Xây dựng quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ ngải trắng (rhizoma curcumae aromaticae) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 249 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ZEDOARONDIOL TRONG THÂN RỄ NGẢI TRẮNG (RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Võ Thanh Hóa*, Lê Nữ Huỳnh Như*, Nguyễn Thị Quỳnh Trang*, Nguyễn Đức Hạnh* TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Ngải trắng (Curcuma aromatica) là một vị thuốc nam phổ biến ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ với các tác dụng đáng chú ý như kháng viêm, kháng ung thư Zedoarondiol là một trong những hoạt chất của Ngải trắng có tác dụng kháng viêm. Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định tiêu chuẩn cho dược liệu này. Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng zedoarondiol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các điều kiện khác nhau của quy trình xử lý mẫu và quy trình sắc ký HPLC được sàng lọc và chọn lựa. Quy trình định lượng zedoarondiol được thẩm định tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: Phương pháp chuẩn bị mẫu được chọn sử dụng dung môi methanol 100% để chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp chiết Soxhlet. Điều kiện sắc ký HPLC tối ưu bao gồm cột Hypersil gold C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện ở 258 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng 1 ml/phút. Hỗn hợp acetonitril - nước được chọn làm dung môi pha động với tỷ lệ acetonitril lần lượt là 2%, 8%, 16% và 18% ở thời điểm 0-3, 4-8, 9-18 và 22 - 30 phút. Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống. Tính tuyến tính được ghi nhận trong khoảng 7,47– 224,1 µg/mL (ŷ = 22,078x, R2=0,997). Độ lặp lại được xác định là 1,69%. Độ đúng đạt yêu cầu với độ phục hồi trong khoảng 91,02-100,78%. Kết luận: Quy trình định lượng zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng. Quy trình định lượng đạt yêu cầu về thẩm định theo hướng dẫn của ICH và có thể được ứng dụng để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu thân rễ Ngải trắng và các sản phẩm liên quan. Từ khóa: Rhizoma Curcumae aromaticae, zedoarondiol, định lượng, HPLC ABSTRACT ZEDOARONDIOL DETERMINATION FROM RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD Vo Thanh Hoa, Le Nu Huynh Nhu, Nguyen Thi Quynh Trang, Nguyen Duc Hanh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 249-255 Background – Objectives: Ngai trang (Curcuma aromatica) is a popularly medicine material of South Vietnam folk medicine. Zedoarondiol, one of the major bioactive compounds of C. aromatica, has been reported to possess the anti-inflammatory activity. Until now Vietnamese Pharmacopoeia has no monograph on C. aromatica. The aim of this study was to develop an analytical procedure for zedoarondiol determination from C. aromatica by using high performance liquid chromatography (HPLC) method. Methods: The sample preparation methods and HPLC conditions were screened and selected. The HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines including the specificity, suitability, linearity, precision and accuracy. *Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0913576748 Email: duchanh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 250 Results: Methanol 100% and Soxhlet extraction were chosen as the best solvent and method for the sample preparation. The optimized HPLC condition employed Hypersil Gold C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), a detection wavelength of 258 nm, a column temperature of 30 oC, a flow rate of 1 ml/min and a mixture of acetonitrile and water as a mobile phase. The ratios of acetonitrile were 2%, 8%, 16% and 18% at 0-3 min, 4-8 min, 9-18 min and 22 - 30 min, respectively. The specificity and system suitability were found to meet the requirements. The good correlations between peak areas and concentrations were obtained within a range of 7.47– 224.1 µg/mL (R2 = 0.997). The RSD value of precision and the recovery percentages were found to be at 1.69% and within a range of 91.02 – 100.78%, respectively. Conclusions: The analytical procedure for zedoarondiol determination from rhizoma Curcumae aromaticae by using HPLC method has been successfully developed. The quantitation method met the requirements of validation and could be useful for establishing the quality standard of rhizoma Curcumae aromaticae and its related products. Keywords: Rhizoma Curumae aromaticae, zedoarondiol, quantitation, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngải trắng (Curcuma aromatica Salisb., Zingiberaceae) là một trong những thành phần quan trọng của bài thuốc chữa bệnh kinh nguyệt không đều, băng huyết, đau bụng kinh, viêm gan mạn tính, ho gà, sỏi tắc mật, bệnh mạch vành(1),... tại tỉnh An Giang. Với các tác dụng dược lý quan trọng nêu trên, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã xác định thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Ngải trắng. Zedoarondiol (Hình 1) là một hoạt chất của Ngải trắng có nhiều tác dụng sinh học đã được công bố như kháng viêm(5), chống xơ vữa động mạch(3), bảo vệ tế bào gan(4) Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu về quy trình định lượng zedoarondiol trong dược liệu này. Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng (Rhizoma curcumae aromaticae) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), góp phần phục vụ công tác kiểm soát chất lượng dược liệu. Hình 1: Công thức cấu tạo của zedoarondiol ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất, thiết bị Thân rễ của cây Ngải trắng (C. aromatica) được thu hái tại tỉnh An Giang và đã được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen tại Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh . Chất chuẩn làm việc zedoarondiol (hàm lượng nguyên trạng 98,6%) được cung cấp bởi khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh . Acetonitril (Labscan, Ireland) và nước cất đạt yêu cầu HPLC. Methanol, ethanol 96% (Labscan, Ireland) đạt yêu cầu phân tích. Khảo sát quy trình xử lí mẫu Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị Soxhlet, sử dụng methanol 100% hoặc ethanol 96% trong cùng điều kiện nhiệt độ 100oC và thời gian chiết xuất là 120 phút. Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô. Hòa cắn với methanol 30% và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng phương pháp HPLC. Chọn dung môi chiết được nhiều zedoaondiol và ít tạp nhất. Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet Bột thân rễ Ngải trắng (cân chính xác khoảng 1 g) được chiết xuất bằng thiết bị Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 251 Soxhlet, sử dụng dung môi được chọn ở trên trong các thời gian chiết xuất khảo sát lần lượt là 60, 120 và 180 phút và nhiệt độ 100oC. Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm tới cắn khô. Hòa cắn với methanol 30% và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm và định lượng bằng phương pháp HPLC. Chọn thời gian khảo sát cho kết quả chiết xuât thu được nhiều zedoaondiol nhất. Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng sử dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức), detector UVD 2.1L (Đức), cột sắc ký Hypersil gold C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) và tiền cột HQ 105 C18 (10 ×4,6 mm; 5 μm) (Thermo Scientific, Mỹ), nhiệt độ cột 30oC, bước sóng phát hiện 258 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20 μl. Thăm dò 4 chương trình gradient pha động sử dụng hỗn hợp acetonitril - nước làm dung môi rửa giải. Chọn điều kiện HPLC sao cho pic zedoarondiol tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và các thông số sắc ký đạt yêu cầu. Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng theo hướng dẫn của ICH(2) về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol Khảo sát các chương trình pha động với các tỷ lệ dung môi acetonitril – nước khác nhau trình bày trong Bảng 1. Kết quả khảo sát chương trình pha động được trình bày trong Hình 2. Bảng 1: Các chương trình pha động HPLC định lượng zedoarondiol Chương trình pha động Thời gian và tỉ lệ dung môi nước: acetonitril I 0 - 20 phút (90:10); 27 - 40 phút (10:90) II 0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (27:73) III 0 - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (85 : 15) IV 0 - 3 phút (98:2); 4 - 8 phút (92:8); 9 - 18 phút (84:16); 22 - 30 phút (82:18) Chương trình I Chương trình II Chương trình III Chương trình IV Hình 2: Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với các chương trình pha động khác nhau Z e d o a ro n d io l Z e d o a ro n d io l Z e d o a ro n d i o l Zedaoarondiol Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 252 Chương trình I, II (Hình 2) cho pic zedoarondiol rửa giải ở thời gian lưu khoảng 25 phút, tuy nhiên, pic zedoarondiol chưa tách hòa toàn khỏi các pic liền trước và sau. Chương trình III cho pic zedoarondiol đã tách ra khỏi tạp, độ phân giải cao. Tuy nhiên, thời gian lưu của pic zedoarondiol kéo dài khoảng 33 phút. Chương trình IV có pic zedoarondiol gọn, cân đối, độ phân giải cao, thời gian lưu khoảng 25 phút, các thông số khác của pic đều nằm trong khoảng cho phép. Vì vậy, điều kiện IV được chọn để tiến hành thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng. Khảo sát quy trình xử lí mẫu Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol Bảng 2: Kết quả khảo sát dung môi chiết zedoarondiol (n=3) STT Dung môi chiết Trung bình diện tích pic zedoarondiol (mAu.s) 1 Methanol 100% 1756,966 2 Ethanol 96% 1418,551 Hình 3: Sắc ký đồ HPLC khảo sát dung môi chiết zedoarondiol Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần dịch chiết thân rễ Ngải trắng bằng Soxhlet với 2 dung môi methanol 100% và ethanol 96% trong 120 phút được trình bày trong Hình 3. Methanol 100% và ethanol 96% đều chiết được zedoarondiol. Tuy nhiên, methanol 100% chiết được nhiều zedoarondiol hơn ethanol 96% (Bảng 2). Vì vậy, methanol 100% được chọn làm dung môi chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng. Khảo sát thời gian chiết bằng Soxhlet Bảng 3: Kết quả khảo sát thời gian chiết zedoarondiol (n=3) STT Thời gian chiết (phút) Trung bình diện tích pic zedoarondiol (mAu.s) 1 60 1404,922 2 120 1699,891 3 180 1701,164 Hình 4: Kết quả sắc ký đồ HPLC khảo sát thời gian chiết zedoarondiol Kết quả sắc ký HPLC khảo sát thành phần dịch chiết thân rễ Ngải trắng được chiết bằng phương pháp Soxhlet, sử dụng dung môi được chọn methanol 100% với các thời gian chiết khác nhau được trình bày trong Hình 4. Z e d o a ro n d i o l Ethanol 96% Z e d o a ro n d i o l Methanol 100% 180 phút Z e d o a ro n d io l Z e d o a ro n d io l 120 phút Z e d o a ro n d io l 60 phút Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 253 Bảng 3 cho thấy thời gian chiết Soxhlet càng dài, lượng zedoarondiol thu được càng lớn. Tuy nhiên, sau 2 giờ và 3 giờ chiết, diện tích pic zedoarondiol thu được thay đổi không đáng kể (p>0,05). Vì vậy, 120 phút được chọn là thời gian chiết xuất phù hợp bằng Soxhlet với dung môi methanol 100%. Quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng Mẫu thử Cân chính xác 1 g bột thân rễ Ngải trắng cho vào bình chiết Soxhlet. Tiến hành chiết với methanol 100% ở 100oC trong 120 phút. Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm tới khi thu được cắn khô. Hòa tan cắn với methanol 30% và cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm. Mẫu đối chiếu Dung dịch chuẩn đối chiếu zedoarondiol nồng độ 100 μg/ml trong methanol. Điều kiện sắc ký HPLC: Điều kiện IV Hàm lượng zedoarondiol (%) trong thân rễ Ngải trắng đươc tính theo công thức sau: k hm V C S S X C C t 100001 X: % zedoarondiol trong dược liệu St, Sc: lần lượt là diện tích pic zedoarondiol của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu Cc: nồng độ zedoarondiol của dung dịch đối chiếu (μg/ml) V: thể tích dung dịch thử (ml) m: khối lượng cân của dược liệu (g) h: độ ẩm của dược liệu k: độ tinh khiết của chuẩn Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng Tính tương thích hệ thống Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống được trình bày trong Bảng 4. Các thông số thời gian lưu, diện tích pic có RSD% ≤ 2%. Hệ số bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu phân tích. Vậy, phương pháp đã xây dựng đạt tính tương thích hệ thống. Bảng 4: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống Rt (phút) S (mAU.s) N AS RS Trung bình 25,461 1723,782 815726 0,800 1,980 SD 0,029 14,156 2965 0,004 0,028 RSD (%) 0,114 0,821 0,360 0,544 1,400 Tính đặc hiệu Hình 5 cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi methanol 30%) không có pic xuất hiện trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic zedoarondiol trong mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu thử có pic có thời gian lưu tương ứng với pic zedoarondiol trong mẫu chuẩn. Khi thêm chuẩn vào mẫu thử thì chiều cao và diện tích pic zedoarondiol trong mẫu thử tăng lên. Độ tinh khiết pic zedoarondiol (trên hệ thống máy HPLC Alliance Water, đầu dò PDA 2969, phần mềm Empower) đạt yêu cầu. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ zedoarondiol được trình bày trong Hình 6. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ zedoarondiol trong khoảng nồng độ 7,47– 224,1 (R2=0,997). Độ lặp lại Kết quả khảo sát độ lặp lại (Bảng 5) cho thấy %RSD=1,69% < 2%. Vì vậy, quy trình đạt yêu cầu về độ lặp lại. Bảng 5: Kết quả độ lặp lại STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình RSD (%) Rt (phút) 25,533 25,583 25,733 25,217 25,583 25,433 25,514 0,69 Diện tích pic (mAU.s) 1757,0 1706,4 1749,1 1689,5 1710,2 1692,1 1716,9 1,69 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 254 Hình 5: Kết quả HPLC khảo sát độ đặc hiệu (Rt pic zedoarondiol ≈ 25 phút)Khoảng tuyến tính Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 7,47 121,6 44,82 979,0 89,64 1854,3 134,46 2927,5 179,28 4102,1 224,10 4795,2 Hình 6: Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic zedoarondiol Độ đúng Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng Mức nồng độ thêm vào Tỷ lệ phục hồi (%) Số liệu thống kê 80% 94,27 TB = 96,73 SD = 2,18 RSD = 2,25% 97,55 98,39 100% 100,78 TB = 96,65 SD = 3,77 RSD = 3,91% 94,05 94,92 120% 100,69 TB = 96,12 SD = 4,86 RSD = 5,05% 96,64 91,02 Độ đúng được tiến hành bằng cách thêm chất chuẩn vào mẫu dược liệu 3 mức 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng zedoarondiol. Mỗi mức chuẩn bị 3 mẫu. Kết quả đánh giá dựa vào tỷ lệ phục hồi. Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày trong Bảng 6. Ứng dụng quy trình định lượng để khảo sát hàm lượng zedoarondiol trong mẫu thân rễ Ngải trắng X được thu hái tại tỉnh An Giang. Kết quả được trình bày trong bảng 7. Bảng 7: Hàm lượng zedoarondiol trong mẫu X STT Hàm lượng (%) STT Hàm lượng (μg/g) Trung bình 1 0,246 4 0,236 TB = 0,241 % 2 0,239 5 0,239 3 0,245 6 0,237 BÀN LUẬN Quy trình xử lý mẫu định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng đã được khảo sát dựa trên 2 yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến lượng zedoarondiol chiết được là Mẫu thử thêm chuẩn Z e d o a ro n d io l Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 255 loại dung môi chiết và thời gian chiết xuất bằng phương pháp Soxhlet. Dung môi methanol 100% được chọn làm dung môi chiết xuất vì cho lượng zedoarondiol chiết được nhiều hơn dung môi ethanol 96% trong cùng một điều kiện chiết xuất. Thời gian chiết bằng phương pháp Soxhlet đã được xác định có ảnh hưởng đáng kể kến lượng zedoarondiol chiết được. Thời gian tốt nhất để xử lý mẫu thử là 120 phút với dung môi được chọn là methanol 100%. Tỷ lệ phục hồi của phương pháp định lượng trong khoảng 91,02-100,78% thuộc khoảng cho phép 90 - 107% và các giá trị %RSD đều nhỏ hơn 5,3%. Vì vậy, quy trình định định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng đạt yêu cầu thẩm định của một quy trình định lượng. KẾT LUẬN Quy trình định lượng zedoarondiol trong thân rễ Ngải trắng đã được xây dựng và thẩm định. Kết quả thẩm định đạt các yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại (1,69%) và độ đúng với độ phục hồi trong khoảng 91,02 - 100,78%. Quy trình này có thể được ứng dụng trong việc định lượng và xây dựng tiêu chuẩn thân rễ Ngải trắng, đồng thời là dữ liệu quan trọng cho việc xây dựng quy trình định lượng cho các sản phẩm liên quan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 391-2. 2. Guideline ICH “Q2A text on validation of Analytical Procedures”, Fed. Regist. 60. 3. Huimin M, Tianqi T, Dandan S (2016), “Zedoarondiol inhibits platelet-derived growth factor-induced vascular smooth muscle cells proliferation via regulatin AMP- activated protein kinase signaling pathway”, Cell Physiol Biochem, 40, pp. 1506-20. 4. Toshio M, Hisashi M (2002), “Potent protective effects of sesquiterpenes and curcumin from Zedoariae rhizoma on liver injury induced by D- galactosamine/lipopolysaccharide or tumor necrosis factor- α”, Biol Pharm Bull, 25 (5), pp. 627-31. 5. Woong C, Joo WN, Hyun JK (2009), “Zedoarondiol isolated from the rhizoma of Curcuma heyneana is involved in the inhibition of iNOS, COX-2 and pro-inflammatory cytokines via the down regulation of NF-κB pathway in LPS- stimulated murine macrophages”, Int Immunopharmacol, 9, pp. 1049-57. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019