Xây dựng quy trình kỹ thuật phát hiện đột biến gen KCNJ5 trên bệnh nhân cường Aldosteron nguyên phát do Adenoma tuyến thượng thận

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 84 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KCNJ5 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG ALDOSTERON NGUYÊN PHÁT DO ADENOMA TUYẾN THƯỢNG THẬN Đỗ Đức Minh*, Trần Viết Thắng**, Mai Phương Thảo*** TÓM TẮT Mục tiêu: Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với nguyên nhân chủ yếu là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma). Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát được cho là có liên quan đến đột biến gen KCNJ5. Nghiên cứu này nhằm thiết lập và ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhằm xác định các đột biến của gen KCNJ5 trên quần thể bệnh nhân APA Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: Chúng tôi thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 2 exon 2, 3 và vùng tiếp giáp exon-intron của gen KCNJ5. DNA được tách chiết từ mô tươi bệnh phẩm u tuyến thượng thận của bệnh nhân được chẩn đoán APA. Các mẫu DNA này sau đó được khuếch đại và giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger. Kết quả: Chúng tôi đã khuếch đại thành công được 2 exon 2, 3 và vùng tiếp giáp exon-intron của gen KCNJ5. Kết quả giải trình tự cho thấy đột biến L168R ở 2 trong số 3 bệnh nhân được chẩn đoán APA. Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự DNA phát hiện được đột biến trên gen KCNJ5 từ đó giúp tăng cường hiểu biết về sinh lý bệnh của bệnh lý APA. Từ khóa: cường aldosteron nguyên phát, adenoma tuyến thượng thận, gen KCNJ5, đột biến gen, PCR, giải trình tự DNA ABSTRACT TECHNICAL PROTOCOL TO IDENTIFY KCNJ5 SOMATIC MUTATION IN ADRENAL ALDOSTERONE-PRODUCING ADENOMA Do Duc Minh, Tran Viet Thang, Mai Phuong Thao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 21 - No 2 - 2017: 84 - 89 Objectives: Primary hyperaldosteronism is the most common cause of secondary hypertension and usually the consequence of adrenal aldosterone-producing adenoma (APA). Recently, molecular mechanism of APA has been shown to be associated with mutation in KCNJ5 gene. We conduct this study to set up a DNA sequencing procedure to investigate the mutation of KCNJ5 gene in Vietnamese APA patients. Material - Methods: Primers for amplification of exon 2,3 and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were designed. Genomic DNA was extracted from fresh adrenal tissue of APA patients. These DNA were respectively amplified and sequenced by Sanger technique. Results: The whole coding site and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were successfully amplified. After sequencing, 2 out of 3 patients with APA carry L168R somatic mutation. Conclusion: DNA sequencing can detect somatic mutation in KCNJ5 gene. This information can cast more light in the pathophysiology of APA. *Trung tâm Y sinh học phân tử, **Bộ môn Nội tiết, ***Bộ môn Sinh lý học, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: mdt14284@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Nội Tiết 85 Keywords: primary aldosteronism, adrenal adenoma, KCNJ5 gene, somatic mutation, PCR, DNA sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với tỷ lệ khoảng 6-10% trên tổng số bệnh nhân tăng huyết áp và lên tới 20% ở nhóm bệnh tăng huyết áp kháng trị(4, 7). Nguyên nhân thường gặp của cường aldosterone là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: adrenal aldosterone- producing adenoma) hoặc tăng sản tuyến thượng thận hai bên (bilateral adrenal hyperplasia). Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng và cho đến gần đây, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen KCNJ5 có liên quan mật thiết với nhóm bệnh APA(3). Gene KCNJ5nằm trên nhiễm sắc thể số số 11, mã hóa cho kênh ion Kali Kir 3.4, đột biến gen này làm cho kênh kali bị mất tính chọn lọc, các tế bào vùng cầu của vỏ thượng thận bị khử cực liên tục dẫn đến việc sản xuất quá mức aldosterone(3). Tỷ lệ đột biến gene KCNJ5 trên nhóm bệnh nhân APA thay đổi khá lớn tùy theo chủng tộc, tần suất dao động từ khoảng 40% ở bệnh nhân Châu Âu và lên tới 70% ở nhóm bệnh nhân Nhật Bản và Trung Quốc(1,2,6,8). Việc xây dựng quy trình kỹ thuật xác định đột biến gene KCNJ5 trên nhóm bệnh nhân APA không những giúp làm rõ cơ chế bệnh sinh của bệnh lý này mà còn rất cần thiết cho việc đánh giá và tiên lượng bệnh vì nhóm bệnh nhân có đột biến gen KCNJ5 có khuynh hướng trẻ hơn, có nồng độ aldosterone cao hơn và có cải thiện tim mạch tốt hơn sau điều trị phẫu thuật(6). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến gen KCNJ5 cho 3 bệnh nhân được chẩn đoán adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone. Các bệnh nhân này đều có biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng huyết áp, hạ kali máu, có nồng độ aldosterone máu tăng cao và không bị ức chế khi làm test tải muối, nồng độ renin máu thấp và có khối u thượng thận 1 bên trên phim CT scan. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết Genomic DNA Bệnh phẩm mô tươi khối u tuyến thượng thận được thu nhận từ quá trình phẫu thuật của bệnh nhân. Sau đó mẫu mô tươi được cắt nhỏ và tách chiết DNA bằng bộ kit QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Thiết kế mồi Bảng 1. Các cặp mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự exon 2 và 3 của gen KCNJ5 Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen khuếch đại KCNJ5-2F CCTTCCATCTTGTGTTCTAG Exon 2 và vùng lân cận (1073 bp) KCNJ5-2R TGCCTAAGTCTGAAGTGTAG KCNJ5-3F1 GATGGATAGATGGATGGATG Exon 3 và vùng lân cận (617 bp) KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG KCNJ5-3F2 TGCTGTTTTCAGGAACGGAG Exon 2 và vùng lân cận (1167 bp) KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 86 Gen KCNJ5 bao gồm 3 exon, trong đó exon 1 không tham gia mã hóa protein, vì vậy chúng tôi chỉ tiến hành giải trình tự exon 2, 3 và các vùng lân cận. Các đoạn mồi được thiết kế dựa trên trình tử DNA của gen KCNJ5 mang mã số NG_023406.2 trong kho dữ liệu của NCBI và được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technologies, Hoa Kỳ. Thông tin các đoạn mồi được trình bày như bảng 1. Thực hiện PCR Mỗi tube PCR có thể tích 25 l chứa các thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho mỗi loại), 2 mồi xuôi và ngược (0,5 M cho mỗi loại), 1,25U TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 50-100 ng genomic DNA. Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 3 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 540C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 1,5 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 0,7% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ). Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 0,7%. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm. Thực hiện giải trình tự DNA Sản phẩm PCR đã được tinh sạchsẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing vớiBigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược với các mồi trong Bảng 1. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả giải trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. KẾT QUẢNGHIÊN CỨU Thiết lập kỹ thuật giải trình tự DNA gen KCNJ5 Theo thiết kế ban đầu, 2 cặp mồi KCNJ5- 2F, KCNJ5-2R và KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R sẽ khuếch đại thành công exon 2 và 3 của gene KCNJ5 và vùng intron lân cận. Kết quả là exon 2 được khuếch đại thành công với kích thước sản phẩm PCR như mong đợi, trong khi đó do cặp mồi KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R bắt cặp không đặc hiệu hình thành sản phẩm PCR với kích thước không phù hợp với dự đoán ban đầu (<200bp thay vì phải là 671 bp) (hình 1). Để khắc phục tình trạng này, chúng tôi đã thiết kế lại mồi KCNJ5-3F2 và đã thành công khi khuếch đại được đoạn DNA kích thước phù hợp có chứa exon 3 của gen KCNJ5 (hình 2). Tất cả các cặp mồi đều hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 540C. Các sản phẩm PCR sau đó được tiến hành giải trình tự và cho kết quả hoàn toàn phù hợp với trình tự của gen KCNJ5 mang mã số NG_023406.2 trong kho dữ liệu của NCBI. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Nội Tiết 87 Hình 1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại exon 2 và 3 của gen KNCJ5 ở 2 nhiệt độ bắt cặp là 52 và 540C bằng 2 cặp mồi KCNJ5-2F, KCNJ5-2R và KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R. Exon 2 được khuếch đại thành công, trong khi đó sản phẩm PCR exon 3 không phù hợp với dự đoán ban đầu. Hình 2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại exon 3 của gen KNCJ5 ở 2 nhiệt độ bắt cặp là 52 và 540C bằng cặp mồi KCNJ5-3F2, KCNJ5-3R. Exon3 được khuếch đại thành công. Hình 3. Đột biến L168R trên gen KCNJ5 của bệnh nhân 1. 52 0 C 54 0 C 1500 1000 500 bp 52 0 C 54 0 C 1500 1000 500 bp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 88 Hình 4. Không phát hiện đột biến trên gen KCNJ5 của bệnh nhân 3. Phát hiện đột biến gen KCNJ5 trên các mẫu bệnh phẩm Ứng dụng các kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA của gen KCNJ5, chúng tôi phát hiện đột biến sai nghĩa L168R nằm trên exon 2 của 2 bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Đây là một đột biến phổ biến đã được báo cáo trên nhóm bệnh nhân APA châu Á. Trên mẫu bệnh phẩm còn lại, chúng tôi chưa phát hiện được đột biến trên gen KCNJ5. BÀN LUẬN Gần đây, các nhà khoa học đã chứng minh rằng đột biến sinh dưỡng trên gen KCNJ5 liên quan mật thiết đến APA. Các đột biến trên gen KCNJ5 làm mất tính chọn lọc của kênh Kali Kir 3.4 nằm trên các tế bào vùng cầu thượng thận sản xuất aldosterone dẫn đến tình trạng ion Natri cũng có thể dễ dàng qua kênh ion này, gây khử cực liên tục các các tế bào vùng cầu vỏ thượng thận, sản xuất một lượng lớn aldosterone mà không phụ thuộc vào nồng độ kali máu. Bên cạnh đó, chính sự kích thích liên tục này cũng làm tăng sinh các tế bào vùng cầu vỏ thượng thận quá mức cần thiết và cuối cùng dẫn đến hậu quả hình thành khối u tiết aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma)(3). Ngoài ra, đột biến dòng mầm trên gen KCNJ5 gây ra tình trạng cường aldosterone gia đình típ 3 với đặc điểm di truyền trội nhiễm sắc thể thường , bệnh khởi phát ở tuổi trẻ kèm theo khối u thượng thận hai bên rất lớn(5). Từ đó có thể thấy vai trò hết sức quan trọng của gen KCNJ5 trong sinh bệnh học của u tuyến thượng thận tăng sản aldosterone. KẾT LUẬN Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự gen KCNJ5 từ DNA tách chiết từ mẫu mô u tuyến thượng thận. Việc xác định các đột biến trên gen KCNJ5 sẽ giúp tăng cường hiểu biết về cơ chế phân tử trong bệnh lý u thượng thận tăng tiết aldosterone. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Azizan EAB, Murthy M, et al (2012)."Somatic mutations affecting the selectivity filter of KCNJ5 are frequent in 2 large unselected collections of adrenal aldosteronomas". Hypertension 59 (3): 587–591. 2. Boulkroun S, Beuschlein F, et al (2012)."Prevalence, clinical, and molecular correlates of KCNJ5 mutations Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Nội Tiết 89 in primary aldosteronism". Hypertension 59 (3): 592– 598. 3. Choi M, Scholl UI, et al (2011)."K+ channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension". Science 331 (6018): 768–772. 4. Douma S, Petidis K, et al (2008)."Prevalence of primary hyperaldosteronism in resistant hypertension: a retrospective observational study". Lancet 371 (9628): 1921–1926. 5. Geller DS, Zhang J, Wisgerhof MV, Shackleton C, Kashgarian M, Lifton RP (2008)."A novel form of human mendelian hypertension featuring nonglucocorticoid-remediable aldosteronism". J Clin Endocrinol Metab 93 (8): 3117–3123. 6. Kitamoto T, Suematsu S, Matsuzawa Y, Saito J, Omura M, Nishikawa T (2015)."Comparison of cardiovascular complications in patients with and without KCNJ5 gene mutations harboring aldosterone-producing adenomas". J Atheroscler Thromb 22 (2): 191–200. 7. Mulatero P, Stowasser M, et al (2004)."Increased diagnosis of primary aldosteronism, including surgically correctable forms, in centers from five continents". J Clin Endocrinol Metab 89 (3): 1045–1050. 8. Zheng F-F, Zhu L-M, et al (2015)."Clinical characteristics of somatic mutations in Chinese patients with aldosterone-producing adenoma". Hypertension 65 (3): 622–628. Ngày nhận bài báo: 21/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/12/2016 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017