Xây dựng quy trình định lượng các flavonoid Và acid clorogenic trong nữ lang (valeriana hardwickii) bằng uhplc-ms

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 12 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII) BẰNG UHPLC-MS Huỳnh Lời*, Nguyễn Thùy Vi*, Trần Hùng** TÓM TẮT Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall. Caprifoliaceae) đã được dùng từ lâu trong y học cổ truyền để điều trị mất ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi và rối loạn chu kỳ kinh nguyệt. Ngoài ra, dược liệu này còn dùng ngoài để điều trị côn trùng đốt và các bệnh ngoài da. Cho tới nay, các công trình nghiên cứu về Nữ lang chủ yếu là phân tích các thành phần bay hơi. Ngoài ra, các thành phần khác được phân lập như các iridoid, flavonoid, triterpen. Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu công bố. Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS. Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam. Nguyên liệu và phương pháp: Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015. Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành. Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Hệ dung môi và điều kiện MS được tối ưu hóa. Phương pháp được đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril (B), gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350 ºC. Tốc độ khí khử dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100- 1000) và SIR (single ion recording). Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian lưu và diện tích đỉnh các pic nhỏ hơn 2%. Tính tuyến tính với R2 ~ 0,999 và khoảng tuyến tính các hợp chất có nồng độ 0,7-120 mg/ml. Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%. Tỷ lệ phục hồi 99-106%. Giới hạn phát hiện là của a. clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin lần lượt là 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml. Acid clorogenic có trong các bộ phận của V. hardwickii bao gồm lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá V. hardwickii bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong rễ và lá của V. officinalis cũng được định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,3% và 1,45%. Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và được đánh giá theo hướng dẫn của ICH. Các điều kiện phân tích đã được thiết lập bao gồm các điều kiện về phổ khối, tính tương thích hệ thống tính *Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố. Hồ Chí Minh **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 02838295641 Email: tranhung@uphcm.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 13 tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Hàm lượng các hợp chất đã được định lượng bao gồm acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, và linarin trong V. hardwickii và acid clorogenic trong V. officinalis. Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ABSTRACT QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA HARDWICKII BY UHPLC-MS Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 12 – 23 Background and objectives: V. hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties. The topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases. Volatile compounds were reported. Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii. The aim of this study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin, neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii. Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà), Đà Lạt in April 2015. V. officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015. The mobile phase and MS conditon were optimized. The analytical method was validated for system suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines. Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid 0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 min run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC column temperature, 3 ml injection volume. MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000, SIR (single ion recording) mode. Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z 579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin. System is suitable for analysis with RSD of retension time and peak area below 2%. The method was found to be linear within the ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999. The precision was determined with RSD < 5%. The LOD was 0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin respectively. The recovery ranged 99-106%. The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in leaves, stems and roots, respectively. The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid, and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively. Acid clorogenic from the roots and leaves of V. officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively. Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated. The MS condition was optimized. System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined. The content of chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined. Chlorogenic acid in V. officinalis was successful quantitative. Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Valeriana trước đây thuộc họ Valerianaceae (họ Nữ lang) và hiện nay được xếp vào họ Caprifoliaceae (họ Cơm cháy)(21,22). Ở châu Á, chi Valeriana có các loài V. pseudofficinalis, V. fauriei, V. jatamansi, V. hardwickii, Nardostachys jatamansi(2,3,18,19). Ở Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 14 nước ta có 2 loài: V. hardwickii (Nữ lang) và V. jatamansi (Sì to)(22). Thành phần hóa học chi Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid phenol, lignan, alkaloid. Ngoài ra còn có amino acid (arginin, GABA, glutamin, tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ khác(10). Trên thế giới V. hardwickii mọc ở Ấn Độ, Trung Quốc, Mianma, Malaysia, Indonesia. Ở nuớc ta, Nữ lang (V. hardwickii) mọc ở Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt)(8). Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên loài V. hardwickii không nhiều. Năm 1989, Đỗ Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2 thành phần từ V. hardwickii ký hiệu là N1, N2 và chưa xác định được cấu trúc(9). Thành phần chính trong tinh dầu V. hardwickii var. arnottiana là valeracetat và hàm lượng tinh dầu là 0,3%(20). Tinh dầu V. hardwickii mọc ở Hymalaya thành phần chính là methyl linoleate(16). Tinh dầu trong Valeriana hardwickii ở Việt nam có thành phần chủ yếu là bornyl acetat(13). Về phân lập, có 2 công trình nghiên cứu trên cây này. Epoxysesquithujen được phân lập trong tinh dầu V. hardwickii var. hardwickii(6). Các chất sitosterol, daucosterol, syzalterin, 6-methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'- dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, apigenin, quercetin, tricin, farrerol, sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7- methoxyflavanon, linarin, neobudofficid, neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, bornyl ferulat, bornyl caffeat cũng được phân lập từ V. hardwickii(5,12). Cho đến nay, ít có công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của V. hardwickii. Cao chiết thân rễ V. hardwickii gây ra sự ức chế phụ thuộc nồng độ sự co thắt tự phát hay sự co thắt gây bởi kali trên ruột chay thỏ, do đó thể hiện tác dụng chống co thắt(1). Các cao chiết từ V. hardwickii bao gồm cao nước, cao ethanol 45% và cao DCM có tác dụng an thần, giải lo âu(1). Thử nghiệm trên dòng tế bào NB18TG2, linarin và isovaleroxy valtrat hydrin được phân lập từ V. hardwickii không có độc tính trên dòng tế bào này(14). Theo y học cổ truyền, Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác động vào 2 kinh: tâm, can. Cây có tác dụng ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông kinh(8). Hoạt chất từ thân rễ dùng làm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dạ dày, điều kinh, sốt ở trẻ em(23). Ở Ấn Độ, thân rễ của V. hardwickii được dùng như thân rễ V. officinalis để chữa hysteria, động kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn thần kinh chức năng. Thân rễ cũng dùng để làm hương liệu. Ở Trung Quốc, toàn cây và thân rễ được dùng trị thần kinh suy nhược và mất ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt không đều, đòn ngã tổn thương và phong thấp đau xương(22). Ở Pakistan, Miến Điện và Srilanka, V. hardwickii được sử dụng để làm gia vị cũng như làm thuốc. Nữ lang được dùng làm thuốc toát mồ hôi, phòng bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích, thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co thắt, trị tiêu chảy(1). Nữ lang V. hardwickii được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml nước sôi, để nguội uống trong ngày hoặc nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 g/ ngày, có thể thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm, ngày dùng 1-4 g(8). Cho đến nay, công trình nghiên cứu về phân tích định lượng các thành phần trong Valeriana hardwickii chưa đuợc công bố. Công trình nghiên cứu này là lần đầu tiên công bố về định lượng các flavonoid, acid clorogenic trong V. hardwickii bằng UHPLC-MS. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 15 NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt. Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành(8). Mẫu Nữ lang V. hardwickii được thu hái 4/2015 và được lưu tại Bộ môn Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL. Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Mẫu được lưu tại Viện thực vật ứng dụng và dược liệu (Applied Botany and Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với số lưu IAB2012-VAL01. Dung môi, hóa chất Acid formic, acetonitril được cung cấp bời Merck (Đức). Acid clorogenic được cung cấp bởi Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid và linarin là các hợp chất đối chiếu phân lập trong nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết HPLC lần lượt là 97,2%, 99,2% và 98,4%. Trang thiết bị nghiên cứu Hệ UHPLC Waters® model Acquity® H- class với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột Cortes® C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 µm). Phần mềm Empower 3. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Khảo sát lần lượt các dung môi là MeOH với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ, thời gian chiết và số lần chiết sao cho các điều kiện chiết cho hiệu suất chiết cao nhất. Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải Khảo sát trên hai dung môi là acid formic 0,1% trong MeOH và acid formic 0,1% trong acetonitril ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của đỉnh đạt yêu cầu định lượng. Các điều kiện sắc ký được khảo sát trên hai kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và chương trình dung môi (gradient) để chọn điều kiện sắc ký có sự phân tách các pic. Khảo sát điều kiện MS Điều kiện MS được điều chỉnh bằng thủ công sao cho ion hóa tốt nhất. Các thông số được thăm dò bao gồm điện thế cone (cone voltage), điện thế mao quả (capillary voltage), nhiệt độ của mao quản, phương thức chọn ion (positive hay negative). Khảo sát tính tương thích hệ thống Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện. Yêu cầu: RSD của thời gian lưu; diện tích pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối (AF) từ 0,5-1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5(4,7). Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu trắng không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu. Tính tuyến tính Pha các hợp chất cần định lượng trong MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả được đánh giá bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 16 Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995. Độ lặp lại Thực hiện định lượng trên 6 dịch chiết mẫu thử khác nhau. Độ lặp lại được đánh giá dựa vào RSD của hàm lượng các chất phân tích có trong bột lá Nữ lang. Mỗi mẫu định lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình(7). Độ đúng Độ đúng là tỷ lệ phục hồi giữa nồng độ chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối chiếu thêm vào. Thêm vào mẫu thử dược liệu một lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với hàm lượng chất phân tích có trong mẫu thử, tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ thực hiện trên 3 mẫu. Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 – 107%(11). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Hai giới hạn này được tính trên tỷ lệ tín hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường nền (N). LOD và LOQ được tính toán theo tỷ lệ S/N=3/1 và 10/1 theo thứ tự dựa theo kết quả thực nghiệm. Áp dụng quy trình định lượng Sau khi xây dựng quy trình định lượng, quy trình được áp dụng để định lượng các thành phần có trong thân và rễ của Nữ lang (V. hardwickii) và trong rễ và lá của V. officinalis. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Khảo sát dung môi chiết Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần trăm MeOH khác nhau. Kết quả cho thấy MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, vì vậy dung môi MeOH 40% dùng để chiết các thành phần định lượng từ lá Nữ lang. Bảng 1: Diện tích đỉnh các polyphenol và dung môi chiết trong khảo sát quy trình định lượng Hợp chất MeOH 10% MeOH 20% MeOH 40% MeOH 60% MeOH 80% MeOH 100% Acid clorogenic 3061530 2721360 3401700 3571785 3061530 3231615 Rhoifoolin 210245 194555 209199 173635 215475 171899 Neobudofficid 16917 18646 18590 15244 16359 18962 Linarin 454553 341823 363642 338187 316369 356369 Khảo sát số lần chiết Kết quả khảo sát số lần chiết cho thấy chiết 2 lần được chọn để chiết các hợp chất cần định lượng trong lá Nữ lang. Bảng 2: Diện tích đỉnh các polyphenol và số lần chiết trong khảo sát qui trình định lượng Hợp chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Tỷ lệ % chiết lần 2 Tỷ lệ % chiết lần 3 Acid clorogenic 3402031 187110 34020 5,16 0,94 Rhoifoolin 2092002 125520 29288 5,59 1,30 Neobudofficid 18605 1302 205 6,48 1,02 Linarin 364110 14564 10923 3,74 2,80 Khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết 30 phút được chọn để chiết vì cho diện tích đỉnh cao hơn so với chiết 15 phút và cũng gần tương đương với chiết 45 phút. Bảng 3: Diện tích đỉnh các polyphenol và thời gian chiết trong khảo sát quy trình định lượng Hợp chất 15 phút 30 phút 45 phút Acid clorogenic 3401120 3571176 3407922 Rhoifoolin 2092110 2133952 2194202 Neobudofficid 18701 18906 18988 Linarin 365210 373244 376166 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 17 Khảo sát nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết đuợc khảo sát ở 30oC, 40oC và 50oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ 40oC cho hiệu quả chiết cao hơn 30oC và cũng tương đương với 50oC. Vậy, nhiệt độ 40oC thích hợp cho quy trình chiết. Bảng 4: Diện tích đỉnh các polyphenol và nhiệt độ chiết trong khảo sát quy trình định lượng Hợp chất 30oC 40oC 50oC Acid clorogenic 3401800 3571890 3575292 Rhoifoolin 2092528 2094621 2098806 Neobudofficid 18705 19078.84 19452.93 Linarin 365283 381355.5 383181.9 Sau khi khảo sát dung môi chiết, số lần chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết. Quy trình chiết được thiết lập như sau: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá Nữ lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức năng lượng 100%) ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 30 phút, lọc, bã được chiết lần 2 với 10 ml MeOH 40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu được vào bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm trước khi phân tích bằng UHPLC. Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, chương trình rửa giải được xây dựng như sau: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril (B). Chương trình rửa giải gradient thể hiện ở Bảng 5. Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Bảng 5: Chương trình rửa giải của quy trình định lượng Thời gian Pha động 0-2 phút 90% A 2-3 phút 90% 78% A 3-5 phút 78%  75% A 5-7 phút 75% A 7-9 phút 75%  5% A 9-14phút 5% A Khảo sát điều kiện MS Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350oC. Tốc độ khí khử dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100-1000) và SIR (single ion recording). Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng Thành phần tR (phút) STB (µV × s) N (biểu kiến) k’ α Rs As Acid clorogenic (30 mg/ml) TB 1,989 3787040 7817 3,3 1,13 RSD% 0,04 0,73 Rhoifolin (18,75 mg/ml) TB 5,829 3182400 106680 11,7 1,04 2,86 1,12 RSD% 0,02 0,73 Neobudofficid 3,75 mg/ml) TB 7,11 728291 160595 14,5 1,10 RSD% 0,07 0,89 Linarin 30 mg/ml) TB 7,846 7998000 84759 16,1 1,04 2,63 1,13 RSD% 0,05 1,57 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 18 Hình 1: Sắc ký đồ ở chế độ SIR và các phổ khối của các hợp chất tương ứng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 19 Tính đặc hiệu Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 20 Tính tuyến tính Bảng 7: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các chất đối chiếu Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin C (µg/ml) STB (µV×s) C (µg/ml) STB (µV×s) C (µg/ml) STB (µV×s) C (µg/ml) STB (µV×s) 120 14978010 75 11991988 15 2780080 120 31876180 60 7544520 37,5 6295994 7,5 1425682 60 15998040 30 3787048 18.75 3182499 3,75 728291 30 7999020 15 1893524 9,38 1610227 1,88 367899 15 4031245 7,5 1074029 4,69 829839 0,938 182169 7,5 1908647 Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh với R2~0,999 và khoảng tuyến tính các chất phân tích thể hiện ở Bảng 8. Sau khi xét các hệ số hồi quy, phương trình tuyến tính thể hiện ở Bảng 8. Bảng 8: Phương trình tuyến tính Hợp chất Phương trình tuyến tính Khoảng tuyến tính (mg/ml) R2 Acid clorogenic ŷ = 124100x 7,5 - 120 0,9999 Rhoifolin ŷ = 158817x 4,69 – 75 0,9994 Neobudofficid ŷ = 184350x 0,938 – 15 0,9998 Linarin ŷ = 265886x 7,5 - 120 0,9995 Độ lặp lại Bảng 9: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định luợng (n=6) Hợp chất A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin Hàm lượng (%) (khối lượng/khối lượng) 1,76±0,03 (RSD = 1,61) 0,86±0,02 (RSD = 2,07) 0,19±0,005 (RSD = 2,42) 1,95±0,096 (RSD = 4,95) Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%. Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại. Khảo sát độ đúng Tất cả các đỉnh cần định lượng đều có tỷ lệ phục hồi trong giới hạn từ 97 – 105%. Bảng 10: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng (n=9) Tên hợp chất Tỷ lệ phục hồi 10% 20% 30% RSD Acid clorogenic 101,1 99,9 104,5 2,3 Rhoifolin 101,5 99,3 103,2 1,9 Neobudofficid 101,3 102,5 98,2 2,0 Linarin 103,4 102,6 97,5 3,2 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát LOD của quy trình định lượng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 21 Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình bày ở Bảng 11. Trong các polyphenol định lượng, neobudofficid có LOD thấp nhất với nồng độ 0,0002 mg/ml. Bảng 11: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quy trình định lượng A. clorogenic (mg/ml) Rhoifolin (mg/ml) Neobudofficid (mg/ml) Linarin (mg/ml) LOD 0,029 0,0010 0,00020 0,015 LOQ 0,097 0,0033 0,00067 0,050 Hàm lượng các hợp chất phân tích Bảng 12: Hàm lượng (%) các hợp chất trong lá V. hardwickii A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096 Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng% (khối lượng/khối lượng), n=6 Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic trong V. hardwickii và V. officinalis Lá V. hardwickii Thân V. hardwickii Rễ V. hardwickii Lá V. officinalis Rễ V. officinalis 1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02 Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng % (khối lượng/khối lượng), n=6 Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) của acid clorogenic trong V. hardwickii và V. officinalis Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 22 BÀN LUẬN Phương pháp UHPLC với đầu dò MS single quadrupole ACQUITY® QDa chưa được áp dụng phổ biến. Một vài công trình công bố với đầu dò này bao gồm các phân tích acid amin (phenylalanin, tyrosin, tryptophan, kynurenin) trong chuột(15), phân tích các peptid (bleomycin sulfat, tyrothricin, vancomycin HCl, bacitracin)(17). Đầu dò này cũng được dùng để theo dõi phản ứng, xác định các tạp trong thuốc, xác định thuốc trừ sâu, flavonoid trong nuớc ép trái cây, các cao chiết thấm qua da(24). Lần đầu tiên, phương pháp này được áp dụng trong định lượng các thành phần trong Valeriana hardwickii và định lượng acid clorogenic trong V. officinalis. Phương pháp được xây dựng với thời gian phân tích ngằn (dưới 10 phút). Trong nghiên cứu này, hệ dung môi được thăm dò sao cho tách được acid clorogenic ra khỏi đồng phân của nó, điều này thể hiện các pic đồng phân này trên sắc ký đố (Hình 4), việc thăm dò này tốn nhiều thời gian và thừ với nhiều hệ dung môi. KẾT LUẬN Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và đánh giá theo hướng dẫn ICH. Hàm lượng các hợp chất trong V. hardwickii đã được định lượng với acid clorogenic có trong lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong lá và rễ của V. officinalis cũng đuợc định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,30% và 1,45%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bashir S, et al. (2011), "Antispasmodic and Antidiarrheal Activities of Valeriana hardwickii Wall. Rhizome Are Putatively Mediated through Calcium Channel Blockade". Evid Based Complement Alternat Med. 2011: pp. 304960. 2. Bell CD (2007), "Phylogenetic placement and biogeography of the North American species of Valerianella (Valerianaceae: Dipsacales) based on chloroplast and nuclear DNA". Molecular Phylogenetics and Evolution. 44(3): pp. 929-941. 3. Bell CD, et al. (2005), "Phylogeny and biogeography of Valerianaceae (Dipsacales) with special reference to the South American Valerians". Organisms Diversity & Evolution. 5(2): pp. 147-159. 4. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV. NXB Y Học. 5. Chai SW, et al. (2015), "Chemical constituents from whole plants of Valeriana hardwickii". Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40(20): pp. 4007-11. 6. Chandra SM, et al. (2007), "Epoxysesquithujene, a novel sesquiterpenoid from Valeriana hardwickii var. hardwickii". Fitoterapia. 78(4): pp. 279-282. 7. Đặng Văn Hòa, et al. (2011), Kiểm nghiệm thuốc. Hà Nội: NXB Giáo dục Việt Nam. 8. Đỗ Huy Bích, et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Hà Nội: NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 9. Đỗ Ngọc Thanh, et al. (1989), "Sơ bộ nghiên cứu quá trình tách, chiết valepotriat từ rễ cây Nữ lang". Tạp chí Dược học. 2: pp. 19-20,26. 10. Houghton PJ (1997), Valerian: The Genus Valeriana. Medicinal and Aromatic Plants - Industrial Profiles, ed. Roland Hardman. Vol. 1. Amsterdam - The Netherlands: Harwood Academic, pp.142. 11. Huber L, (2007) Regulations, Standards and Guidelines, in Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Second Edition., CRC Press. p. 9-24. 12. Huynh L, et al. (2016), "Iridoids and flavonoids from Valeriana hardwickii Wall". Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 5(3): pp. 245. 13. Huynh L, et al. (2013), "Comparative analysis of the essential oils of Valeriana hardwickii Wall. from Vietnam and Valeriana officinalis L. from Austria". Journal of Essential Oil Research. 25(5): pp. 409-414. 14. Huỳnh Lời, et al. (2015), "Nghiên cứu về cây Nữ lang Hardwicke III – Độc tính trên dòng tế bào thần kinh của isovaleroxyvaltrat hydrin và linarin phân lập từ Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall. Valerianaceae) và tác dụng chống oxy hoá của Valeriana hardwickii và Valeriana officinalis". Chuyên đề Dược, Y Học TP. Hồ Chí Minh. Phụ bản 19(3): tr. 574-580. 15. Jaroslav G, et al. (2016), "Quantitative analysis of phenylalanine, tyrosine, tryptophan and kynurenine in rat model for tauopathies by ultra-high performance liquid chromatography with fluorescence and mass spectrometry detection". Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 117: pp. 85-90. 16. Jayashankar D, et al. (2011), "Volatile Constituents of Valeriana hardwickii Wall. Root Oil from Arunachal Pradesh, Eastern Himalaya". Records of Natural Products. 5(1): pp. 70-73. 17. Matthias DH, et al. (2016), "Implementation of a single quad MS detector in routine QC analysis of peptide drugs". Journal of Pharmaceutical Analysis. 6(1): pp. 24-31. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 23 18. Meyer FG (1965), "New species of Valeriana from Colombia, Ecuador, and Peru". Brittonia. 17: pp. 112- 120. 19. Meyer FG (1979), "A new species of Valeriana (Valerianaceae) from Venezuela". Brittonia. 31(1): pp. 101-103. 20. Sati S, et al. (2005), "Essential oil composition of Valeriana hardwickii var. arnottiana from the Himalayas". Flavour and fragrance journal. 20: pp. 299-301. 21. Takhtajan A (2009), Flowering plants. Springer Science & Business Media. 22. Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng. Hà Nội: NXB Khoa Học - Kỹ Thuật. 23. Võ Văn Chi (2010), Tự điển cây thuốc Việt Nam. Hà Nội: NXB Y Học. 24. Xiaodong B, et al. (2016), "The emergence of low-cost compact mass spectrometry detectors for chromatographic analysis". TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82: pp. 22-34. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019