Xây dựng quy trình định lượng Paclitaxel bằng phương pháp điện di mao quản

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 135 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PACLITAXEL BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Hứa Hoàng Oanh*, Nguyễn Phương Dung*, Trần Công Luận** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích mới ở Việt Nam và có nhiều ưu điểm so với HPLC như hiệu lực tách cao, ít tốn dung môi, ít độc hại và ô nhiễm môi trường. Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng paclitaxel bằng phương pháp điện di mao quản sẽ là một đóng góp vào dữ liệu khoa học, cũng như góp phần ứng dụng trong kiểm nghiệm chế phẩm có thành phần paclitaxel tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình định lượng paclitaxel bằng phương pháp điện di mao quản Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng quy trình định lượng paclitaxel chiết từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng với các điều kiện điện di: hệ thống điện di Agilent G7100A; đầu dò PDA; cột mao quản - silica gel nung chảy có chiều dài tổng 56 cm; chiều dài hiệu quả 50 cm, đường kính trong 50 µm. Điện thế: 20 kV. Nhiệt độ: 25oC. Bước sóng phát hiện: 227 nm. Dung dịch điện di nền: dinatritetraborat 50 mM, pH 10, methanol 10%. Thể tích tiêm mẫu: 50 mbar × 5s. Kết quả: Quy trình phân tích paclitaxel bằng phương pháp điện di mao quản đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại và độ đúng. Kết luận: Đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng paclitaxel trong cao chiết thông đỏ bằng phương pháp điện di mao quản. Từ khoá: điện di mao quản ASTRACT VALIDATING CAPILLARY ELECTROPHORESIS METHOD FOR THE DETERMINATION OF PACLITAXEL Hua Hoang Oanh, Nguyen Phuong Dung, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 135 – 140 Objectives: Capillary electrophoresis (CE) is a new analytical technique in Vietnam with many advantages over HPLC, such as high efficiency of separation, short analysis time, remarkably low injection volume, environmentally friendly. Therefore, construction of quantitative process paclitaxel using capillary electrophoresis will be a contribution to scientific data, as well as contributing applications to the determination of the products containing paclitaxel in Vietnam. The aim of this study was to establish the quantitative analysis of paclitaxel by mean of capillary electrophoresis. Materials and Methods: The determination of paclitaxel isolated from Taxus wallichiana Zucc. cultivated in Lam Dong province by CE was performed in a fused silica capillary with a total length of 56 cm, effective length of 50 cm, i.d 50 µm with G7100A – Agilent Life Sciences 7100 Capillary Electrophoresis Instrument. The applied voltage for the determination was +20 kV. A 50 mM sodium tetraborate solution (pH 10, 10% methanol) was used as a separation buffer. Volume of sample injection was 50 mbar × 5s. Results: The method was suitably validated with respect to linearity, accuracy, specificity, and linearity. Conclusion: Quantitative procedure of paclitaxel by using capillary electrophoresis was successfully *Khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Trường Đại học Tây Đô Tác giả liên lạc: ThS.BS. Hứa Hoàng Oanh ĐT: 0334205210 Email: hhoanh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 136 established and evaluated. Keywords: capillary electrophoresis ĐẶT VẤN ĐỀ Trong các thuốc trị ung thư thì paclitaxel là một hợp chất diterpen được phát hiện trong vỏ loài Thông đỏ Taxus brevifolia ở miền Bắc California vào năm 1967 và được FDA chính thức phê duyệt sử dụng trong điều trị ung thư vú vào năm 1992(3,4). Việt Nam đã và đang nghiên cứu trồng, chiết xuất paclitaxel và các taxoid có giá trị làm thuốc điều trị ung thư từ Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.). Bên cạnh đó, các nghiên cứu về kiểm nghiệm các hoạt chất cũng được tiến hành để góp phần khẳng định chất lượng nguồn dược liệu và các chế phẩm liên quan từ Thông đỏ lá dài Việt Nam. Trong các phương pháp kiểm nghiệm được nghiên cứu thì điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích mới ở Việt Nam và có nhiều ưu điểm so với HPLC nhờ hiệu lực tách tốt, ít tốn dung môi, ít độc hại và ô nhiễm môi trường. Đó là lý do đề tài này chọn ứng dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng paclitaxel chiết từ Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nguyên vật liệu Paclitaxel chuẩn (code T7402) mua từ Sigma- Aldrich. Số lô: MKBT3791V, độ tinh khiết trên nhãn là ≥ 95%. Paclitaxel chiết từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng do nhóm nghiên cứu ở Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. Dung môi, hóa chất nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết mua từ Merk (Đức): methanol, acetonitril, dinatri tetraborat, acid boric, natri hydroxyd. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát quy trình điện di Tiến hành khảo sát một số điều kiện điện di bằng cách thay đổi hệ đệm, pH đệm, nồng độ đệm và điện thế để tìm ra điều kiện mà tại đó pic paclitaxel đạt các yêu cầu về các thông số điện di. Điều kiện điện di thích hợp để định lượng paclitaxel Hệ thống điện di Agilent G7100A; đầu dò PDA; cột mao quản - silica gel nung chảy có chiều dài tổng 56 cm; chiều dài hiệu quả 50 cm, đường kính trong 50 µm. Điện thế: 20 kV. Nhiệt độ: 25oC. Bước sóng phát hiện: 227 nm. Dung dịch điện di nền: dinatritetraborat 50 mM, pH 10, methanol 10%. Thể tích tiêm mẫu: 50 mbar x 5s. Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn của Bộ Y tế(1) và ICH(2) gồm các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Nơi tiến hành thực nghiệm Bộ môn Hóa Phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. KẾT QUẢ Khảo sát tính phù hợp hệ thống Để đánh giá tính phù hợp hệ thống của chất đối chiếu, pha dung dịch đối chiếu loãng của paclitaxel có nồng độ 100 µg/ml. Tiến hành điện di 6 lần với điều kiện điện di đã chọn. Kết quả được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Bảng kết quả đánh giá tính phù hợp hệ thống trong mẫu chuẩn Số lần tm (phút) Corr.A (mAu) As 1 10,508 0,0456 2,0 2 10,471 0,0425 2,4 3 10,458 0,0427 2,5 4 10,413 0,0423 2,4 5 10,434 0,0438 2,3 6 10,888 0,0408 2,7 TB 10,529 0,0429 SD 0,087 0,0016 RSD 1,70 3,77 Các thông số về thời gian lưu và diện tích đỉnh trong bảng kết quả đều nằm trong giới hạn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 137 cho phép và có RSD <5% chứng tỏ quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Tiến hành điện di lần lượt mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu theo điều kiện điện di đã chọn (Hình 1, 2, 3, 4). Hình 1. Điện di đồ mẫu trắng Hình 2. Điện di đồ mẫu chuẩn Hình 3. Điện di đồ mẫu thử Hình 4. Điện di đồ mẫu thử thêm chuẩn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 138 Dựa vào điện di đồ và phổ UV, kết quả cho thấy: Mẫu trắng không xuất hiện pic của paclitaxel. Thời gian lưu của pic paclitaxel trong mẫu thử tương đương thời gian lưu của paclitaxel trong mẫu đối chiếu. Corr.A của paclitaxel trong mẫu thử thêm chất đối chiếu tăng lên so với lúc chưa cho chất đối chiếu. Phổ UV của paclitaxel ở mẫu thử, mẫu đối chiếu giống nhau. Như vậy, quy trình đạt độ đặc hiệu (Bảng 2, Hình 5). Bảng 2. Thời gian lưu của pic paclitaxel trong mẫu đối chiếu và mẫu thử Mẫu tm (phút) Mẫu đối chiếu 10,050 Mẫu thử 9,651 Tuy nhiên, do mẫu thử được chiết từ dược liệu nên vẫn còn pic tạp chất ngoài pic của paclitaxel. Hình 5. Phổ UV của pic paclitaxel trong mẫu đối chiếu và mẫu thử Tính tuyến tính Bảng 3. Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh được chuẩn hóa của paclitaxel Hỗn hợp 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 32 54 90 150 250 Corr.A 0,0243 0,0304 0,0398 0,0566 0,0805 Phương trình hồi quy: ŷ = 0,0003x + 0,0165, R 2 = 0,9988 Pha một dãy dung dịch chuẩn paclitaxel có nồng độ khoảng 32 – 250 µg/ml. Mỗi dung dịch sau khi lọc qua màng lọc 0,22 được tiêm vào hệ thống điện di CE-DAD và ghi lại các thông số kết quả trong Bảng 3. Kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa hàm lượng paclitaxel và diện tích đỉnh được chuẩn hóa trong khoảng tuyến tính: 32,4 – 250 g/ml; Phương trình hồi quy: ŷ = 0,0003x + 0,0165; Hệ số tương quan: R = 0,9993 (Hình 6). Hình 6. Đường biểu diễn tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh được chuẩn hóa của paclitaxel Độ lặp lại Tiến hành điện di trên 6 mẫu thử khác nhau theo điều kiện điện di đã xác định. Độ lặp lại được tính theo kết quả hàm lượng paclitaxel trong mẫu thử. Hàm lượng paclitaxel trong mẫu thử được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của paclitaxel (Bảng 4). Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đều nằm mẫu đối chiu mẫu thử Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 139 trong giới hạn cho phép là 5,3% đối với nồng độ chất phân tích ≥ 100 µg/ml của paclitaxel. Do đó, quy trình đạt độ lặp lại. Bảng 4. Kết quả khảo sát độ lặp lại Mẫu tm Corr.A Hàm lượng paclitaxel (µg/ml) 1 9,650 0,0485 106,64 2 9,641 0,0482 105,64 3 9,627 0,0477 103,90 4 9,884 0,0458 97,81 5 9,577 0,0455 96,73 6 9,624 0,0488 107,53 TB 9,667 0,0474 103,04 Mẫu tm Corr.A Hàm lượng paclitaxel (µg/ml) SD 0,109 0,0013 4,64 % RSD 1,13 2,68 4,51 e ± 5,33 Khoảng tin cậy µ = 103,04 ± 5,33 (µg/ml) Độ đúng Sử dụng phương pháp thêm chất đối chiếu paclitaxel vào mẫu thử. Nồng độ chất phân tích trong từng mẫu được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của paclitaxel. Kết quả được trình bày ở bảng khảo sát độ đúng của paclitaxel (Bảng 5). Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng Nồng độ thêm vào (µg/ml) Tỷ lệ (%) Nồng độ tìm lại (µg/ml) Tỷ lệ phục hồi (%) TB (%) RSD (%) RSD (%) 80 80 81,18 101,48 101,21 1,82 3,01 80 79,40 99,26 80 82,32 102,91 100 100 97,66 97,66 98,49 1,02 100 99,61 99,61 100 98,19 98,19 120 120 114,80 95,67 94,95 1,09 120 114,51 95,43 120 112,52 93,77 Hình 7. Điện di đồ các mẫu khảo sát độ đúng thêm 80% chất đối chiếu Thêm 100% chất đối chiếu Thêm 120% chất đối chiếu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 140 Bảng kết quả khảo sát độ đúng cho thấy tỉ lệ phục hồi của hàm lượng paclitaxel nằm trong khoảng giới hạn cho phép là 90 - 107% với nồng độ chất phân tích ≥ 100 µg/ml (hay 100 ppm). Kết quả thu được chứng tỏ quy trình đạt độ đúng. Dựa trên các kết quả đánh giá đã thực hiện, quy trình định lượng paclitaxel bằng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu này đã đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng (Hình 7). BÀN LUẬN Hiện nay, bên cạnh phương pháp định lượng paclitaxel bằng phương pháp HPLC thì các nhà nghiên cứu còn phát triển các phương pháp định lượng khác như điện di mao quản (CE), hay UPLC. Vì vậy, nghiên cứu này đã xây dựng quy trình định lượng paclitaxel chiết từ lá thông đỏ lá dài được trồng ở Lâm Đồng bằng phương pháp điện di mao quản. Quy trình định lượng đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng theo hướng dẫn của Bộ Y tế(1) và ICH(2). Phương pháp điện di mao quản có ưu điểm hơn so với phương pháp HPLC khi định lượng paclitaxel trong các nghiên cứu trước đây đó là sử dụng lượng dung môi hữu cơ ít hơn (methanol 10%) nên tiết kiệm chi phí, thân thiện môi trường hơn. Tuy nhiên, quy trình định lượng trong nghiên cứu này chưa phải là tối ưu do thông số hệ số bất đối của pic paclitaxel trong mẫu đối chiếu chưa đạt yêu cầu. Tăng nồng độ của dung dịch điện di nền là một trong những phương pháp để cải thiện hệ số bất đối của chất phân tích, vì thông số này phụ thuộc rất nhiều vào linh độ điện di. Nhưng, nồng độ của dung dịch điện di nền quá cao cũng có thể làm tăng độ nhớt và kéo dài thời gian phân tích. Vì thế, hiện nay phương pháp điện di mao quản chỉ mới áp dụng trong nghiên cứu mà chưa được phát triển để ứng dụng rộng rãi trong định lượng paclitaxel như phương pháp HPLC. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã xây dựng và áp dụng phương pháp điện di mao quản và những dung môi thông dụng để phân tích paclitaxel chiết từ lá thông đỏ lá dài. Quy trình định lượng paclitaxel đã xây dựng được thẩm định đáp ứng các yêu cầu theo hướng dẫn của ICH về độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại với khoảng tuyến tính của paclitaxel là 32 - 250 µg/ml. Các bước tiến hành đơn giản, thời gian phân tích hợp lý. Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Bộ môn Hóa phân tích và Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ chúng tôi hoàn thành đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2013). Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc. NXB Y Học, PL.8, pp.1-60. 2. ICH Harmonised tripartite guideline (2005). Validation of analytical procedures: text and methodology. ICHH, pp.1-13. 3. Panchagnula R (1998). "Pharmaceutical aspects of paclitaxel". International Journal of Pharmaceutics, 172:1-15. 4. Wani MC, Taylor HL, Wall ME (1971). "Plant antitumor agents: VI. The isolation and structure of Paclitaxel, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia". Journal of the American Chemical Society, 93(9):2325-2327. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019