Xây dựng quy trình định lượng geniposid trong cao khô dành dành bằng phương pháp hplc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 132 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID TRONG CAO KHÔ DÀNH DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Trần Thanh Tâm*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) được sử dụng từ bao đời nay với tác dụng điều trị tăng huyết áp. Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng nguyên liệu cao khô Dành dành trước khi đưa vào sản xuất thành phẩm. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV Pharma cung cấp. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký như pha động, cột sắc ký để phân tách geniposid trong cao khô Dành dành; Khảo sát một số điều kiện chiết gineposid trong cao khô Dành dành như dung môi chiết, tỷ lệ cao và dung môi, thời gian chiết siêu âm; Thẩm định quy trình định lượng geniposid trong cao khô dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH bao gồm tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ bền. Kết quả: Đã xác định được được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD như sau: cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), bước sóng phát hiện 240 nm, pha động acetonitril – nước (15:85), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 - 193,8 ppm) và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD = 0,57%), độ chính xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 100,27 – 101,46% và độ bền với sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril trong pha động là ± 4%. Kết luận: Quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD đã được xây dựng và thẩm định thành công. Quy trình này có thể được áp dụng để định lượng geniposid trong cao khô Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu. Từ khóa: Gardenia Fructus, geniposid ABSTRACT DEVELOPMENT OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF GENIPOSIDE IN GARDENIA FRUCTUS DRY EXTRACT Tran Thanh Tam, Nguyen Duc Hanh, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 132 – 142 Background – Objectives: Gardenia Fructus has iridoid glycosides as the special chemical components in which geniposide and gardenoside have high content. Gardenia Fructus have been used for *Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Đồng Tháp **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Bệnh viện Y học cổ truyền TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 Email: ductuan@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 133 treatment of hypertension for many years. In the Chinese Pharmacopoeia, the quality control index of Gardenia jasminoides is the content of geniposide. So far, there has been no publication for quantitative determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract. Therefore, this study was carried out with the aim of HPLC method development for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract that contribute to quality control of the input herbal materials. Method: The object of this study is Gardenia Fructus dry extract, which was supplied by BV Pharma joint-stock company. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase and C18 column with different suppliers for separation of geniposide in Gardenia Fructus dry extract, and several extraction conditions such as solvent, ratio of solvent and dry extract, and extraction time by ultrasonic, were investigated. Finally, the analytical procedure was validated according to ICH guidelines, including system suitability, selectivity, linearity and range, precision, accuracy and ruggedness. Results: The appropriate chromatographic conditions for quantification of geniposide in Gardenia Fructus dry extract were obtained on Gemini-NX C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), DAD detector with detection wavelength at 240 nm, mixture of acetonitrile and water (15:85) as mobile phase, injection volume of 20 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear (ŷ = 0.4761x, R2 = 1.0000, 19.4 – 193.8 ppm) and range (61 – 92 ppm), repeatability (RSD = 0.57%), intermediate precision (RSD = 0,49%), accurate with the recoveries in the range of 100.27 – 101.46% of the expected values. The method was also ruggedness with the accepted fluctuation of acetonitrile within  4% in mobile phase. Conclusion: The RP-HPLC method for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract was successfully developed and validated. The method can be applied for quantification of geniposide in Gardenia Fructus dry extracts that contribute to quality control of the input herbal materials. Keywords: Gardenia Fructus, geniposide. ĐẶT VẤN ĐỀ Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis., Rubiaceae), một loài cây được trồng và phát triển rất tốt ở các tỉnh miền Bắc nước ta, nổi bật bởi màu lá xanh bóng và hoa thơm trắng ngần. Đặc biệt, quả Dành dành với thành phần hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) đã được sử dụng từ lâu đời như một phương thuốc quý trong việc điều trị các bệnh như viêm gan, hạ huyết áp, đái tháo đường, lợi tiểu(4)Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng nguyên liệu cao khô Dành dành trước khi đưa vào sản xuất thành phẩm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV Pharma cung cấp. Nguyên vật liệu Chất đối chiếu Geniposid (GP), hàm lượng 99,26%, do Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Trang thiết bị Hệ thống UHPLC Dionex Ultimate 3000, detector DAD – 3000 RS, cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) và tiền cột Gemini NX C18 (4,0 x 3,0 mm; 5 µm), cột Zorbax XDB C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) và tiền cột Zorbax Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 134 XDB C18 (12,5 x 4,6 mm; 5 μm), cân phân tích A&D GH-202, bể siêu âm S60H – Elma. Hóa chất và dung mô Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Merck) và nước cất 2 lần đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện HPLC định lượng geniposid trong cao khô Dành dành: Dựa vào cấu trúc hóa học của GP và tham khảo một số tài liệu(3,5), kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với đầu dò DAD đã được lựa chọn với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) và tiền cột tương ứng, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát hiện là bước sóng hấp thụ cực đại của geniposid, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha động: acetonitril – nước. Tiến hành khảo sát pha động và cột sắc ký. Qua các khảo sát thực nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp sao cho pic geniposid đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis), tách hoàn toàn khỏi các pic tạp (nếu có) và có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Khảo sát quy trình xử lý mẫu Khảo sát dung môi chiết GP Chiết cùng một lượng cao với các dung môi khác nhau như methanol, methanol 70%, 50%, 30% (tỷ lệ cao và dung môi chiết cố định) bằng siêu âm trong 10 phút, chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng dung môi. Tiến hành sắc ký các dịch chiết. Chọn dung môi chiết GP theo các tiêu chí sau: diện tích pic và chiều cao pic lớn nhất, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải lớn hơn 1,5; pic GP tinh khiết (theo phổ UV-Vis) và nồng độ methanol cao. Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được lựa chọn theo các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:4. Chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng tỷ lệ và chiết bằng phương pháp siêu âm trong 10 phút. Tiến hành sắc ký dịch chiết. Chọn tỷ lệ cao và dung môi chiết theo tiêu chí sau: hàm lượng GP chiết được cao nhất và chiều cao pic GP trong khoảng 0,2 – 0,8 AU. Khảo sát thời gian chiết Từ tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm ở các thời điểm 3, 5, và 10 phút. Chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng thời điểm. Tiến hành sắc ký các dịch chiết. Chọn thời gian chiết cho hàm lượng GP chiết được cao nhất. Thẩm định quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành Quy trình định lượng geniposid trong cao Dành dành được thẩm định theo hướng dẫn của ICH(2) về tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ bền. Chuẩn bị mẫu Mẫu đối chiếu GP gốc: Hòa tan một lượng chất đối chiếu GP trong methanol 50% để được dung dịch có nồng độ khoảng 2600 ppm. Mẫu đối chiếu GP: Pha loãng mẫu đối chiếu GP gốc với methanol 50% để thu được mẫu đối chiếu GP có nồng độ khoảng 77,5 ppm. Mẫu thử: Được chuẩn bị dựa vào các điều kiện khảo sát quy trình xử lý mẫu. Mẫu trắng: dung môi chiết và pha động. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện HPLC định lượng geniposid trong cao khô Dành dành Tiến hành khảo sát pha động acetonitril và nước với các tỷ lệ khác nhau. Hình 1 minh họa sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV tại thời gian lưu của GP với tỷ lệ pha động acetonitril – nước (15:85). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 135 Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV tại thời gian lưu của GP. Nhận xét: Phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu đối chiếu có một cực đại hấp thụ tại 240 nm nên được lựa chọn để định lượng GP. Pic GP đạt độ tinh khiết (peak purity match = 1000), có hệ số bất đối là 1,1 và tách hoàn toàn các pic tạp khác. Như vậy, pha động ACN – H2O (15:85) được lựa chọn. Hình 2 và Bảng 1 minh họa kết quả khảo sát cột sắc ký pha đảo C18 từ hai nguồn cung cấp khác nhau. Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát cột sắc ký Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 136 Bảng 1: Thông số sắc ký của GP tương ứng với cột sắc ký khảo sát (n=3) Cột tR (Phút) S (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết Zorbax XDB C18 7,047 75,825 377,258 1,4 3,4 4,9 8765 1000 Gemini NX C18 7,389 75,653 442,885 1,1 3,4 4,7 12538 1000 Rs1: độ phân giải giữa GP và pic liền trước. Rs2: độ phân giải giửa GP và pic liền sau. Nhận xét: Pic GP đạt độ tinh khiết, có thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) và độ phân giải không khác nhau nhiều giữa hai cột. Với cột Gemini NX C18, hệ số bất đối (As) pic GP là 1,1; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) lớn hơn, chiều cao pic (H) GP gấp 1,2 lần so với cột Zorbax XDB C18. Như vậy, cột Gemini NX C18 được lựa chọn. Khảo sát quy trình xử lý mẫu Khảo sát dung môi chiết GP Hình 3 và Bảng 2 minh họa kết quả khảo sát dung môi chiết GP. Dung môi chiết Hàm lượng GP (mg/g) Methanol 116,84 Methanol 70% 128,56 Methanol 50% 142,24 Methanol 30% 142,19 Hình 3: Hàm lượng GP chiết được với các dung môi chiết khác nhau Bảng 2: Thông số sắc ký của GP tương ứng với dung môi chiết khảo sát (n=3) Dung môi tR (phút) S (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết Methanol 7,328 31,528 157,172 0,94 4,0 3,5 8878 1000 Methanol 70% 7,343 34,688 201,762 1,05 4,5 4,6 12194 1000 Methanol 50% 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000 Methanol 30% 7,355 38,162 227,243 1,07 4,4 4,8 12808 1000 Nhận xét: Cả 4 dung môi methanol, methanol 70%, 50%, 30% đều chiết được GP, tuy nhiên diện tích và chiều cao pic GP chiết được tăng dần theo thứ tự methanol < methanol 70% < methanol 50 %  methanol 30%; Pic GP đều tinh khiết, đạt hệ số bất đối và tách hoàn toàn các pic tạp. Như vậy, methanol 50% được chọn làm dung môi chiết GP trong cao Dành dành. Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP Hình 4 và Bảng 3 minh họa kết quả khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP. Tỷ lệ cao và dung môi (mg/ml) Hàm lượng GP (mg/g) 1:1 142,27 1:2 142,24 1:4 142,36 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 137 Hình 4: Hàm lượng GP chiết được với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau Bảng 3: Thông số sắc ký của GP tương ứng với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau (n=3) Tỷ ̣̉ lệ cao và dung môi chiết (mg/ml) tR (Phút) S (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 1:1 7,344 76,931 448,304 1,06 4,6 4,7 12781 1000 1:2 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000 1:4 7,343 19,129 114,887 1,06 4,6 5,2 12915 1000 Nhận xét: Các thông số sắc ký của GP đều đạt và hàm lượng GP chiết được với các tỷ lệ cao và dung môi chiết khảo sát đều tương đương nhau, khi tiến hành sắc ký dịch chiết lần 2 không phát hiện GP, chứng tỏ GP đã được chiết kiệt từ cao khô Dành dành. Với tỷ lệ cao và dung môi chiết 1:2, chiều cao pic GP khoảng 227 mAU là cao nhất khi qui về tỷ lệ cao và dung môi chiết 1:1. Ngoài ra, tín hiệu chiều cao khoảng 0,23 AU cũng là tín hiệu nằm trong khoảng tuyến tính theo định luật Lambert-Beer khi sử dụng đầu dò DAD và thích hợp cho quá trình định lượng trên nền cao dược liệu. Như vậy, tỷ lệ cao và dung môi chiết 1:2 được lựa chọn. Khảo sát thời gian chiết siêu âm Hình 5 và Bảng 4 minh họa kết quả khảo sát thời gian chiết GP trong cao Dành dành. Thời gian chiết siêu âm Hàm lượng GP (mg/g) 3 phút 142,24 5 phút 142,15 10 phút 142,24 Hình 5: Hàm lượng GP chiết được với thời gian chiết khác nhau Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 138 Bảng 4: Thông số sắc ký của GP tương ứng với thời gian chiết khác nhau (n=3) Thời gian chiết siêu âm tR (Phút) S* (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 3 phút 7,344 38,330 228,556 1,06 4,6 4,7 12781 1000 5 phút 7,341 38,407 228,172 1,05 4,7 4,8 12690 1000 10 phút 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000 Nhận xét: Hàm lượng GP chiết được với thời gian chiết khảo sát đều tương đương nhau. Như vậy, thời gian chiết siêu âm 3 phút được lựa chọn. Tóm lại, geniposid trong cao khô Dành dành được chiết với tỷ lệ cao và methanol 50% là 1:2, chiết 1 lần bằng phương pháp siêu âm trong 3 phút. Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng GP trong cao khô Dành dành là cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), đầu dò DAD với bước sóng phát hiện 240 nm, thể tích tiêm 20 μl, pha động ACN – H2O (15:85, tt/tt), tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian sắc ký 11 phút. Thẩm định quy trình Tính phù hợp hệ thống Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu đối chiếu GP và mẫu thử (n=6) Mẫu Giá trị thống kê tR (Phút) S (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk Đối chiếu TB 7,373 37,028 218,613 1,1 12791 RSD 0,10% 0,14% 0,30% Thử TB 7,373 36,686 216,835 1,1 4,5 7,2 12712 RSD 0,13% 0,09% 0,39% 0 Nhận xét: RSD của thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic GP của mẫu đối chiếu và mẫu thử đều nhỏ hơn 2,0%; Độ phân giải pic GP trong mẫu thử lớn hơn 1,5 và hệ số bất đối pic GP nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành đạt tính phù hợp hệ thống. Tính chọn lọc Hình 6 minh họa kết quả khảo sát tính chọn lọc của quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành. Kết quả khảo sát tính chọn lọc cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic GP trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương đương với pic GP trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic GP tách hoàn toàn các pic tạp. Khi thêm chất đối chiếu GP vào mẫu thử thì diện tích và chiều cao pic GP tăng. Phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử và mẫu đối chiếu giống nhau và có cùng cực đại hấp thụ tại 240 nm. Pic GP trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu và mẫu thử đều tinh khiết (theo phổ UV). Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành đạt tính chọn lọc. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 139 Hình 6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương pháp định lượng GP. (a)mẫu trắng, (b) mẫu đối chiếu, (c) mẫu thử, (d) mẫu thử thêm chất đối chiếu, (e) phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu đối chiếu, (f) phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử, (g) sắc ký đồ 3 chiều mẫu đối chiếu, (h) sắc ký đồ 3 chiều mẫu thử Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 140 Tính tuyến tính Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ GP được trình bày trong Bảng 6. Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tuyến tính GP Nồng độ GP (ppm) - X Diện tích pic (mAU*phút) - Y y = 0,4761x + 0,0037 R2 = 1,0000 19,4 9,222 38,8 18,393 77,5 36,973 116,3 55,384 155,0 73,871 193,8 92,198 Nhận xét: Hệ số b = 0,0037 có p = 0,94 > 0,05 nên không có ý nghĩa. Hệ số tương quan bình phương r2 = 1,0000  có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ GP và diện tích pic. Vậy phương trình hồi quy xác định nồng độ GP theo diện tích pic là ŷ = 0,4761x. Độ chính xác Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng GP trong cao Dành dành được trình bày trong Bảng 7. Bảng 7: Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành (n=9) n Người phân tích 1 Ngày phân tích: 21/05/2018 Hệ thống HPLC: Ultimate 3000 Người phân tích 2: Ngày phân tích: 22/05/2018 Hệ thống HPLC: Ultimate 3000 Khối lượng cao (mg) Diện tích pic (mAU*phút) Hàm lượng GP (mg/g) Khối lượng cao (mg) Diện tích pic (mAU*phút) Hàm lượng GP (mg/g) 1 19,8 28,386 150,0 20,3 28,748 151,3 2 19,9 28,353 149,1 20,4 28,828 151,0 3 19,7 28,294 150,3 20,3 28,821 151,7 4 24,6 35,278 150,1 25,4 35,867 150,9 5 24,6 35,248 150,0 25,5 35,908 150,5 6 24,5 35,261 150,6 25,2 35,741 151,6 7 29,9 43,253 151,4 31,2 43,802 150,0 8 29,9 43,249 151,4 31,5 44,567 151,2 9 29,8 43,214 151,8 31,2 44,141 151,2 Trung bình: 150,5 (mg/g) RSD: 0,57% Trung bình: 151,1 (mg/g) RSD: 0,37% Kết quả phân tích của 02 người phân tích - Trung bình: 150,8 (mg/g) - RSD: 0,49% Độ sai khác kết quả định lượng trung bình - Giữa hai người phân tích: 0,26% - Giữa người phân tích với kết quả trung bình của cả hai người phân tích + Người phân tích 1: -0,18% + Người phân tích 2: +0,08% Nhận xét: RSD của hàm lượng GP trong cao khô Dành dành của 9 mẫu thử của từng người phân tích đều nhỏ hơn 2,0%; Độ sai lệch hàm lượng GP giữa 2 người phân tích đều nhỏ hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành đạt độ chính xác. Độ đúng Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng GP trong cao Dành dành được trình bày Bảng 8. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 141 Bảng 8: Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành (n=9) Mẫu n Khối lượng cao (mg) Lượng chất đối chiếu thêm vào (mg) Diện tích pic (mAU*phút) Lượng chất đối chiếu tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 80% 1 25,0 3,10 65,486 3,11 100,47 2 25,1 3,10 65,422 3,09 99,77 3 25,0 3,10 65,506 3,12 100,54 TB 100,26 RSD 0,43% 100% 1 25,1 3,76 72,259 3,81 101,35 2 25,0 3,76 72,305 3,83 101,88 3 25,3 3,76 72,271 3,78 100,58 TB 101,27 RSD 0,64% 120% 1 25,1 4,52 79,563 4,58 101,28 2 25,0 4,52 79,464 4,58 101,38 3 24,9 4,52 79,469 4,60 101,73 TB 101,46 RSD 0,23% Nhận xét: Tại mỗi mức nồng độ, tỷ lệ thu hồi đều nằm trong khoảng 98 – 102% và RSD của GP tại mỗi mức nồng độ đều nhỏ hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành đạt độ đúng. Dựa theo kết quả thẩm định độ chính xác và độ đúng, miền giá trị của quy trình định lượng từ 61 – 92 ppm. Độ bền Kết quả thẩm định độ bền được trình bày trong Hình 7 và Bảng 9. Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử cao Dành dành trong thẩm định độ bền Bảng 9: Thông số sắc ký của GP trong thẩm định độ bền (n=3) Pha động ACN – H2O (tt/tt) Giá trị thống kê tR (Phút) S (mAU*phút) H (mAU) As Rs1 Rs2 Nbk 11:89 TB 14,496 34,962 100,430 1,1 5,3 5,5 11621 RSD 0,11% 0,08% 0,63% 19:81 TB 4,722 35,462 350,982 1,1 1,5 4,4 14345 RSD 0,21% 0,12% 0,47% Nhận xét: Khi thay đổi tỷ lệ ACN ± 4% so với điều kiện pha động ban đầu thì các thông số sắc ký vẫn đáp ứng yêu cầu về tính phù hợp hệ thống. Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc, khoảng tuyến tính rộng, đạt độ chính xác và độ đúng theo Hướng dẫn của ICH. BÀN LUẬN Phổ UV tại thời gian lưu của GP trong khoảng bước sóng 200 – 400 nm có 1 cực đại Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 142 hấp thụ tại 240 nm, nên được chọn làm bước sóng để định lượng GP, bước sóng này tương tự với bước sóng được sử dụng để định lượng GP trong dịch chiết quả Dành dành(1,3,5). Kết quả khảo sát cột sắc ký cho thấy cột Gemini NX C18 thích hợp hơn cho quá trình định lượng GP trong cao khô Dành dành so với cột Zorbax Eclipse XDB C18 (chỉ ổn định trong khoảng pH 2 – 9). Điều này có thể được giải thích là do cột Gemini được sản xuất theo công nghệ TWIN - NX (Two-In-One): trong giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất hạt silica, một lớp silica hữu cơ đặc biệt được thêm vào để tạo ra một loại hạt hoàn toàn mới với cấu trúc silica bên trong không bị biến đổi nên vẫn duy trì được độ bền cơ học để cho hiệu năng tốt, trong khi lớp silica hữu cơ bên ngoài sẽ bảo vệ các phân tử silica khỏi các tác nhân hóa học. Những liên kết chéo silosan được thay thế bằng liên kết với gốc ethylen nên giúp hạt silica bền vững hơn trong môi trường pH cao. Thêm vào đó, việc liên kết giữa nhóm trimethylsilosan và nhóm silanol tự do dẫn đến nhóm silanol không thể tương tác với chất phân tích nên cải thiện tình trạng pic bị kéo đuôi. Cao khô Dành dành được chiết bằng dung môi nước, nên dung môi methanol với các nồng độ khác nhau (100%, 70%, 50%, 30%) được sử dụng làm dung môi chiết xuất GP để giảm tạp phân cực, nồng độ methanol càng cao, tạp phân cực trong dịch chiết sẽ càng giảm. Các kết quả khảo sát ban đầu trong việc lựa chọn dung môi chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy các dịch chiết có cường độ màu của vết GP, số lượng tạp và cường độ màu của tạp không khác nhau. Tuy nhiên, khi phân tích các dịch chiết bằng phương pháp HPLC đã thấy sự khác biệt về hàm lượng GP chiết được của các dung môi. KẾT LUẬN Quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC với đầu dò DAD đã được xây dựng và thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng và pha động đơn giản (acetonitril và nước). Quy trình đã được chứng minh đạt tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, tính tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 – 193,8 ppm) và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD = 0,57%), độ chính xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 100,27 – 101,46% và độ bền với sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril trong pha động là ± 4%. Quy trình này có thể được áp dụng để định lượng geniposid trong cao khô Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V, tr. 1132-1133. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, Hà Nội. 2. ICH Harmonised tripartite guideline (2005). Validation of analytical procedures: text and methodology, pp. 1 – 13. 3. Pharmacopedia of The people’s Republic of China (2015), pp. 182-183, 207-208. 4. Viện Dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, tr. 596-600, 800-807. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 5. Wang XS, Wu YF, Dai SL, Chen R, Shao Y (2012). Ultrasound-assisted extraction of geniposide from Gardenia jasminoides. Ultrasonics Sonochemistry, 19: pp. 1155–1159. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019