Xây dựng quy trình khảo sát đột biến gen abcd1 trong bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận (adrenoleukodystrophy)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 376 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ABCD1 TRONG BỆNH LOẠN DƯỠNG CHẤT TRẮNG THƯỢNG THẬN (ADRENOLEUKODYSTROPHY) Nguyễn Thế Vinh*, Hoàng Anh Vũ* TÓM TẮT Mở đầu: Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận (LDCTTT) thuộc nhóm bệnh di truyền thoái hóa thần kinh, với tần suât mắc bệnh trong khoảng 1/20000 đến 1/50000 trẻ. Nguyên nhân bệnh thường do bởi những đột biến trên gen ABCD1, nằm trên nhiễm sắc thể X mã hóa cho protein ALD, một protein vận chuyển trên màng peroxisome. Những đột biến này gây ra sự tích tụ acid béo bão hòa chuỗi rất dài ảnh hưởng đến myelin trong hệ thần kinh trung ương, vỏ thượng thận, tế bào Leydig tinh hoàn. Sử dụng công cụ sinh học phân tử trong việc chẩn đoán bệnh LDCTTT đưa ra những đánh giá chính xác, nhanh chóng giúp bệnh nhân nhận được chế độ điều trị thích hợp, làm chậm quá trình bệnh và kéo dài thời gian sống. Mục tiêu: Xây dựng được quy trình ứng dụng kỹ thuật giải trình tự khảo sát đột biến trên gen ABCD1. Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên một bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng mắc LDCTTT, tách chiết DNA từ máu bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen, phân tích đột biến gen ABCD1. Kết quả: Thiết kế thành công 5 cặp mồi và quy trình PCR khuếch đại 10 exon gen ABCD1. Phát hiện đột biến dịch khung p.Q472fsX554. Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự trong chẩn đoán đột biến gen ABCD1. Từ khóa: loạn dưỡng chất trắng thượng thận, gen ABCD1, kỹ thuật giải trình tự. ABSTRACT DEVELOP A PROTOCOL FOR SCREENING ABCD1 MUTATIONS IN ADRENOLEUKODYSTROPHY Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 376 - 380 Background: Adrenoleukodystrophy is a genetic degenerative disorder of nervous system with an incidence estimated between 1/20000 to 1/50000 children. The cause of disease come from the mutations on ABCD1 gene located on X chromosome, that encodes for ALD protein which is transporter protein on peroxisome membrane. These mutations lead to the accumulation of very long chain fatty acid that affects the myelin in the central nervous system, the adrenal cortex and the Leydig cells in the testes. Using biomolecular engineering in adrenoleukodystrophy prognosis gives results correctly and fast, so the patient would be treated appropriately and disease process could be slowed down. Objective: Develop a sequencing protocol for ABCD1 mutations screening. Method: Sequence and screen for ABCD1 mutations using DNA from blood of OI patients diagnosed clinically. Results: Successfully designed 5 pairs of primer and PCR protocol that amplifies 10 exons of ABCD1. Identified a frameshift mutation p.Q472fsx55. * Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: CN.Nguyễn Thế Vinh Điện thoại: 0935827668 Email: vinhnguyen29391@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Nội Tiết 377 Conclusion: Our research has developed and applied successfully a sequencing protocol to identify mutations of ABCD1. Keywords: Adrenoleukodystrophy, ABCD1, sequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận (LDCTTT), tên tiếng anh Adrenoleukodystrophy, là một nhóm bệnh di truyền thoái hóa thần kinh được mô tả lần đầu vào năm 1913 bởi Schilder(1). Tần suất mắc bệnh LDCTTT trong khoảng 1/20000 đến 1/50000 trẻ(16). Bệnh ảnh hưởng đến tính ổn định của myelin trong não và dây thần kinh ngoại vi do sự khiếm khuyết quá trình beta oxi hóa chất béo của peroxisome. Các biểu hiện lâm sàng thường gặp là rối loạn thị giác, thoái hóa thần kinh vận động và nhận thức, suy chức năng vỏ thượng thận Bệnh nhân có thể nhập viện với tổn thương hệ thần kinh trung ương tiến triển nhanh hoặc có thể có các triệu chứng tương tự như một số rối loạn tâm thần, có thể gây chẩn đoán sai(9). Ở các bệnh nhi, LDCTTT tiến triển nhanh, dẫn đến tình trạng hôn mê dài hạn khoảng 2 năm sau khi các triệu chứng hệ thần kinh phát triển, các hình thức khác của bệnh này nhẹ hơn. Ba phương pháp điều trị thường sử dụng cho bệnh nhân LDCTTT: điều chỉnh chế độ ăn uống ít mỡ, sử dụng một số loại thuốc (Lorenzo(11), Lovastatin(13)), cấy ghép tế bào gốc(2). ABCD1 nằm trên NST Xq28, và trên những bệnh nhân LDCTTT thường phát hiện đột biến trên gen này. ABCD1 thuộc siêu họ protein vận chuyển bám ATP. Siêu họ này gồm các protein màng vận chuyển nhiều loại cơ chất từ ngoài vào trong tế bào, bao gồm nhiều loại sản phẩm biến dưỡng, lipid, sterol và thuốc(4). ABCD1 biểu hiện một nửa protein vận chuyển trên peroxisome(14). Sự đột biến trên gen ABCD1 gây ra LDCTTT ngăn cản sự hình thành protein ALD ở khoảng 75% bệnh nhân mắc hội chứng này. Ở một số bệnh nhân khác việc tạo protein ALD vẫn xảy ra nhưng các protein không có chức năng. Với một ít protein ALD hoặc hoàn toàn không, các acid béo chuỗi rất dài không bị phân hủy và tích tụ trong cơ thể. Việc tích tụ này gây độc cho tuyến thượng thận và myelin bao quanh các dây thần kinh ở khắp cơ thể. Nhiều nghiên cứu cho rằng sự tích tụ acid béo chuỗi rất dài dẫn đến sự khởi phát đáp ứng viêm ở não, dẫn đến sự phá hủy myelin, gây ra các triệu chứng của LDCTTT(5). Đột biến trên ABCD1 thường là những biến đổi nhỏ gây ra đột biến sai nghĩa, vô nghĩa, mất một hoặc một vài acid amin, dịch khung đọc mã, đột biến tại vùng cắt nối exon-intron(10). Phổ đột biến ABCD1 trải dài trên khắp gen, do đó sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger rất thích hợp cho việc tìm kiếm đột biến trên gen này. Việc xác định sớm và tư vấn di truyền cho các bậc cha mẹ có tiền sử gia đình mắc LDCTTT là cần thiết, nhằm dự đoán tình trạng bệnh con cái họ cũng như hạn chế biến chứng xảy ra nếu con cái họ mắc LDCTTT. Phát hiện tình trạng bệnh sớm nhất có thể đưa ra những biện pháp chữa trị hợp lý giảm nguy cơ mất chức năng tuyến thượng thận. Nếu đột biến ABCD1 ở bệnh nhân có tính gia đình, phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử có thể đánh giá được nguy cơ bệnh trên người thân và họ hàng của bệnh nhân. Hiện nay vẫn chưa thấy có báo cáo nào tại Việt Nam nghiên cứu về những đột biến gen ABCD1 trong bệnh LDCTTT. Ứng dụng các phương pháp xét nghiệm gen trong y sinh học phân tử trong việc chẩn đoán bệnh LDCTTT, cũng như các bệnh di truyền khác sẽ cho kết quả chính xác, nhanh chóng. Đồng thời giúp chẩn đoán sớm bệnh ở các bệnh nhi có biểu hiện triệu chứng bệnh chưa rõ ràng, cũng như tiềm năng trong các ứng dụng chẩn đoán tiền sinh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu genomic DNA được thu nhận từ máu bệnh nhân được chẩn đoán bệnh loạn dưỡng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 378 chất trắng thượng thận. Mẫu máu bệnh nhân được đánh mã số ALD-10. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM. Mẫu xét nghiệm là mẫu máu được ly trích DNA và giải trình tự DNA toàn bộ 10 exon gen ABCD1. Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông có EDTA, lắc đều nhẹ nhàng. Genomic DNA được tách chiết trong vòng 24 giờ bằng bộ kit illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Thiết kế mồi cho 10 exon của gene ABCD1: Sử dụng phần mềm CLC main workbench tải trình tự gene ABCD1 của người từ NCBI (NG_009022.2 ), sau đó sử dụng công cụ thiết kế mồi sẵn có của phần mềm để thiết kế mồi PCR cho các exon của gene ABCD1. Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại toàn bộ chiều dài gen ABCD1: Mỗi tube PCR có thể tích 15 l chứa các thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mỗi mồi xuôi và ngược (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) và 8,4μl nước cất 2 lần khử ion. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm. Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện trên máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức). Chu kỳ nhiệt: khởi đầu tại 98oC trong 3 phút, tiếp theo với 40 chu kỳ lặp lại các bước 98oC : 10 giây, 60oC : 20 giây, 72oC : 1 phút 30 giây; kế tiếp với bước 72oC : 2 phút. Trữ sản phẩm PCR tại 4oC. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose: Trên thạch agarose 2% có nhuộm ethium bromide và quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ). Tinh sạch sản phẩm: Trường hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn được cắt từ gel và tinh sạch. Sản phẩm PCR trực tiếp hoặc cắt từ gel sau đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Giải trình tự bằng phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol tuyệt đối, lạnh, với sự hỗ trợ tủa bằng muối NH4OAC, hòa tan trong Hi-Di formaldehyde, biến tính ở 96C trước khi làm lạnh đột ngột ở 4oC. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Phân tích kết quả giải trình tự: Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn của ABCD1 tham khảo từ ngân hàng trình tự gene trên website NCBI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả thiết kế mồi được trình bày trong bảng 1: Bảng 1: Trình tự 11 cặp mồi sử dụng khuếch đại 10 exon gen ABCD1 và thông số STT Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) Kích thước sản phẩm (bp) Vùng exon khuếch đại Tên mồi Trình tự Tên mồi Trình tự 1 ABCD1_1F aggacaggagagccaagttc ABCD1_1R cttagagctgcgatcctagc 1460 1 2 ABCD1_1F2 tgtggctcctgcggctgctg ABCD1_1R cttagagctgcgatcctagc 981 1 3 ABCD1_2F ccttgagtttgagacctggc ABCD1_2R cacttctccaggcacagata 633 2 4 ABCD1_3F gttggtttgtctgtatggtg ABCD1_4R ccttccttcccagacagtag 840 3,4 5 ABCD1_5F gttcagcttgttggaagacc ABCD1_5R ggtgagagaccaacgtgtct 429 5 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Nội Tiết 379 STT Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) Kích thước sản phẩm (bp) Vùng exon khuếch đại Tên mồi Trình tự Tên mồi Trình tự 6 ABCD1_6F ttcagctgtggcagaatagg ABCD1_6R ctgcagaggcccaggaagtg 536 6 7 ABCD1_7F atgtggacactgcctgggag ABCD1_7R2 gcctctcccttggcctccag 293 7 8 ABCD1_7F atgtggacactgcctgggag ABCD1_7R ggtcactctgctgtgtttgg 1466 7 9 ABCD1_8F taaaccgcagggatggattg ABCD1_9R caggcggctgtcatcagcag 974 8,9 10 ABCD1_8F2 ctgtcgtcacagctagctca ABCD1_9R caggcggctgtcatcagcag 564 8,9 11 ABCD1_10F cagcaggcggctgtcatcag ABCD1_10R cctccctccagagactcgag 682 10 Kết quả PCR: Để giảm chi phí nghiên cứu cũng như tiết kiệm thời gian, thiết kế phản ứng PCR khuếch đại các vùng trên gen ABCD1 có mang nhiều exon nằm gần nhau theo bảng 2. Bảng 2: Các phản ứng khuếch đại exon gen ABCD1 Cặp mồi Genomic DNA từ máu bệnh nhân Chứng âm (nước cất 2 lần khử ion) Kích thước vùng khuếch đại (bp) ABCD1_1F/1R Phản ứng 1 Phản ứng 2 1460 ABCD1_2F/2R Phản ứng 3 Phản ứng 4 633 ABCD1_3F/5R Phản ứng 5 Phản ứng 6 1470 ABCD1_6F/7R Phản ứng 7 Phản ứng 8 2172 ABCD1_8F/10R Phản ứng 9 Phản ứng 10 1633 Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR. Giếng 1, 2 (mồi ABCD1_1F/1R, 1460bp), giếng 3, 4(mồi ABCD1_2F/2R, 633bp), giếng 5, 6(mồi ABCD1_3F/5R, 1470bp), giếng 7, 8 (mồi ABCD1_6F/7R, 2172bp), giếng 9, 10 (mồi ABCD1_8F/10R, 1633bp) Nhận xét: kết quả điện di cho thấy giếng số 1, 3, 5, 7, 9 cho sản phẩm có kích thước mong muốn. Các giếng chứng âm 2, 4, 6, 8, 10 không có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ phản ứng PCR thành công không xảy ra hiện tượng nhiễm chéo. Kết quả giải trình tự Trên 10 exon được khảo sát của gen ABCD1 ở bệnh nhân, phát hiện được đột biến đồng hợp tử, mất 2 nucleotide (c.1415-1416delAG) trên exon 5 gen ABCD1. Đột biến làm lệch khung dịch mã, thay đổi trình tự chuỗi acid amin protein ALD, tạo stop codon tại vị trí acid amin số 554. Hình 2: Kết quả giải trình tự exon 5 trên gen ABCD1 ở bệnh nhân BÀN LUẬN Kết quả điện di cho thấy phản ứng PCR xảy ra tốt, các băng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu không có băng phụ xuất hiện, có thể kết luận các mồi thiết kế hoạt động tốt, khuếch đại chính xác, không tự bắt cặp tạo primer dimer. Các giếng chứng âm âm tính cho thấy phản ứng không bị ngoại nhiễm, thao tác và quy trình thí nghiệm chặt chẽ, chuẩn xác. Gen ABCD1 có 10 exon, nhưng thiết kế 11 cặp mồi vì trên gen có một số đoạn giàu G/C hoặc A/T có thể gây khó khăn cho việc PCR và giải trình tự Sanger, do đó một số cặp được thiết kế dự phòng và được kết hợp lẫn nhau để tìm ra cặp mồi tối ưu khuếch đại vùng exon mong muốn. Như kết quả PCR đưa ra, mặc dù có 10 exon nhưng chỉ cần 5 phản ứng PCR đủ để khuếch đại toàn bộ. Như vậy, so với dự tính thiết kế mồi ban đầu, chúng tôi đã tiết kiệm tối đa số phản ứng PCR cần thực hiện để khuếch đại toàn bộ 10 exon gen ABCD1, giảm 50% Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 380 lượng hóa chất và công sức để thực hiện phản ứng PCR. Theo một số báo cáo trên thế giới phát hiện có nhiều đoạn giả gen của gen ABCD1 trên các vùng NST khác ( NST 2 – 2p11, NST 10 – 10p11, NST 16 – 16p11 và NST 22- 22q11)(15). Những đoạn giả gen mang trình tự giống các vùng exon 8, 9, 10 trên gen ABCD1 được lấy từ NCBI với mã tương ứng với các đoạn trên NST 2, 10, 16, 22 như sau: U90288, U90289, U90290, U90291(6). Sử dụng các trình tự này để thiết kế các mồi cho exon 8, 9, 10 sao cho các mồi tránh khuếch đại các vùng giả gen, làm sai kết quả chẩn đoán. Theo kết quả giải trình tự Sanger, phát hiện đột biến mất 2 nucleotide A, G tại vị trí 17312 và 17313, đột biến này đã được báo cáo trên nhiều bài báo trên thế giới(3,7,12), một thống kê trên những bệnh nhân LDCTTT tại miền nam Trung Quốc cho thấy đột biến này xuất ở tần suất khá cao 26%(8). Đột biến gây ra sự lệch khung dịch mã, làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin của protein ALD , tạo stop codon ở vị trí 554. Sự biến đổi này ảnh hưởng đến các domain của protein như domain vận chuyển acid béo chuỗi rất dài, domain ATPase làm mất chức năng protein này. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình phát hiện đột biến trên 10 exon gen ABCD1 bằng phương pháp giải trình tự chuỗi Sanger. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán sớm để đưa ra phương pháp trị liệu thích hợp cho bệnh nhân, giảm thiểu hậu quả xấu do bệnh gây ra. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Benke PJ, Reyes PF, Parker Jr JC (1981). New form of adrenoleukodystrophy. Human genetics, 58(2):204-208. 2. Cartier N, Aubourg P (2010). Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy. Brain Pathology, 20(4):857- 862. 3. Chiu HC, Liang JS, Wang JS, Lu JF (2006). Mutational analyses of Taiwanese kindred with X-linked adrenoleukodystrophy. Pediatric neurology, 35(4):250-256. 4. Dean M, Hamon Y, Chimini G (2001). The human ATP- binding cassette (ABC) transporter superfamily. Journal of lipid research, 42(7):1007-1017. 5. Dumser M, Bauer J, Lassmann H, Berger J, Forss-Petter S (2007). Lack of adrenoleukodystrophy protein enhances oligodendrocyte disturbance and microglia activation in mice with combined Abcd1/Mag deficiency. Acta neuropathologica, 114(6):573-586. 6. Eichler EE, Budarf ML, Rocchi M, Deaven LL, Doggett NA, Baldini A, Nelson DL, Mohrenweiser HW (1997). Interchromosomal duplications of the adrenoleukodystrophy locus: a phenomenon of pericentromeric plasticity. Human molecular genetics, 6(7):991-1002. 7. Finsterer J, Lässer S, Stöphasius E (2013). Dementia from the ABCD1 mutation c. 1415-1416delAG in a female carrier. Gene, 530(1):155-157. 8. Jiang MY, Cai YN, Liang CL, Peng MZ, Sheng HY, Fan LP, Lin RZ, Jiang H, Huang Y, Liu L (2015). Clinical, biochemical, neuroimaging and molecular findings of X-linked Adrenoleukodystrophy patients in South China. Metabolic brain disease, 30(6):1439-1444. 9. Kitchin W, Cohen-Cole SA, Mickel SF (1987). Adrenoleukodystrophy: frequency of presentation as a psychiatric disorder. Biological psychiatry, 22(11):1375-1387. 10. Ligtenberg M, Kemp S, Sarde CO, van Geel BM, Kleijer WJ, Barth PG, Mandel JL, van Oost BA, Bolhuis PA (1995). Spectrum of mutations in the gene encoding the adrenoleukodystrophy protein. American journal of human genetics, 56(1):44. 11. Moser HW, Moser AB, Hollandsworth K, Brereton NH, Raymond GV (2007). “Lorenzo’s Oil” Therapy for X-linked Adrenoleukodystrophy: Rationale and Current Assessment of Efficacy. Journal of Molecular Neuroscience, 33(1):105-113. 12. Niu YF, Ni W, Wu ZY (2013). ABCD1 mutations and phenotype distribution in Chinese patients with X-linked adrenoleukodystrophy. Gene, 522(1):117-120. 13. Pai GS, Khan M, Barbosa E, Key LL, Craver JR, Curé JK, Betros R, Singh I (2000). Lovastatin therapy for X-linked adrenoleukodystrophy: clinical and biochemical observations on 12 patients. Molecular genetics and metabolism, 69(4):312- 322. 14. Shani N, Valle D (1996). A Saccharomyces cerevisiae homolog of the human adrenoleukodystrophy transporter is a heterodimer of two half ATP-binding cassette transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(21):11901- 11906. 15. Smith KD, Kemp S, Braiterman LT, Lu JF, Wei HM, Geraghty M, Stetten G, Bergin JS, Pevsner J, Watkins PA (1999). X-linked adrenoleukodystrophy: genes, mutations, and phenotypes. Neurochemical research, 24(4):521-535. 16. Takemoto Y, Suzuki Y, Tamakoshi A, Onodera O, Tsuji S, Hashimoto T, Shimozawa N, Orii T, Kondo N P(2002). Epidemiology of X-linked adrenoleukodystrophy in Japan. Journal of human genetics, 47(11):0590-0593. Ngày nhận bài báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016