Xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 378 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METHYL PARABEN VÀ PROPYL PARABEN TRONG VỎ NANG MỀM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Trương Quốc Kỳ*, Võ Hoàng Nam**, Nguyễn An Công**, Đặng Minh Đức** TÓM TẮT Mở đầu: Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản được sử dụng phổ biến trong dược phẩm và mỹ phẩm. Các hợp chất này chủ yếu được sử dụng do khả năng diệt khuẩn và diệt nấm của chúng. Methyl paraben và propyl paraben thường được sử dụng làm chất bảo quản trong vỏ nang mềm. Trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) V không có quy định về giới hạn này trong vỏ viên nang mềm, trong USP 41 giới hạn này được quy định phải dưới 120%. Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò PDA. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Vỏ viên nang mềm có chứa đồng thời hai chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben. Các chất bảo quản này được chiết và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò PDA. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quả tách và tốc độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như tốc độ dòng, thành phần và tỷ lệ dung môi pha động. Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên nang mềm bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), pha động gồm methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt), bước sóng phát hiện 272 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút và nhiệt độ cột 40 0C. Kết quả định lượng cho thấy quy trình có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính từ 3,94 – 13,80 µg/ml cho methyl paraben và từ 1,98 – 6,94 µg/ml cho propyl paraben, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác. Kết luận: Đề tài này đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm. Quy trình này đã được áp dụng để định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm của viên Vitar C và viên Cetiboston. Từ khóa: methyl paraben, propyl paraben, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), vỏ nang mềm ABSTRACT SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF METHYL PARABEN AND PROPYL PARABEN IN SOFT CAPSULE SHELL BY HPLC WITH PDA DETECTOR Truong Quoc Ky, Vo Hoang Nam, Nguyen An Cong, Dang Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 378-383 Background: Parabens are a class of preservatives that are widely used in cosmetic and pharmaceutical products. These compounds are mainly used for their bactericidal and fungicidal properties. Methyl paraben and propyl paraben are commonly used as preservatives in soft capsule shell. In Vietnamese pharmacopoeia V, regulation of parabens in the soft capsule shell is not yet available. In USP 41, Limited of parabens should be below 120%. *Bộ môn hóa chuyên ngành, Khoa Dược, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. **Công ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam Tác giả liên lạc: TS. DS. Trương Quốc Kỳ ĐT: 0936723672 Email: quockypharma7@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 379 Objectives: The aim of study was to develop a HPLC-PDA method for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in soft capsule shell. Methods and Subject: The subject of this study was a soft capsule shell containing methyl paraben and propyl paraben. These parabens were extracted and determined by HPLC with PDA detector. Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity. Results: The appropriate chromatographic condition were found out for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben, using a Luna C18 (150 × 4.6 mm; 5 µm), mixture of methanol and phosphate buffer (55:45, tt/tt) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection wavelength of 272 nm and column temperature of 40 0C. The method was shown high selectivity, wide linearity range from 3.94 – 13.80 µg/ml for methyl paraben and from 1.98 – 6.94 µg/ml for propyl paraben. Intra-day standard devitation was below 2% and the recovery range was 98% - 102%. Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully develop for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule shell. The validated method was applied for quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule of Vitar C and the soft capsule of Cetiboston. Keyword: methyl paraben, propyl paraben, HPLC, soft capsule shell ĐẶT VẤN ĐỀ Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời. Về mặt hóa học, parabens là một loạt các este của acid parahydroxybenzoic hay còn được gọi là acid 4-hydroxybenzoic. Các hợp chất này chủ yếu được sử dụng do khả năng diệt khuẩn và diệt nấm của chúng(1) và hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm. Methyl paraben và propyl paraben được sử dụng làm chất bảo quản trong vỏ nang mềm. Gần đây có nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất parabens có thể hoạt động tương tự như hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể. Các hoạt động này có liên quan nhất định đến bệnh ung thư vú(2). Trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) V không có quy định về giới hạn này trong vỏ viên nang mềm, trong USP 41 giới hạn này được quy định phải dưới 120%(3). Vì những lý do trên, việc kiểm soát các chất bảo quản parabens trong vỏ nang mềm là rất cần thiết. Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình phân tích định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Vỏ nang mềm có chứa chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben. Trang thiết bị, hóa chất, dung môi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu LC-20AD với đầu PDA. Máy đo pH Shott 850. Cân phân tích Sartorius BP221S. Bể siêu âm Elma. Và Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích. Hóa chất dung môi Chuẩn methyl paraben (viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh) hàm lượng 99,90% và propyl paraben (viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh) hàm lượng 99,90%. Methanol đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Scharlau). Ethanol, kali dihydrophosphat, acid hydrocloric, natri hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc của các parabens và tham khảo Dược điển Mỹ (USP 41)(3), kỹ thuật sắc ký Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 380 lỏng pha đảo được áp dụng với pha động bao gồm dung dịch đệm phosphate và methanol, sắc ký đồ được ghi ở bước sóng 272 nm với tốc độ dòng 1,0 ml/phút với nhiệt độ cột là 40 0C. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp được khảo sát như dung môi pha động và tỉ lệ pha động được khảo sát và tối ưu để có hệ số bất đối As từ 0,8 – 1,5 và có hệ số phân giải Rs ≥1,5. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, sẽ tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của ICH(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Sau khi được thẩm định, quy trình được ứng dụng để định lượng một số vỏ nang của chế phẩm viên nang mềm trên thị trường có chứa các chất bảo quản này. Mức chất lượng áp dụng theo USP 41. Chuẩn bị mẫu và dung dịch đệm Dung dịch đệm Dung dịch đệm kali dihydrophosphat: cân chính xác khoảng 6,8 g kali dihydrophosphat hòa tan trong 1000 ml nước. Chuẩn bị mẫu Dung môi pha mẫu Ethanol – nước (70: 30, tt/tt). Dung dịch gốc Dung dịch chuẩn gốc methyl paraben: Cân chính xác khoảng 49,5 mg chuẩn methyl paraben vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Dung dịch chuẩn gốc propyl paraben: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn propyl paraben vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Dung dịch chuẩn hỗn hợp Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl paraben và lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc propyl paraben vào bình định mức 100 ml và thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử Cân 20 viên, loại bỏ dịch thuốc trong nang, lau sạch vỏ nang, xác định khối lượng trung bình vỏ nang mềm, cắt nhỏ vỏ nang. Cân chính xác khoảng 240,0 mg vỏ nang mềm (tương ứng 1/2 nang) đã cắt nhỏ cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 30 ml nước, thêm 1 ml acid hydrocloric đậm đặc, đun cách thủy ở 60 oC khoảng 15 phút, thỉnh thoảng lắc, để nguội, thêm 2 ml dung dịch natri hydroxyd 5 M và bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ethanol 96%, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Mẫu trắng Dung môi pha mẫu. Mẫu placebo Vỏ nang không có chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben được chuẩn bị tương tự mẫu thử. KẾT QUẢ Điều kiện sắc ký Với điều kiện HPLC Pha động: methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt). Cột sắc ký: Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm). Nhiệt độ cột: 40 0C. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Thể tích bơm mẫu: 50 μl. Bước sóng phát hiện: 272 nm. Thì phù hợp cho việc định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 381 nang mềm vì có hệ số bất đối của các pic đều nằm trong khoảng từ 0,8 – 1,5 và có hệ số phân giải Rs ≥1,5. Kết quả các thông số sắc ký của các pic được ghi trong Bảng 1. Bảng 1. Các thông số sắc ký của pic methyl paraben và propyl paraben Thông số Chất Thời gian lưu (tR) (phút) Diện tích píc (S) AS Rs Methyl paraben 4,037 614248 1,15 3,62 Propyl paraben 9,267 271694 1,16 10,31 Khảo sát tính phù hợp của hệ thống. Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ methyl paraben và propyl paraben tương ứng là 9,86 μg/ml và 4,96 μg/ml. Bảng 2. Tính phù hợp hệ thống. Thông số Chất RSD% của thời gian lưu (tR) RSD% của diện tích píc (S) AS Rs RSD% của số đĩa lý thuyết (N) Methyl paraben 0,22 0,28 1,16 3,61 0,30 Propyl paraben 0,20 0,25 1,16 10,33 0,72 Các số liệu thu được cho thấy: RSD (%) của diện tích pic methyl paraben, propyl paraben nhỏ hơn 2,0%. Hệ số bất đối của pic methyl paraben, pic propyl paraben nhỏ hơn 0,8 đến 1,5. Độ phân giải giữa hai pic methyl paraben và propyl paraben là 10,33. Như vậy điều kiện sắc ký phù hợp cho việc định tính, định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên nang mềm có chứa hoạt chất này. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký, mẫu trắng (pha động), mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử, thu được sắc ký đồ như Hình 1. Từ sắc ký đồ Hình 1 và Hình 2 cho thấy tại thời điểm 4,0 phút (thời gian lưu của pic methyl paraben), tại thời điểm 9,2 phút (thời gian lưu của pic propyl paraben), mẫu trắng, mẫu placebo không có pic xuất hiện, mẫu chuẩn và mẫu thử cho pic tách rõ ràng (có độ tinh khiết pic lớn hơn 0,999), có cùng thời gian lưu tương ứng. Phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử có cực đại và hình dạng tương tự phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch chuẩn. Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính từ 40 – 140% nồng độ định lượng của methyl paraben và propyl paraben. Pha 6 dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ khoảng từ 3,94 đến 13,80 g/ml cho methyl paraben và từ 1,98 đến 6,94 g/ml cho propyl paraben. Tiến hành sắc ký ở điều kiện khảo sát thu được diện tích píc tương ứng với từng nồng độ. Xử lý dữ liệu bằng excel 2007 cho thấy sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh. Với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3. Hình 1. Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D). A B DC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 382 Hình 2. Phổ UV-Vis của chuẩn methyl paraben (A), chuẩn propyl paraben (B), phổ UV-Vis của thử methyl paraben (C), thử propyl para (D) và Phổ tính tinh khiết của pic methyl paraben mẫu thử (E), pic propyl para mẫu thử (E) Quy trình đạt tính tuyến tính Độ đúng và độ chính xác Bảng 3. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính Chỉ tiêu thẩm định Giá trị thống kê Methyl paraben Propyl paraben Phương trình hồi qui y = 61401 x + 3787 R 2 = 0,9997 y = 54888 x – 375 R 2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính 3,94 -13,80 g/ml 1,98 - 6,94 g/ml Độ lặp lại (n=6) 0,81% 0,56% Độ đúng 99,12 – 99,73% 99,12 – 99,80% Độ phục hồi trung bình của methyl paraben từ 99,12 – 99,73% và từ 99,12 – 99,80% cho propyl paraben, độ phục hồi của phương pháp đều nằm trong khoảng cho phép từ 98 – 102% và có RSD ≤ 2,0%, và quy trình có độ chính xác cao (RSD ≤ 2,0%). Từ kết quả Bảng 3 ta thấy rằng quy trình đạt độ đúng và độ chính xác cao. Ứng dụng quy trình để định lượng có vỏ nang chứa các chất bảo quản methyl paraben và propyl para của viên nang mềm đang lưu hành trên thị trường Bảng 4. Kết quả định lượng methyl paraben và propyl paraben trong chế phẩm Tên thuốc Methyl paraben Propyl paraben Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 1 Lô 2 Lô 3 Vitar C 99,6% 98,7% 99,3% 100,4% 100,1% 96.4% Cetiboston 99,8% 95,4% 101,2% 100,5% 97,3% 98,8% Quy trình phân tích sau khi thẩm định đã được ứng dụng để định lượng methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm của 2 chế phẩm là viên nang mềm Vitar C và viên nang mềm Cetiboston. Mỗi chế phẩm định lượng 3 lô pilot. Theo quy định của USP 41 (không được quá 120% so với lượng dùng trong 1 nang, tính theo khối lượng trung bình vỏ nang mềm). Kết quả phân tích 3 lô ta thấy rằng hàm lượng chất bảo quản methyl paraben và propyl paraben đều dưới giới hạn cho phép của USP 41 do đó các chế phẩm trên đạt tiêu chuẩn về chất bảo quản trong vỏ viên nang mềm. BÀN LUẬN Định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ viên nang mềm bằng HPLC với đầu dò PDA đây là phương pháp chính xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng. Với phương pháp này giúp cho việc kiểm soát A C E B D F Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 383 hàm lượng của các chất bảo quản sử dụng với mục đích diệt khuẩn và diệt nấm để bảo quản vỏ nang mềm một cách chính xác và tin cậy. Ngoài ra việc kiểm soát hàm lượng này cũng góp phần kiểm soát các tác dụng dược lý không mong muốn của các chất bảo quản giúp bảo vệ sức khỏe người sử dụng thuốc. KẾT LUẬN Các kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp HPLC xây dựng cho phép thử định lượng methyl paraben và propyl paraben vỏ nang của viên nang mềm. Phương pháp đã được thẩm định có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, độ đúng tốt, đạt. Khoảng tuyến tính phù hợp nồng độ định lượng trong thành phẩm với độ tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng nồng độ đã khảo sát. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Doron S, Friedman M, Falach M, Sadovnic E, Zvia H (2001). Short communication Antibacterial effect of parabens against lanktonic and biofilm Streptococcus sobrinus. International Journal of Antimicrobial Agents, 18:pp.575– 578. 2. Byford JR, Shaw LE, Drew MG, Pope GS, Sauer MJ, Darbre PD (2002). Oestrogenic activity of parabens in MCF7 human breast cancer cells. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 80:pp.49 – 60. 3. The United States Pharmacopeial Convention (2018). The United States Pharmacopoeia 41 - National Formulary 36 (USP 41-NF 36), https://www.uspnf.com/purchase-usp-nf. 4. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, pp.1-13. Ngày nhận bài báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/02/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019