Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt cúc gai và chế phẩm từ cúc gai (silybum marianum (l.) Gaertn) bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 512 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SILYBIN TRONG DƯỢC LIỆU HẠT CÚC GAI VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Ngô Thị Thanh Diệp*, La Hoàng Anh*, Hà Quốc Huấn*, Tạ Công Minh Huy* TÓM TẮT Mở đầu: Cây Cúc gai, tên khoa học Silybum marianum (L.) Gaertn., trong thành phần hóa học chứa các flavonolignan với hoạt chất chính là silybin đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị bệnh gan in vitro và in vivo. Các loại thuốc và thực phẩm chức năng từ Cúc gai đã xuất hiện khá nhiều trên thị trường trong nước và thế giới. Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai đang lưu hành trên thị trường là một vấn đề đang được quan tâm hiện nay. Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn. và chế phẩm từ hạt cúc gai bằng phương pháp HPLC. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là silybin có trong dược liệu và chế phẩm từ Cúc gai. Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai và các chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường được mã hóa FY, ZE bằng phương pháp HPLC và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai và các chế phẩm FY, ZE. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai và một số chế phẩm từ hạt Cúc gai bằng phương pháp HPLC với các thông số: Cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), bước sóng phát hiện 288 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ cột: 40 oC, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, pha động: dung môi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5), dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5) theo chương trình rửa giải gradient. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác với RSD < 5%, tỷ lệ phục hồi của Silybin nằm trong khoảng 90-110%. Áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng Silybin trong hạt Cúc gai và một số chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường. Kết quả cho thấy hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai là khoảng 1,79 mg/g tính theo dược liệu khô kiệt; trong chế phẩm FY – 49,17 mg/viên; trong chế phẩm ZE – 40,82 mg/viên. Kết luận: Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng Silybin trong dược liệu hạt Cúc gai và chế phẩm từ hạt Cúc gai. Quy trình có thể sử dụng để đánh giá chất lượng của dược liệu và chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường hiện nay. Từ khóa: Cúc gai, milk thistle seed, silybin, HPLC. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF SILYBIN IN MILK THISTLE SEEDS (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) AND THEIR PRODUCTS BY HPLC METHOD Ngo Thi Thanh Diep, La Hoang Anh, Ha Quoc Huan, Ta Cong Minh Huy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 512 – 518 *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 Email: thanhdiep73@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 513 Introduction: Milk thistle, scientific name is Silybum marianum (L.) Gaertn, in chemical compositions containing flavonolignans with major active ingredient silybin has been shown to be effective in treating liver disease in vitro and in vivo. Drugs and dietary supplements from milk thistle have appeared quite in the domestic market and in the world. Therefore, the standardization of this medicinal herbs – seeds Milk thistle and controlling the quality of their products is necessary. Objectives: This study aims to quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products by HPLC method. Materials and methods: The study subject was Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and corresponding products. Parameters for the quantitative procedure were determined. After that, the quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products on the market by HPLC method was developed and validated. The procedure was applied to determine Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and FY, ZE products. Results: The quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by HPLC method was developed and validated with parameters: column Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4.6 mm); warelenght detection of 288 nm, column temperature of 40 oC, injection volume of 10 µL, water – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0.5) was used as mobile phase A and water – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0.5) was used as mobile phase B at a gradient, flow rate 1 mL/min. The results illustrated that the procedure had selectivity, wide linearity, intra-day relative standard deviation was below 5%; accuracy with the recovery range was 90-110% for Silybin. The validated method was applied to determine Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn. seeds and their products on the market. The results also showed that Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn. seeds were about 1.79 mg/g of the dried material and in FY, ZE products were 49.17 mg and 40.82 mg /unit, respectively. Conclusion: The method for quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products was developed and evaluated effectively, was suitable for testing the quality of seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products. Key words: Silybum marianum (L.) Gaertn, Milk Thistle seeds, Silybin, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ: Cây Cúc gai (còn gọi là kế sữa, kế thánh, kế đức mẹ...), tên khoa học Silybum marianum (L.) Gaertn. là một loài thuộc họ Cúc (Asteraceae). Cúc gai đã được sử dụng làm thuốc bảo vệ gan mật từ lâu. Nhiều loại thuốc và thực phẩm chức năng từ Cúc gai được sử dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ và châu Âu cũng như nhiều nơi trên thế giới để chữa cải thiện chức năng của gan. Hơn thế, nghiên cứu gần đây trên thế giới đã cho thấy nhiều tác dụng dược lý khác như kháng HIV, chống oxy hóa, chống ung thư Thành phần hóa học của Cúc gai chứa flavonolignan đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị bệnh gan trên in vitro và in vivo. Flavonolignan chính trong Cúc gai là silymarin (1-4% thành phần quả khô). Silymarin là một hỗn hợp ít nhất 3 flavonolignan polyphenol gồm silybin, silydianin và silychristin, trong đó thành phần chính là silybin (khoảng 40%)(1). Cúc gai và các chế phẩm từ Cúc gai hiện đã được sử dụng rộng rãi như một phương thuốc dân gian điều trị các bệnh hiểm nghèo về gan, thận hiện đang phổ biến ở nước ta(5). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 514 Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai đang lưu hành trên thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe người dân là một vấn đề đang được quan tâm và rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ tình hình này, đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau: Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn và chế phẩm từ hạt Cúc gai bằng phương pháp HPLC. Thẩm định quy trình đã xây dựng và áp dụng để xác định hàm lượng silybin trong dược liệu (hạt Cúc gai) và một số chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Silybin có trong dược liệu và chế phẩm từ Cúc gai. Nguyên vật liệu, chất chuẩn, hóa chất, dung môi, trang thiết bị Nguyên liệu Hạt của cây Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn được thu mua năm 2017 của hãng Starwest Botanicals (nguồn gốc: Croatia). Hạt được sấy khô, xay thành bột thô. Mất khối lượng do làm khô của mẫu dược liệu được xác định là 6,87%. Các chế phẩm là thực phẩm chức năng chứa silymarin có nguồn gốc từ Cúc gai được thu mua trên thị trường: Viên nén bao phim FY (số lô 011), mỗi viên chứa: Silymarin 200 mg. Viên nang cứng ZE (số lô 030416), mỗi viên chứa: Silymarin 70 mg. Chất đối chiếu: Silybin do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh cung cấp, số lô: QT198 060717, hàm lượng 90,2%. Hóa chất, dung môi Petroleum ether, n-hexan, toluen, aceton, ethyl acetat, cloroform, acid formic, methanol, dùng loại AR do Trung Quốc sản xuất, một số hóa chất và thuốc thử thông thường khác trong phòng thí nghiệm. Các dung môi (methanol, acetonitril, acid phosphoric) loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck), nước cất hai lần dùng trong quy trình định lượng. Trang thiết bị Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998, cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), bộ chiết Soxhlet, bể siêu âm Elma, tủ sấy điện WM500CO, bếp cách thủy (Memmert), cân phân tích 5 số CP 225D (Sartorius) và dụng cụ thủy tinh thông thường khác trong phòng thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu Dựa vào DĐVN V(2), USP 41(4), áp dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo với hệ dung môi phân cực. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách của phương pháp được khảo sát bao gồm hệ pha động, cột sắc ký và số lần chiết. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp sẽ tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo ICH(3) và ứng dụng quy trình đã thẩm định vào việc định lượng silybin trong mẫu dược liệu hạt Cúc gai và chế phẩm. KẾT QUẢ Dựa vào kết quả khảo sát các điều kiện thực nghiệm như số lần chiết, chương trình gradient, hệ pha động, cột sắc ký, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện chuẩn bị mẫu và điều kiện sắc ký cho quy trình định lượng như sau: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 515 Chuẩn bị mẫu Mẫu thử (hạt Cúc gai) Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu vào túi giấy lọc rồi đặt vào bình chiết Soxhlet 250 ml có chứa 160 ml n-hexan (TT). Đun hồi lưu trên cách thủy trong 5 giờ, để nguội, loại bỏ lớp n-hexan, để bay hơi hoàn toàn dung môi ra khỏi dược liệu. Chuyển dược liệu và túi giấy lọc đựng dược liệu sang bình nón nút mài 100 ml, có chứa 70 ml ethyl acetat (EA). Đun hồi lưu trên cách thủy 1 giờ, thu lấy dịch chiết (làm 3 lần). Gộp dịch chiết 3 lần cho vào cốc 250 ml. Cô cách thủy đến cạn. Dùng methanol (TT) để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 100 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử (chế phẩm) Bỏ lớp bao phim, cân và nghiền thành bột 20 viên, tính khối lượng trung bình viên. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 100 mg silymarin vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml methanol, hòa tan bằng cách siêu âm trong khoảng 20 phút, bổ sung methanol (TT) đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10 ml cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu chuẩn Cân chính xác khoảng 28 mg chất đối chiếu silybin (hàm lượng 90,2%) vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH đến vạch để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ silybin là 2500 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc pha các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt khoảng 10 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm, để khảo sát khoảng tuyến tính khi thẩm định quy trình định lượng. Công thức tính kết quả: Hàm lượng Silybin có trong dược liệu được tính theo công thức sau: t c c S 100 x 100 1 X (mg/g) = x C x x S m 100 - h 1000 Trong đó: X: hàm lượng silybin có trong dược liệu khô kiệt (mg/g) St: Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu thử (µV.s) Sc: Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu chuẩn (µV.s) Cc: nồng độ silybin của mẫu chuẩn (µg/ml) m: khối lượng bột dược liệu cân được (g) h: hàm ẩm dược liệu (%) Hàm lượng Silybin có trong chế phẩm được tính theo công thức: Trong đó: X: hàm lượng silybin có trong 1 viên chế phẩm (mg/viên) St: Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu thử (µV.s) Sc: Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu chuẩn (µV.s) Cc: nồng độ silybin của mẫu chuẩn (µg/ml) mtb: khối lượng bột thuốc trong một đơn vị chế phẩm (g) a: khối lượng bột thuốc cân được (g) Khảo sát điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký thích hợp được lựa chọn: Cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), thể tích tiêm mẫu: 10 µL, nhiệt độ cột: 40 oC. Hệ pha động: Dung môi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5); Dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5) Chương trình Gradient: Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%) 0-5 1 85 15 5-20 1 85 → 55 15 → 45 20-50 1 55 45 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 516 Thẩm định quy trình định lượng Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 1: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống tR (phút) S (µV.s) Rs k T N Chuẩn Silybin A TB 32,33 1598199 - 11,21 1,08 42298 RSD% 0,17 2,34 - 0,21 0,75 5,04 Silybin B TB 34,56 1663731 3,42 12,07 1,12 38009 RSD% 0,17 2,29 2,18 0,18 0,67 4,34 Hạt Cúc gai Silybin A TB 32,33 994016 13,75 11,22 1,13 40440 RSD% 0,39 1,62 2,96 0,56 0,56 5,27 Silybin B TB 34,60 1621800 3,24 1,42 1,42 31595 RSD% 0,36 1,75 2,12 0,57 0,57 4,48 Chế phẩm Silybin A TB 32,47 1191277 - 11,28 1,08 42683 RSD% 0,31 1,75 - 0,34 0,51 6,36 Silybin B TB 34,76 20041066 3,32 12,14 1,40 32703 RSD% 0,27 2,00 2,43 0,30 1,46 5,35 Các thông số sắc ký của 6 lần tiêm mẫu chuẩn, 6 lần tiêm mẫu thử hạt Cúc gai và 6 lần tiêm mẫu thử chế phẩm có RSD% của thời gian lưu (tR) < 1%, của diện tích pic (Spic) < 3%, độ phân giải (Rs) > 1,5; hệ số kéo đuôi T nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5; số đĩa lý thuyết (N) > 10000. Như vậy quy trình có tính tương thích hệ thống. Khảo sát tính đặc hiệu Hình 1: Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 517 Thời gian lưu của các pic silybin A và silybin B trên sắc ký đồ của mẫu thử hạt Cúc gai và mẫu thử chế phẩm tương đương với thời gian lưu của các pic silybin A và silybin B trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với các pic chính trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích pic silybin A và silybin B đều tăng thêm so với trước khi thêm chuẩn. Như vậy, quy trình có tính đặc hiệu (hình 1). Khảo sát tính tuyến tính Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ silybin và diện tích pic, trong khoảng nồng độ khảo sát từ 10 đến 500 µg/ml; phương trình hồi qui: ŷ = 31133x, R² = 0,9969. Khảo sát độ chính xác Hàm lượng silybin trong 6 mẫu thử ngày thứ 2 có RSD% < 5% và hàm lượng silybin trong 12 mẫu thử ở cả 2 ngày của mẫu thử hạt Cúc gai và chế phẩm có RSD% < 5%. Bảng 2: Kết quả khảo sát độ chính xác Độ lặp lại Độ chính xác trung gian TB (n=6) RSD (%) (n=6) TB (n=6) RSD (%) (n=6) TB (n=12) RSD (%) (n=12) Hạt Cúc gai 1,84 3,32 1,84 2,90 1,84 2,97 Chế phẩm 58,57 2,62 57,69 1,00 58,13 2,06 Khảo sát độ đúng Từ kết quả trung bình khi đánh giá độ chính xác, xác định hàm lượng silybin trong mẫu thử dược liệu và chế phẩm. Sau đó tiến hành đánh giá độ đúng với lượng silybin đối chiếu thêm vào lần lượt là 80%, 100% và 120% hàm lượng các chất có trong mẫu. Tại mỗi mức chuẩn thêm vào thực hiện 3 mẫu độc lập phân tích theo quy trình đã xây dựng. Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng Mẫu Mức hàm lượng Silybin trong hạt Cúc gai Silybin trong chế phẩm Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỉ lệ phục hồi (%) Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỉ lệ phục hồi (%) 1 80% 680 686 101,0 2055 1973 96,0 2 680 678 99,8 2055 1978 96,2 3 680 701 103,1 2055 1850 90,0 1 100% 850 876 103,1 2580 2429 94,2 2 850 857 100,8 2580 2405 93,2 3 850 838 98,5 2580 2388 92,6 1 120% 1030 1009 98,0 3090 2801 90,6 2 1030 978 94,9 3090 2816 91,1 3 1030 1050 102,0 3090 2804 90,7 Tỷ lệ phục hồi trung bình 100,1 92,7 RSD% 2,7 2,5 Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi của silybin trong mỗi mẫu ở các mức nồng độ thẩm định từ 90% đến 110% và RSD% < 5%. Ứng dụng quy trình định lượng silybin Kết quả định lượng silybin trong mẫu hạt Cúc gai, chế phẩm FY là viên nén bao phim, chế phẩm ZE là viên nang cứng được trình bày trong bảng 5. Bảng 4: Kết quả định lượng silybin trong các mẫu thực nghiệm Mẫu Hàm lượng silybin Hạt Cúc gai 1, 79 (mg/g) Chế phẩm FY 49,17 (mg/viên) Chế phẩm ZE 40,82 (mg/viên) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 518 BÀN LUẬN Xử lý hạt Cúc gai trong quy trình chiết mẫu thử khó khăn vì hạt Cúc gai có chứa lượng dầu béo rất cao, khoảng 30%. Do đó, trước khi chiết flavonolignan phải tiến hành loại dầu béo nhiều lần bằng n-hexan. Sử dụng cột Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) để định lượng silymarin trong hạt Cúc gai theo DĐVN V và USP 40 trên máy HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998 cho thấy pic của các flavonolignan khác có trong cúc gai như silydianin (theo tỉ lệ thời gian lưu khoảng 0,73 so với pic silybin A) không đạt độ tinh khiết và độ phân giải (dính liền với pic của một chất chưa rõ có hàm lượng khá lớn), pic silychristin (tỉ lệ thời gian lưu khoảng 0,68 so với pic silybin A) cũng không đạt độ tinh khiết. Điều kiện phân tích bằng HPLC của DĐVN V đòi hỏi tổng thời gian phân tích lên tới 80 phút, của USP 40 là 55 phút. Do đó, quy trình định lượng được đề ra với thời gian phân tích ngắn hơn và cho độ phân giải, độ tinh khiết của các pic tốt hơn; cùng với thay đổi cách tính toán để đánh giá chất lượng dược liệu và chế phẩm qua hàm lượng silybin (tổng hàm lượng silybin A và silybin B). KẾT LUẬN Đã xây dựng được quy trình định lượng silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm. Kết quả thẩm định quy trình đã xây dựng về tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng cho thấy các quy trình đều có độ đặc hiệu tốt, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt và độ đúng với độ phục hồi phù hợp. Áp dụng các quy trình đã được thẩm định để xác định được hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai là 1,79 mg/g (tính trên dược liệu khô kiệt); trong các chế phẩm FY, ZE lần lượt là 49,17 mg và 40,82 mg trong 1 viên chế phẩm. Quy trình đã được xây dựng góp phần kiểm soát chất lượng của dược liệu hạt Cúc gai và các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahlam E, Ahlam E, Sameh A (2013), “Silymarin content in Silybum marianum fruits at different maturity stages”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 7 (23), pp. 1665-1669. 2. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 1129-1130. 3. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp. 1 - 13. 4. United States Pharmcopeial Convention, U.S. Pharmacopeia National Formulary USP 41 NF 36, (2018), Dietary Supplements: Milk Thistle 5. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 670-671. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019