Xây dựng quy trình xác định asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC – ICP/MS

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 381 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ASEN VÔ CƠ TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – ICP/MS Nguyễn Hữu Phát*, Cù Hoàng Yến* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Asen tồn tại trong tự nhiên ở dạng Asen hữu cơ và Asen vô cơ (iAs), dạng Asen vô cơ có độc tính cao hơn dạng Asen hữu cơ. Thủy hải sản là một nguồn tích tụ Asen sinh học, hàm lượng Asen tổng trong các sinh vật của thủy quyển luôn cao hơn nhiều so với các loài động vật trên đất liền, việc đánh giá chất lượng thủy hải sản thông qua hàm lượng Asen tổng là không chính xác. Để đánh giá chính xác chất lượng thủy hải sản, việc xác định các dạng tồn tại khác nhau của Asen là rất cần thiết, hiện nay kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma (LC-ICP/MS) là lựa chọn hàng đầu với những ưu điểm như lượng mẫu ít, độ chọn lọc và độ nhạy cao. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát quá trình tách và định lượng Asen vô cơ ra khỏi các dạng Asen hữu cơ trong cá nước ngọt và nước mặn bằng cột trao đổi anion trên hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma. Kết quả nghiên cứu: Quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS có giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn định lượng (MLOQ) là 15 ng/g và 50 ng/g. Độ lặp lại của phương pháp ở 3 nồng độ iAs 50, 1000 và 2000 ng/g có RSD < 15%, hiệu suất thu hồi ở nồng độ tương ứng dao động từ 97,9-99,1% và độ không đảm bảo đo của phương pháp là 11%. Kết luận: Phương pháp sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma sử dụng cột trao đổi anion là phương pháp phân tích chính xác để định lượng Asen vô cơ trên nền mẫu cá. Từ khóa: Asen vô cơ, cá, LC-ICP/MS. ABSTRACT DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE DETERMINATION OF INORGANIC ARSENIC IN FISH Nguyen Huu Phat, Cu Hoang Yen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 381 - 386 Background: Arsenic is usually divided into two main groups: organic arsenic form and inorganic arsenic form (iAs) in natural environment. The inorganic forms of arsenic are more toxic than organic form. Arsenic does bio accumulate in seafood. Total arsenic level of organisms in the hydrosphere are always higher than land- animals. Quality evaluation of aquatic products through total arsenic levels are inaccuracy. Recently, HPLC followed by detection using ICP-MS allows low sample volume injection, with high selectivity and high sensitivity. Objectives: Establishment of a new method for determination of inorganic arsenic in fish by LC-ICP-MS. Methods: Survey of separation and quantification inorganic arsenic species are conducted by anion exchange liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry. Results: The limits of determination (MLOD) and the limits of quantitation (MLOQ) for iAs in fish were 15ng/g and 50ng/g respectively. At three fortification levels (50 – 1000 – 2000 ng/g), the overall recoveries range from 97.9 to 99.1% with RSD values less than 15%. * Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Hữu Phát ĐT: 0969241883 Email: huuphatk@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 382 Conclusion: Anion exchange liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry was accurate analytical method for quantitation of inorganic arsenic in fish samples. Keywords: inorganic Arsenic, fish, LC-ICP/MS. ĐẶT VẤN ĐỀ: Thủy hải sản là một nguồn tích tụ Asen sinh học vô cùng lớn trong tự nhiên, hàm lượng Asen tổng trong các sinh vật của thủy quyển luôn cao hơn nhiều so với các loài động vật trên đất liền. Tuy nhiên, quá trình chuyển hóa của Asen trong thủy quyển thường tạo hợp chất Asenbetoine, một dạng Asen hữu cơ rất bền và độc tính thấp(3). Trong các loài tôm và cá, hàm lượng Asen vô cơ thường thấp hơn 0,1 % trong tổng số Asen có trong sinh vật. DMA (dimethylarsinic acid) và MMA (monomethylarsonic acid, monomethylarsonous acid) cũng tồn tại ở lượng rất thấp trong thủy hải sản, một số loài như cá ngừ thường không tích tụ DMA, MMA trong cơ thể(2). Như vậy, việc đánh giá chất lượng của mặt hàng thủy hải sản thông qua hàm lượng Asen tổng là không chính xác. Các kết quả phân tích khi được công bố sẽ gây ảnh hưởng không nhỏ đến nhà sản xuất cũng như gây bất an trong dư luận. Hiện nay kỹ thuật LC-ICP/MS là lựa chọn hàng đầu cho các ứng dụng phân tích các dạng tồn tại khác nhau của Asen. Kỹ thuật này có những ưu điểm như lượng mẫu ít, độ nhạy cao(4). Hai dạng sắc ký lỏng thường dùng trong phân tích nguyên dạng Asen là sắc ký ghép cặp ion và sắc ký trao đổi ion (trao đổi anion và cation). Tuy nhiên, để phân tích nguyên dạng Asen vô cơ (tồn tại dạng anion trong môi trường trung tính và kiềm), phương pháp sắc ký trao đổi anion đã được các nhà khoa học trên thế giới lựa chọn nghiên cứu như tác giả LAsen – 2005(5), Sang-Ho Nam – 2006(6), Georg Raber – 2012(7), Rasmussen – 2012(8) cũng như được dùng trong các phương pháp được đề xuất bởi cơ quan kiểm soát chất lượng thực phẩm Hoa Kỳ (FDA – EAM 4-11) cùng với các hãng thiết bị LC-ICP/MS (Agilent, PerkinElmer). Nhằm phục vụ công tác đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, cụ thể là kiểm soát hàm lượng Asen vô cơ trong các sản phẩm cá, chúng tôi tiến hành thực hiện xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC- ICP/MS trên cột trao đổi anion. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Quy trình xác định Asen vô cơ trên nền mẫu cá nước ngọt và cá nước mặn bằng thiết bị sắc ký lỏng kết nối quang phổ ghép cặp plama đầu dò khối phổ. Phương pháp nghiên cứu Thiết bị Cân phân tích (độ nhạy 0,1 mg), máy xử lý mẫu vi sóng ETHOS-1, máy vortex, cột sắc ký PRP-X100 (150mm × 4,1 mm (id), anion exchange – HAMILTON), hệ thống LC- ICP/MS AGILENT 7700x. Hóa chất Nước cất siêu sạch — 18 MΩ; Ammonium hydroxide suprapur (NH4OH 25%), Hydrochloric acid (HCl 37%), Nitric acid (HNO3 65%), Hydrogen peroxide (H2O2 30%), Ammonium carbonate ((NH4)2CO3), Asenate Stock Standard (As(V)) 1000 mg/L MERCK, Asenite Stock Standard (As(III)) 1000 mg/L INORGANIC VENTURE, Dimethylarsinic acid (DMA), Disodium methyl arsonate hexahydrate (monomethylarsonic acid, MMA), Asenobetaine (AsB) SIGMA ALDRICH. Điều kiện sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma (LC-ICP/MS): Sử dụng thiết bị LC-ICP/MS với kỹ thuật sắc ký trao đổi anion trong môi trường pH 8,5 để Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 383 tách dạng Asen (V) ra khỏi các dạng Asen hữu cơ. Các thông số cụ thể được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Điều kiện vận hành thiết bị LC-ICP/MS ICP/MS LC Năng lượng 1500 W Pha động 30 mM (NH4)2CO3 Dòng Argon tạo plasma 15 L/phút pH 8,50 (± 0,05) Khí phụ trợ 1,0 L/phút Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Khí mang Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune Thể tích tiêm 100 µL Kiểu phun sương Glass concentric Loại khí Có Độ sâu torch Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune Nhiệt độ cột Nhiệt độ phòng Tốc độ bơm 0,3 vòng/phút (~1 mL/phút) Loại cột 150mm×4,1 mm (id) Hamilton PRP-X100 anion exchange Nhiệt độ buồng phun sương 2°C Bộ va chạm Không sử dụng nhằm tăng tín hiệu Khối ion m/z 75 Thời gian lấy tín hiệu 10 phút Thời gian lấy tín hiệu 0,8 s (m/z 75) Xử lý mẫu Asen trong mẫu cá được chiết khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp dịch chiết (HCl 0,06 M – 3% H2O2) trong lò vi sóng 25 phút ở nhiệt độ 900C. Sau đó mẫu được ly tâm 10 phút với tốc độ 4500 vòng/phút, lọc qua màng lọc 0,45 µL và pha loãng với tỉ lệ 1: 1 bằng (NH4)2CO3 60mM(8). Xác định các thông số của phương pháp (a) Độ chọn lọc của phương pháp LC- ICP/MS được xác định dựa trên số khối đặc trưng của Asen và khả năng phân tách trên cột sắc ký. (b) Độ tuyến tính được đánh giá thông qua hệ số tương quan r > 0,997 của phương trình hồi quy của đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ chất phân tích. (c) Giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn định lượng (MLOQ) của phương pháp được thực hiện thí nghiệm và tính toán theo hệ số R với lượng thêm chuẩn 50 ng/g, giá trị MLODđược xác định như sau: 3LOD SD  x R LOD  Nếu 4 < R < 10 thì giá trị MLOD phù hợp và đáng tin cậy, nếu 4 < R thỉ cần thêm chuẩn nồng độ cao hơn và thực hiện lại thí nghiệm, tính toán lại giá trị R, nếu R > 10 thì cần thêm chuẩn nồng độ thấp hơn và thực hiện lại thí nghiệm, tính toán lại giá trị R. (d) Độ chính xác và độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại cùng với độ tái lặp nội bộ (RSD %) và hiệu suất thu hồi H (%) của mẫu thêm chuẩn ở 3 nồng độ: 50 ng/g, 1000 ng/g và 2000 ng/g. Độ lặp lại được thực hiện bởi 1 kiểm nghiệm viên trong khi độ tái lặp nội bộ được thực hiện tương tự với một kiểm nghiệm viên khác. Hệ số RSD (%) phải < 15% và H (%) phải nằm trong khoảng 75 – 125%. (e) Độ không đảm bảo đo được tính toán theo độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm và độ chệch của phương pháp. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều kiện phân tích bằng LC-ICP/MS Sau khi áp dụng các thông số sắc ký lỏng và khối phổ vào phân tích dịch chiết của mẫu cá lóc được thêm chuẩn các dạng Asen: DMA, MMA, AsB, As(III), As(V). Kết quả thu được sắc ký đồ như trong hình 1. Từ sắc ký đồ mẫu thực có thể thấy trong cá tồn tại một lượng đáng kể các dạng Asen hữu cơ không tương tác với cột sắc ký. AsB được dùng như chất đại diện cho tất cả các dạng Asen hữu cơ không có tương tác với cột sắc ký trao đổi anion (dạng Asen hữu cơ dạng cation hoặc trung hòa). Bên cạnh đó, với pha động được lựa chọn, dạng As(V) cần phân tích được tách tốt khỏi các Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 384 dạng Asen khác và thời gian phân tích cho mỗi mẫu tương đối ngắn giúp giảm lượng muối đóng vào gây tắc nghẽn thiết bị. Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu thật và mẫu thêm chuẩn hỗn hợp các dạng Asen Đánh giá khả năng chiết Phân tích mẫu sau khi vô cơ hóa theo AOAC 986.15 (xử lý khô - ướt kết hợp) và chiết theo quy trình của tác giả Rasmussen, kết quả được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả phân tích Asen tổng trong mẫu cá lóc theo bằng phương pháp AOAC 986.15 và phương pháp chiết theo quy trình của tác giả Rasmussen(1,8) Hàm lượng As trung bình (ng/g) 38,3 39,7 Hàm lượng As lớn nhất (ng/g) 48,4 45,7 Hàm lượng As nhỏ nhất (ng/g) 33,2 32,9 %RSD 9,8 10 Công cụ “t-Test: Paired Two Sample for Means” của phần mềm EXCEL – 2010 được sử dụng nhằm so sánh kết quả phân tích hàm lượng Asen tổng trong mẫu cá lóc giữa phương pháp vô cơ hóa theo AOAC 986.15 và phương pháp chiết cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 kết quả (bảng 2), tthực nghiệm ( 1,50) < tlý thuyết (2,07). Như vậy có thể khẳng định rằng dung dịch chiết (HCl 0,06 M – H2O2 3%) đã chiết toàn bộ các dạng Asen ra khỏi nền mẫu trong thời gian 25 phút ở nhiệt độ 90oC. Đánh giá khả năng oxi hóa As (III) Sau khi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 50, 1000 và 2000 ng/g As(III) vào mẫu cá lóc. Hiệu suất oxy hóa As(III) được đánh giá thông qua tỷ lệ nồng độ As(V) có trong dịch chiết và nồng độ As(III) thêm vào ban đầu. Thực hiện phân tích các mẫu thêm chuẩn này và ghi nhận lượng As(V) có trong dịch chiết, kết quả bảng 3. Bảng 3: Khả năng oxi hóa As(III) của dung dịch chiết Nồng độ As (III) thêm vào mẫu(ng/g) 50 1000 2000 Nồng độ As (V) (ng/g) 51,5 1005 1915 %RSD 3,00 4,74 4,58 H% trung bình 103,0 100,4 95,8 H% Min 97,0 94,0 87,3 H% Max 109,0 109,5 102,5 Khảo sát khả năng oxy hóa của dịch chiết cho thấy 95,8% As(III) (ở mức 2000 ng/g) và 100% As(III) (ở mức 50, 1000 ng/g) được oxy hóa thành As(V), các dạng Asen hữu cơ hoàn toàn không bị phân hủy thành As(V) (ở mức 2000 ng/g). Đánh giá độ bền của Asen hữu cơ Asen hữu cơ được thêm vào mẫu sau đó trải qua quá trình xử lý mẫu nhằm đánh giá khả năng bị phân hủy thành As(V) gây sai lệch dương cho kết quả phân tích. Hàm lượng As(V) trong dịch chiết của thí nghiệm càng thấp thì dạng Asen hữu cơ càng bền. Bảng 4: Độ bền của Asen hữu cơ trong dịch chiết STT DMA (ppb) MMA (ppb) AsB (ppb) As(V) (ppb) STT DMA (ppb) MMA (ppb) AsB (ppb) As(V) (ppb) 1 2000 2000 2000 <0,1 11 2000 2000 2000 <0,1 2 2000 2000 2000 <0,1 12 2000 2000 2000 <0,1 3 2000 2000 2000 <0,1 13 2000 2000 2000 <0,1 4 2000 2000 2000 <0,1 14 2000 2000 2000 <0,1 5 2000 2000 2000 <0,1 15 2000 2000 2000 <0,1 6 2000 2000 2000 <0,1 16 2000 2000 2000 <0,1 7 2000 2000 2000 <0,1 17 2000 2000 2000 <0,1 8 2000 2000 2000 <0,1 18 2000 2000 2000 <0,1 9 2000 2000 2000 <0,1 19 2000 2000 2000 <0,1 10 2000 2000 2000 <0,1 20 2000 2000 2000 <0,1 Mẫu cá lóc A Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 385 Kết quả cho thấy các dạng Asen hữu cơ hoàn toàn không bị phân hủy thành As(V) (ở mức 2000 ng/g). Xác định giá trị sử dụng của phương pháp Khoảng tuyến tính Do khoảng tuyến tính của kỹ thuật ICP-MS khá rộng (6 – 9 bậc), hơn nữa khi hàm lượng Asen quá cao sẽ gây nhiễm bẩn hệ thống do đó không thực hiện khảo sát khoảng tuyến tính. Khoảng làm việc được lựa chọn trong khoảng từ 1 ng/g – 10 ng/g. Hình 2: Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak sắc ký As(V) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Sau khi phân tích 40 mẫu, kết quả tính toán cho thấy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp lần lượt là 15 ng/g và 50 ng/g. Do giới hạn cho phép của iAs trong cá là 2000 ng/g, như vậy giới hạn định lượng vừa xác định được hoàn toàn thích hợp cho mục đích kiểm tra chất lượng sản phẩm cá. Độ lặp lại, độ tái lặp, hiệu suất thu hồi, độ không đảm bảo đo Bảng 5 Các thông số thẩm định Nồng độ 50 ng/g 1000 ng/g 2000 ng/g Tiêu chí Nhận xét H% 99,1 98,3 97,9 75 – 115 Đạt RSD% 5,9 7,2 5,0 ≤ 15 Đạt Rw 2,3 2,4 2,0 ≤ 15 Đạt Độ không đảm bảo đo mở rộng U% 11% Thực hiện phân tích các mẫu cá lóc thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ Asen 50, 1000, 2000 ng/g, hiệu suất thu hồi, SD, RSD% và BIAS, kết quả được trình bày trong bảng 5. Phân tích mẫu thực tế Áp dụng quy trình đã thẩm định vào xác định hàm lượng iAs trong 20 mẫu cá (5 loài cá nước ngọt, 5 loài cá nước mặn, mỗi loài 2 mẫu thử). Bảng 6: Kết quả phân tích 10 loại cá Loài cá MSM Kết quả (ng/g) Loài cá MSM Kết quả (ng/g) Lóc NN-1 < 15 Thu NM-1 < 15 NN-2 < 15 NM-2 < 15 Trê NN-3 < 15 Ngừ NM-3 < 15 NN-4 < 15 NM-4 < 50 Ba sa NN-5 < 15 Ngân NM-5 < 15 NN-6 < 15 NM-6 < 50 Diêu hồng NN-7 < 15 Nục NM-7 < 50 NN-8 < 15 NM-8 < 50 Rô NN-9 < 15 Bạc má NM-9 < 50 NN-10 < 15 NM-10 < 50 Kết quả phân tích cho thấy không phát hiện iAs trong các mẫu cá nước ngọt (cá lóc, cá trê, cá basa, cá diêu hồng, cá rô). Đối với cá nước mặn (cá thu, cá ngừ, cá ngân, cá nục, cá bạc má), tất cả các mẫu đều cho thấy có sự hiện diện của iAs nhưng ở dưới khả năng định lượng của phương pháp. Bên cạnh đó, trong tất cả các sắc ký đồ phân tích mẫu cá đều xuất hiện peak tín hiệu của các dạng Asen hữu cơ (dạng ion dương và trung hòa, không tương tác với cột). Như vậy có thể kết luận hàm lượng Asen trong các mẫu cá được khảo sát đa phần là Asen hữu cơ có độc tính thấp. KẾT LUẬN Phương pháp phân tích iAs đã được xác định giá trị sử dụng có giới hạn định lượng khá thấp (50 ng/g) so với mức giới hạn cho phép theo quy định (2000 ng/g), có các thông số độ lặp lại, độ tái lặp, hiệu suất thu hồi đều đạt tiêu chí đề ra. Phương pháp đã được ứng dụng để phân tích mẫu cá nước ngọt và nước mặn tại Tp. Hồ Chí Minh. r = 0,9994 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 386 Tuy nhiên, nhằm nâng cao độ chính xác của phương pháp, có thể nghiên cứu thêm việc áp dụng nội chuẩn trong phân tích iAs bằng cách sử dụng các nguyên tố có tính chất hoặc khối lượng nguyên tử gần với nguyên tố As. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. AOAC International (2012). AOAC 986.15, Arsenic, Cadmium, Lead, Selenium, and zinc in human and pet foods. Multielement method. 2. Arbouine MW, Wilson HK (1992). The effect of seafood consumption on the assessment of occupational exposure to Asenic by urinary Asenic speciation measurements. J Trace Elem Electrolytes Health Dis, 6(3): pp.153-60. 3. Cullen WR, Reimer KJ (1989). Asenic speciation in the environment. Chemical Reviews, 89(4): pp.713-764. 4. Gong Z, Lu X, Ma M, Watt C, Le XC (2002). Asenic speciation analysis, Talanta, 58(1): pp.77-96. 5. Lasen EH, Engman J, Sloth JJ, Hansen M, Jorhem L (2005). Determination of inorganic Asenic in white fish using microwave-assisted alkaline alcoholic sample dissolution and HPLC-ICP-MS, Anal Bioanal Chem, 381(2): pp.339-46. 6. Nam HS, Cheng J (2006). Preliminary results of extraction, separation and quantitation of Asenic species in food and dietary supplements by HPLC-ICP-MS, Korean chemistry society, 27(6): pp.903-908. 7. Raber G, Stock N, Hanel P, Murko M, Navratilova J, Francesconi KA (2012). An improved HPLC–ICPMS method for determining inorganic Asenic in food: Application to rice, wheat and tuna fish, Food Chemistry, 134(1): pp. 524-532. 8. Rasmussen R (2012). Development and validation of an SPE HG-AAS method for determination of inorganic Asenic in samples of marine origin. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 403(10): pp.2825-2834. Ngày nhận bài báo: 16/6/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/7/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016