Xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học của rabeprazole bằng phương pháp HPLC với đầu dò MS/MS

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 372 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA RABEPRAZOLE BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ MS/MS Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Thị Tường Vi**, Sang Seol Jeon***, Kyeong Ho Kim*** TÓM TẮT Mở đầu: Rabeprazole, 2 - {[[4 - (3-methoxypropoxy) -3-methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl} -1H- benzimidazole là một trong những thuốc ức chế bơm proton mới nhất được phát triển để ức chế bài tiết axit dạ dày của H+/K+-ATPase. Một trong những tác nhân trị liệu mạnh nhất được sử dụng để điều trị một số rối loạn tiêu hóa như loét dạ dày và tá tràng. Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học của rabeprazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò MS/MS. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu của phương pháp là viên nén raperazole. Các đồng phân quang học của Rabeprazole được định lượng bằng kỹ thuật HPLC với đầu dò MS/MS. Trong quá trình thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát và tối ưu như tốc độ dòng, nhiệt độ cột, cột phân tách đồng phân ((Chiralpak OD-H (250 x 4,6 mm i.d., 5 μm), Chiralpak AD-H (150 x 4,6 mm i.d., 5 μm), Chiralpak OJ-H (150 x 4,6 mm i.d., 5 μm), Sumichiral OA-4900 (250 x 4,6 mm i.d., 5 μm), Chirobiotic T (250 x 4,6 mm i.d., 5 μm) and Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 μm)), tỉ lệ pha động (mixture of n-hexane with ethanol, methanol or tetrahydrofuran, acetonitrile), các chất thêm (diethylamine, n-butylamine, monoethanolamine và ethylenediamine) và nồng độ của chúng. Các thông số của đầu dò MS/MS được khảo sát và tối ưu. Phương pháp được thẩm định theo ICH Q2 (R1), 2005. Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng phân quang học của rabeprazole với esomeprazole như là nội chuẩn. Kết quả định lượng cho thấy quy trình có tính chọn lọc cao, có LOQ cho R-(+)-Rabeprazole và S-(-)- Rabeprazole là 0,15 ng/ml, khoảng tuyến tính của phương pháp trong khoảng nồng độ 0,15 - 100 ng/ml cho cả hai đồng phân. Độ đúng tỉ lệ phục hồi của R-rabeprazole từ 89,18 – 101,68% và từ 89,22 – 101,34% cho S-(-)- Rabeprazole. Đối với độ chính xác cho cả hai đồng phân R-(+)-Rabeprazole và S-(-)-Rabeprazole lần lượt là 1,59% và 1,58%. Độ chính xác liên ngày (n=11) cho -(+)-Rabeprazole và S-(-)-Rabeprazole lần lượt là 2,94% và 3,04%. Kết luận: Phương pháp LC-MS/MS để tách các phần đồng quang học của rabeprazole đã được phát triển và thẩm định. Phương pháp này có tính chọn lọc, nhanh chóng và tin cậy cao trong việc phân tách các đồng phân quang học của rabeprazole. Từ khóa: esomeprazole, rabeprazole, LC-MS/MS ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF ENANTIOMER OF RABEPRAZOLE BY HPLC WITH MS/MS DETECTOR Truong Quoc Ky, Nguyen Thi Tuong Vi, Sang Seol Jeon, Kyeong Ho Kim * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 372-377 Background: Rabeprazole, 2-{[[4-(3-methoxypropoxy)-3-methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl}-1H- benzimidazole is one of latest proton-pump inhibitors developed for suppression of gastric acid secretion by *Bộ môn hóa chuyên ngành, Khoa Dược, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. **Bộ môn hóa phân tích, Khoa Dược, Đại học quốc tế Hồng Bàng. ***Khoa Dược, Đại học quốc gia KangWon, Hàn Quốc. Tác giả liên lạc: TS. DS. Trương Quốc Kỳ ĐT: 0936723672 Email: quockypharma7@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 373 inhibition of the H+/K+-ATPase. It is one of the most potent therapeutic agents used for treatment of several gastrointestinal disorders such as gastric and duodenal ulcers. Objectives: The aim of a present research is to develop a liquid chromatography-electrospray ionization- mass spectrometry method for simultaneous separation of rabeprazole enantiomers. Methods and subject: Various chiral column ((Chiralpak OD-H (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm), Chiralpak AD- H (150 x 4.6 mm i.d., 5 μm), Chiralpak OJ-H (150 x 4.6 mm i.d., 5 μm), Sumichiral OA-4900 (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm), Chirobiotic T (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm) and Chiralpak IC-3 (100 x 4.6 mm i.d., 3 μm)) were tried for optimum condition for HPLC system and various ratio of mobile phases (mixture of n-hexane with ethanol, methanol or tetrahydrofuran, acetonitrile), additives (diethylamine, n-butylamine, monoethanolamine and ethylenediamine) and its concentrations, flow rates and column temperatures. ESI and APCI ion sources were tried for optimum condition for LC-MS/MS system and both electronic modes (positive and negative) were also tried. The method was validated according to ICH Q2 (R1), 2005. Results: The method has been developed and validated for the identification of rabeprazole enantiomers using esomeprazole as the internal standard. The method was validated over the concentration range of 0.15 – 100 ng/ml for both R-(+)- and S-(-)-rabeprazole. The lower limit of quantification was 0.15 ng/ml for both enantiomers. The intra-day precision varied 1.59% for R-rabeprazole and 1,58% for S-rabeprazole and the inter- day precision varied 2.94% for R-rabeprazole and 3.04% for S-rabeprazole. The accuracy of R-rabeprazole ranged between 89.18 – 101.68% and S-rabeprazole ranged between 89.22 – 101.34%. Conclusion: LC-MS/MS method for the separation of rabeprazole enantiomers was developed and validated. Selective, rapid and reliable simultaneous chiral separation LC-MS/MS method for rabeprazole enantiomers. Keyword: esomeprazole, rabeprazole, LC-MS/MS ĐẶT VẤN ĐỀ Rabeprazole, 2-{[[4-(3-methoxypropoxy)-3- methyl-2-pyri-dinyl] methyl] sulfinyl}-1H- benzimidazole là một trong những thuốc ức chế bơm proton mới được phát triển, có tác dụng ngăn tiết acid dạ dày thông qua việc ức chế kênh H+/K+-ATPase(6). Đối với việc trị liệu, rabeprazole lại được sử dụng dưới dạng hỗn hợp racemic của đồng phần R - (+) và S - (-). Do sự khác nhau về tính chất dược lực học và độc lực học giữa các đồng phân lập thể, việc phân biệt các đồng phân quang học đã trở thành một phần không thể thiếu trong vấn đề nghiên cứu và phát triển thuốc. Do đó, việc cho ra đời các phương pháp phân tích để tách và xác định các loại đồng phân quang học trong dược phẩm là vô cùng cần thiết. Trong chính sách hướng dẫn của Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã tuyên bố rằng cần thiết phải sử dụng các phương pháp phân tích đặc hiệu khi bắt đầu nghiên cứu các đồng phân thuốc. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng nhiều nhất trong các báo cáo về phân tách các đồng phân quang học của các thuốc PPI(1,2,3). Theo tìm hiểu của chúng tôi, việc định lượng mỗi đồng phân của rabeprazole chủ yếu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA(5). Do đó, mục đích của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp phân tích đồng phân rabeprazole bằng LC-MS/MS để hướng đến việc nghiên cứu dược động học của các đồng phân rabeprazole sau này. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu rabeprazole của công ty dược phẩm JW (Hàn Quốc). Trang thiết bị, hóa chất, dung môi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu LC-20AD với đầu dò PDA. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 374 với đầu dò MS/MS 4000 của hãng AB Sciex. Bể siêu âm Wiseclean. Cân phân tích Sartorius BP221S. Cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 µm) với tiền cột Chiralpak IC-3 (10 ⅹ 4,0 mm i.d., 3 µm) của Daicel. Hóa chất dung môi Chuẩn esomeprazole của CTCBIO Inc. (Hwaseong, Hàn Quốc), các hóa chất đạt chuẩn dùng trong sắc ký lỏng như n-hexan, ethanol, methanol, 2-propanol, tetrahydrofuran, acetonitril, n-butylamine và ethylenediamine của Daejung. Monoethanolamine của Junsei và diethylamine của Sigma-Aldrich. Phương pháp nghiên cứu Tiến hành khảo sát để lựa chọn cột sắc ký phù hợp sử dụng hệ thống HPLC với đầu dò PDA. Đồng thời tối ưu hóa các điều kiện sắc ký như dung môi sử dụng, tỉ lệ dung môi và nhiệt độ cột. Từ điều kiện ban đầu dùng để khảo sát là n-hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (EDA) (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt), với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột ở 35 0C với thể tích bơm mẫu là 20 µl sử dụng đầu dò PDA với bước sóng phát hiện ở 280 nm. Các thông số sắc ký như thời gian lưu, diện tích pic, hệ số phân giải và hệ số bất đối được xem xét. Khảo sát điều kiện của sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò MS/MS và lựa chọn esomeprazole làm chất nội chuẩn dùng để xây dựng quy trình phân tích. Tối ưu các thông số của đầu dò MS/MS như kiểu ion hóa, curtain gas (CUR) khí 1 và khí 2 (nitrogen) là 20, 30, 40 psi, nhiệt độ buồng ion hóa 550 0C; điện thế mao quản 5500 V; declustering potential (DP) là 55 V; collision energy (CE) và collision cell exit potential (CXP) là 19 V cho đồng phân rabeprazole, và 76 V, 17 V và 18 V cho IS. Quy trình định lượng sau khi xây dựng được thẩm định theo ICH Q2 (R1) về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác liên ngày và độ đúng(4). Chuẩn bị mẫu Dung dịch gốc Dung dịch gốc rabeprazole cân chính xác 10 mg của rabeprazole cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol, siêu âm 5 phút. Thêm ethanol vừa đủ thể tích, lắc đều thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml. Dung dịch gốc nội chuẩn esomeprazole (IS) cân chính xác 10 mg của esomeprazole cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol, siêu âm 5 phút. Thêm ethanol vừa đủ thể tích, lắc đều thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml. Tất cả các dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh ở - 4 0C. KẾT QUẢ Thăm dò cột sắc ký và tối ưu hóa điều kiện sắc ký Sáu cột HPLC đồng phân được khảo sát gồm cột Chiralpak OD-H (250 x 4,6 mm i.d., 5 µm), cột Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm i.d., 5 µm), Chiralpak OJ-H (150 x 4,6 mm i.d., 5 µm), cột Sumichiral OA-4900 (250 x 4,6 mm i.d., 5 µm), cột ChirobioticT (250 x 4,6 mm i.d., 5 µm) và cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 µm). Hình 1 minh họa sắc ký đồ tương ứng với mỗi cột. Thời gian lưu, diện tích píc, hệ số phân giải và hình dạng pic của cột Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 µm) ở điều kiện khảo sát là tốt nhất. Và sử dụng cột này để tiếp tục khảo sát các điều kiện sắc ký còn lại. Khảo sát các điều kiện sắc ký như dung môi sử dụng và tỉ lệ dung môi để tối ưu hóa ở tốc độ dòng 0,7 ml/phút, kết quả được thể hiện qua Bảng 1. Từ kết quả này thì pha động được chọn là hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (EDA) (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt). Bảng 1. Kết quả thử nghiệm dung môi sử dụng và tỉ lệ dung môi Dung môi Thông số Hexan Ethanol Methanol EDA α K' N RS 10 90 - 0,2% 1,155 0,781 3663 3,89 10 90 - 0,3% 1,252 0,659 3412 3,58 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 375 Dung môi Thông số Hexan Ethanol Methanol EDA α K' N RS 10 90 - 0,3% 1,256 0,665 3407 3,58 10 90 - - 1,058 1,003 4407 4,48 10 90 - 0,1% 1,086 0,982 4429 4,50 10 90 - 0,2% 1,091 0,855 4690 4,23 10 90 - 0,2% 1,136 0,780 4037 4,00 10 90 - - 2,030 2,020 3106 4,07 10 80 - - 1,198 0,840 4713 3,68 10 80 - - 1,206 0,896 4793 3,73 10 80 - - 1,954 1,156 3671 4,20 10 95 - - 2,220 2,016 2789 3,87 10 95 - - 2,330 2,019 2701 3,85 10 45 45 0,1% 0 0,680 3785 1,46 10 60 30 0,1% 0,952 0,722 3507 1,91 10 70 20 0,1% 0,919 0,496 3093 2,09 10 70 20 0,1% 0,923 0,505 3457 2,16 10 80 10 0,1% 1,062 0,916 4839 4,49 10 80 10 0,1% 1,106 0,672 3880 3,44 Hình 1. Sắc ký đồ khảo sát việc lựa chọn cột sắc ký đồng phân Bảng 2. Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ cột Nhiệt độ ( 0 C) Rt1 (phút) Rt2 (phút) N1 N2 RS 25 4,163 5,975 3648 3067 5,126 30 4,081 5,803 3845 2515 4,745 35 3,987 6,252 3923 4855 5,433 40 3,860 5,374 4016 4818 5,472 Ngoài ra ảnh hưởng của nhiệt độ cột được khảo sát. Kết quả được biểu diễn qua Bảng 2. Chiralpak OD-H Chiralpak AD-H Chiralpak OJ-H Sumichiral OA ChirobioticT Chiralpak IC-3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 376 Từ kết quả này thì nhiệt độ cột 35 0C được sử dụng. Tối ưu hóa điều kiện của HPLC với đầu dò MS/MS Điều kiện của HPLC Sử dụng điều kiện HPLC đã được tối ưu hóa ở trên cho việc phân tích đồng phân quang học của rabeprazole bằng MS/MS. Pha động: hexan – ethanol – methanol – ethylenediamine (10:80:10:0,1%, tt/tt/tt/tt). Cột sắc ký: Chiralpak IC-3 (100 x 4,6 mm i.d., 3 µm). Nhiệt độ cột: 35 0C. Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút. Thể tích bơm mẫu: 10 µl. Tối ưu các thông số của đầu dò MS/MS Sử dụng MRM (multiple-reaction- monitoring) các điều kiện được tối ưu như sau curtain gas, khí 1 và khí 2 (nitrogen) là 20, 40 psi, nhiệt độ buồng ion hóa 550 0C; điện thế mao quản 5500 V; declustering potential (DP) là 55 V; collision energy (CE) và collision cell exit potential (CXP) là 19 cho đồng phân rabeprazole, và 17 V cho IS. Thu được m/z của rabeprazole có Q1 = 360,1 và Q3 = 242,1 và esomeprazole (IS) có m/z của Q1 = 345,0 và Q3=198,0. Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Hệ số đối xứng có giá trị trung bình trong khoảng 0,8 – 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại so với nội chuẩn của mẫu chuẩn đều nhỏ hơn 2%. Kết quả được biểu diễn qua Bảng 3. Vậy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. Bảng 3. Tính phù hợp hệ thống Thông số Chất RSD% của thời gian lưu (tR) RSD% của diện tích píc (S) AS RSD% của số đĩa lý thuyết (N) S-(-)- 0,32 1,54 1,2 1,62 Rabeprazole R-(+)- Rabeprazole 0,54 1,51 1,2 1,65 Khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện Từ dung dịch gốc pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,2, 0,3, 1, 3, 6, 10, 20, 40, 100 và 200 ng/ml cho rabeprazole ở dạng đồng phân trong ethanol. Tiến hành sắc ký ở điều kiện khảo sát thu được diện tích pic tương ứng với từng nồng độ. Xử lý dữ liệu bằng excel 2007 cho thấy sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh so với nội chuẩn. Kết quả được thể hiện trong Bảng 4. Với khoảng tuyến tính cho từng đồng phân từ 0,15 đến 100 ng/ml với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999. Và có LOD là 0,1 ng/ml và LOQ là 0,15 ng/ml cho từng đồng phân được thể hiện qua Hình 2. Độ đúng và độ chính xác Độ đúng tỉ lệ phục hồi của S-(-)- Rabeprazole từ 89,22 – 101,34% và từ 89,18 – 101,68% cho R-(+)-Rabeprazole. Đối với độ lặp lại của S-(-)-Rabeprazole và R-(+)-Rabeprazole lần lượt là 1,58% và 1,59%. Độ chính xác liên ngày (n=11) cho S-(-)-Rabeprazole là 2,94% và 3,04% cho R-(+)-Rabeprazole. Kết quả được thể hiện qua Bảng 4. Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ Chỉ tiêu thẩm định Giá trị thống kê S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole Phương trình hồi qui y = 0,0254x + 0,0205 R 2 = 0,9991 y = 0,0232 x + 0,0161 R 2 = 0,9995 Khoảng tuyến tính 0,15 – 100 ng/ml 0,15 – 100 ng/ml LOD và LOQ 0,1 ng/ml và 0,15 ng/ml 0,1 ng/ml và 0,15 ng/ml Độ lặp lại (n=6) 1,58% 1,59% Độ chính xác liên ngày (n=11) 2,94% 3,04% Độ đúng 89,22 – 101,34% 89,18 – 101,68% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 377 Hình 2. Sắc ký đồ của mẫu trắng, nội chuẩn, S-(-)-Rabeprazole và R-(+)-Rabeprazole ở LOD (0,1 ng/ml) và LOQ (0,15 ng/ml) Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ Chỉ tiêu thẩm định Giá trị thống kê S-(-)-Rabeprazole R-(+)-Rabeprazole Phương trình hồi qui y = 0,0254x + 0,0205 R 2 = 0,9991 y = 0,0232 x + 0,0161 R 2 = 0,9995 Khoảng tuyến tính 0,15 – 100 ng/ml 0,15 – 100 ng/ml LOD và LOQ 0,1 ng/ml và 0,15 ng/ml 0,1 ng/ml và 0,15 ng/ml Độ lặp lại (n=6) 1,58% 1,59% Độ chính xác liên ngày (n=11) 2,94% 3,04% Độ đúng 89,22 – 101,34% 89,18 – 101,68% BÀN LUẬN Định lượng đồng phân của rabeprazole bằng LC-MS/MS đây là phương pháp chính xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng, việc định lượng này có thể mở ra hướng nghiên cứu dược động học của các đồng phân rabeprazole bằng LC- MS/MS. Và việc nghiên cứu các chất chuyển hóa của các đồng phân này trong cơ thể người. KẾT LUẬN Phương pháp LC-MS/MS để tách các phần đồng quang học của rabeprazole đã được phát triển và thẩm định. Phương pháp này có tính chọn lọc, nhanh chóng và tin cậy cao trong việc phân tách các đồng phân quang học của rabeprazole. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chennuru LN, Choppari T, Duvvuri S, Dubey PK (2013). Enantiomeric separation of proton pump inhibitors on new generation chiral columns using LC and supercritical fluid chromatography. J Sep Sci, 36:pp.3004 – 3010. 2. Cirilli R, Ferretti R, Gallinella B, De Santis E, Zanitti L, La Torre F (2008). High-performance liquid chromatography enantioseparation of proton pump inhibitors using the immobilized amylose based Chiralpal IA chiral stationary phase in normal-phase, pholar organic and reversed-phase condition. J Chromatogra A, 1177:pp.105 – 113. 3. del Nozal MJ, Toribio L, Bernal JL, Alonso C, Jiménez JJ (2004). Chiral separation of omeprazole and several related benzimidazoles using supercritical fluid chromatography. J Sep Sci, 27:pp.1023–1029. 4. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, pp.1-13. 5. Kim M, Yu SK, Truong QK, Mai XL, Chung HK, Kang JS, Kim KH (2016). Determination of rabeprazole enantionmers in commercial tablets using immobilized cellulose-based stationary phase. Archives of pharmacal research, 40:pp.373 – 381. 6. Magotoshi M., Hideyuki T., Hideaki F., Noriaki T. (1990). The potency of substituted benzimidazoles such as E3810, omeprazole, Ro 18-5364 to inhibit gastric H+, K(+) – ATPase is correlated with the rate of acid – activation of the inhibitor. Biochem Pharmacol, 39:pp.661– 667. Ngày nhận bài báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/02/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019 Mẫu trắng LOD LOQ Nội chuẩn Nội chuẩn Nội chuẩn