, chưa tính đến các nguồn gây ra sai số cũng như chưa áp dụng kỹ thuật này lên mẫu thật. Để có thể ứng dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị đạt kết quả chính xác nhất, cần nghiên cứu thêm các yếu tố gây ra sai số như sau: sự nhiễm bẩn trong quá trình lấy mẫu, hàm lượng ẩm có trong mẫu, dẫn đến sự sai khác giữa tỉ lệ các dạng đồng vị trên lý thuyết và trong mẫu thực tế; nhiễu nền, nhiễu do cùng số khối gây ra sự thay đổi cường độ tín hiệu của các đồng vị; ứng dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị trên mẫu cá ngoài thị trường; mở rộng phạm vi áp dụng với các nền mẫu thủy hải sản khác nhau. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 624 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alfredo MA, María FC, Alfredo SM (2013). Mercury speciation in Cuban commercial edible fish by HPLC-ICP-MS using the double spike isotope dilution analysis strategy. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 94:36-47. 2. AOAC Official Methods of Analysis (2016). Guidelines for Standard Method Performance Requirements. Appendix F: p.9, AOAC International, Rockville, USA. 3. Bộ Y Tế (2011). Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm. QCVN 8-2:2011/BYT, Hà Nội. 4. Bruno LB, Jairo R, Samuel S, Vanessa OS, Fernando B (2011). Mercury speciation in seafood samples by LC–ICP-MS with a rapid ultrasound-assisted extraction procedure: Application to the determination of mercury in Brazilian seafood samples. Food Chemistry, 126:2000 - 2004. 5. Codex Alimentarius Commission (2011). Guidelines on measurement uncertainty - CAC/GL54-2004. The Food and Agriculture Organization of the United Nations. 6. Koplík R, Klimešová I, Mališová K, Mestek O (2014). Determination of mercury species in foodstuffs using LC-ICP- MS: the applicability and limitations of the method. Czech J Food Sci, 32:249–259. 7. Nguyễn Thuần Anh (2011). Hàm lượng thủy ngân trong các loài hải sản được tiêu dùng phổ biến ở Nha Trang. Tạp chí Khoa học và Phát triển, pp.937 - 941. 8. Ong K, Lim L, Ghanthimathi S, Ibrahim N, Nasir Z (2013). Determination of Methylmercury in Fish Samples with HPLC- ICP-MS. From Sources to Solution, doi: 10.1007/978-981-4560-70- 2_68. Springer Science & Business Media Singapore. 9. Susan CH, John C (2006). Determination of methyl mercury and estimation of total mercury in seafood using high performance liquid chromatography (LC) and inductively coupled plasma- mass spectrometry (ICP-MS): Method development and validation. Analytica Chimica Acta, 576:160 – 172. Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019