Xây dựng quy trình Aso Pcr xác định điểm đa hình Rs2231142 trên Abcg2

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Nội Khoa 224 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ASO PCR XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH rs2231142 TRÊN ABCG2 Mai Phương Thảo*, Lê Thị Kim Hoàng** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Protein ABCG2 (ATP binding cassette sub-family G member 2) là một protein vận chuyển nằm trên màng tế bào thuộc đại gia đình protein vận chuyển phụ thuộc ATP. Protein ABCG2 được mã hóa bởi gen ABCG2 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 4, có vai trò vận chuyển các thuốc hóa trị ung thư, nhiều nhóm thuốc và hợp chất nhau (statin, cimetidine, flavonoid). Các nghiên cứu gần đây, phát hiện vai trò vận chuyển và bài tiết acid uric ở thận, gan, ruột và não của protein ABCG2. Gen ABCG2 có tính đa hình tương đối cao, trong đó r2231142 (Q141K, 421.C>A) là điểm đa hình được nghiên cứu nhiều nhất có ý nghĩa quan trọng trong chuyển hóa thuốc và acid uric. Biến thể Q141K vừa làm giảm biểu hiện protein ABCG2 vừa làm giảm hoạt động vận chuyển phụ thuộc ATP của protein này. Việc xác định biến thể rs2231142 trên gen ABCG2 có ý nghĩa quan trọng đối với dược động học, chuyển hóa và đào thải của các loại thuốc cũng như chuyển hóa acid uric. Có nhiều phương pháp để phát hiện vị trí đột biến gen như giải trình tự, ASO-PCR, RFLP PCR trong đó, giải trình tự chuỗi DNA vẫn là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên phương pháp này có điểm hạn chế là chi phí cao và thời gian trả kết quả chậm. Để khắc phục các nhược điểm này của phương pháp giải trình tự DNA, một yêu cầu đặt ra là cần có phương pháp phát hiện biến thể rs2231142 trên gen ABCG2 chi phí thấp hơn, thời gian trả kết quả nhanh hơn nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình ASO PCR xác định điểm đa hình rs2231142 trên gen ABCG2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phân tích mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được chẩn đoán Parkinson đến khám tại Phòng khám Thần kinh, Bệnh viện Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh. Tiến hành tách chiết DNA, sử dụng kỹ thuật ASO-PCR xác định điểm đa hình, so sánh với kết quả giải trình tự Sanger. Kết quả: Chúng tôi đã xác định được trình tự cặp mồi phản ứng ASO PCR nhận diện đặc hiệu đúng nucleotide A ở vị trí 421 với độ nhạy và đặc hiệu 100%, đồng thời thiết lập thành công điều kiện phản ứng tối ưu của phản ứng ASO PCR xác định điểm đa hình rs2231142 (Q141K) trên gen ABCG2. Kết luận: Việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng ASO PCR trong xác định điểm đa hình gen cho phép phân tích gen nhanh chóng, tiết kiệm thời gian và chi phí nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Từ khóa: Bệnh Parkinson, biến thể ABCG2 (rs2231142), uric acid, ASO-PCR, giải trình tự Sanger. ABSTRACT APPLICATION OF ASO-PCR FOR DETECTING SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM IN ABCG2 (rs2231142) Mai Phuong Thao, Le Thi Kim Hoang * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 218 - 224 Introduction: ABCG2 belongs to ATP binding cassette sub-family G member 2, which is encoded by on chromosome 4 and related to drugs-resistance and exporter. Recent studies showed the function of ABCG2 in the transportation and excretion of urate in renal, liver, colon and brain. rs2231142 is a common variant of ABCG2 in which glutamine at codon 141 is mutated to lysine (Q141K). The resultant missense polymorphism at codon 141 (Q141K) has been shown to be a loss-of-function mutation. The detection of ABCG2 variant (rs2231142) plays an important role in evaluating the metabolism of different drugs and even uric acid. There are various * Khoa Xét nghiệm, BV đa khoa Đồng Tháp, **Bộ môn Sinh lý học, Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS. Mai Phương Thảo ĐT: 0918329999 Email:maithao292@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 225 methods in detecting single-point mutation, such as gene sequencing, ASO-PCR, RFLP PCR., the most valuable standard among of which is gene sequencing. However, this technique is time-consuming and high cost. From this issue, it is necessary to find out a method which allows the result faster, low-cost, sensitive and specific. Objectives: Establish ASO-PCR procedure to analyze the single-nucleotide polymorphism rs2231142 (Q141K) of ABCG2. Materials and Methods: DNA was extracted from 2 mL of peripheral blood sample of 30 Parkinson patients in the Department of Neurology, University Medical Center. These DNA were respectively applied to ASO-PCR, and then compared to Sanger sequencing results. Results: We identified specific primers of ASO-PCR that allows the detection of rs2231142 (Q141K). Conclusion: The application of ASO- PCR method to analyze ABCG2 polymorphism rs2231142 gives the result less time-consuming, low-cost, highly sensitive and specific. Keywords: Parkinson’s Disease, ABCG2 variant (rs2231142), uric acid, ASO-PCR, Sanger sequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ Protein ABCG2 (ATP binding cassette sub- family G member 2) là một protein vận chuyển nằm trên màng tế bào thuộc đại gia đình protein vận chuyển phụ thuộc ATP, được phát hiện lần đầu vào năm 1998 với vai trò vận chuyển các thuốc hóa trị ung thư như mitoxantrone, doxorubicin, daunorubicin ra khỏi các tế bào ung thư vú MCF-7/AdrVp dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các tế bào này. Vì vậy, tại thời điểm được phát hiện, chúng được đặt tên là protein đề kháng ung thư vú (BCRP: breast cancer resistance protein)(1). Các nghiên cứu gần đây phát hiện vai trò của protein ABCG2 trong vận chuyển và bài tiết acid uric ở thận, gan, ruột và não. Gen ABCG2 mã hóa protein nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 4 có tính đa hình tương đối cao với hơn 80 điểm đa hình nucleotide đơn, trong đó, rs2231142 (Q141K) là điểm đa hình được nghiên cứu nhiều nhất vì có ảnh hưởng đến chuyển hóa thuốc và acid uric trong cơ thể. Biến thể Q141K vừa làm giảm biểu hiện protein ABCG2 vừa làm giảm hoạt động vận chuyển phụ thuộc ATP của protein này. Người mang biến thể rs2231142 có nồng độ acid uric máu cao hơn và có nguy cơ mắc bệnh gout cao hơn 53% so với nhóm không mang biến thể(3). Ngoài vai trò quan trọng trong bệnh gout và là một yếu tố liên quan đến bệnh lý tim mạch và chuyển hóa, acid uric còn có chức năng bảo vệ trong bệnh lý Parkinson, mở ra hướng nghiên cứu nhằm làm rõ cơ chế sinh bệnh cũng như các yếu tố liên quan đến nồng độ acid uric máu và bệnh Parkinson. Các công trình nghiên cứu đã phát hiện rằng những người mang biến thể rs2231142 trên gen ABCG2 sẽ có nồng độ acid uric trong máu cao dẫn đến nguy cơ mắc bệnh gout cao hơn nhưng lại giảm nguy cơ mắc bệnh Parkinson so với những người không mang biến thể này. Việc xác định biến thể rs2231142 trên gen ABCG2 có ý nghĩa quan trọng đối với dược động học, chuyển hóa và đào thải của các loại thuốc cũng như chuyển hóa acid uric. Cho đến nay, có nhiều phương pháp để phát hiện biến thể, trong đó, giải trình tự chuỗi DNA vẫn là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên phương pháp này có nhiều điểm hạn chế là chi phí cao, tốn kém và thời gian trả kết quả chậm. Để khắc phục các nhược điểm này của phương pháp giải trình tự DNA, một yêu cầu đặt ra là cần có phương pháp phát hiện biến thể rs2231142 trên gen ABCG2 chi phí thấp hơn, thời gian trả kết quả nhanh hơn nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide Polymerase) xác định oligonucleotide đặc trưng alen, dựa trên nguyên tắc phản ứng khuếch đại gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhận diện vị trí đột biến. Sau đó sản Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Nội Khoa 226 phẩm khuếch đại được đem điện di và xác định kiểu gen dựa trên sản phẩm điện di. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu DNA từ máu ngoại vi của bệnh nhân Parkinson đến khám tại Phòng khám Thần kinh Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết genomic DNA từ máu ngoại vi Quy trình tách chiết DNA từ 200 µl máu ngoại vi được tiến hành theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit DNA Blood SV mini (GeneAll® Exgene™). DNA được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, những mẫu được sử dụng phải có tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8. Thiết kế mồi Cặp mồi sử dụng đề khuếch đại và giải trình tự exon 5 và nhận diện nucleotide ở vị trí 421 của gen ABCG2 được thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự chuẩn NG_032067.2 trong GenBank. Thiết lập điều kiện cho các PCR khuếch đại tương ứng với từng cặp mồi 25 l phản ứng với thành phần phản ứng và chu trình luân nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Hot Start Taq Polymerase, Takara). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 2% có nhuộm ethium bromide và quan sát dưới màn soi gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ). Phân tích kết quả điện di sản phẩm ASO PCR Mồi WT nhận diện alen C, 4 cặp mồi đột biến nhận diện alen A với cách thiết kế khác nhau, kết hợp cả hai alen từ mồi WT và đột biến sẽ cho kiểu gen của mẫu DNA. Nếu mồi đột biến nào cho sản phẩm điện di có kiểu gen giống với kết quả giải trình tự thì mồi đó được xem là đặc hiệu. KẾT QUẢ Thiết kế mồi phản ứng ASO-PCR nhận diện điểm đa hình rs2241142 gen ABCG2 Để thiết kế mồi cho phản ứng ASO PCR chúng tôi thiết kế mồi bằng thủ công và kiểm tra mồi dựa vào phần mềm Oligo Analyzer 3.1(IDT) (sg.idtdna.com/calc/analyzer). Chọn vùng trình tự để thiết kế mồi tính từ vị trí đột biến lên phía trên khoảng 18 đến 25 nucleotide. Tất cả các cặp mồi đều có chung mồi ngược là mồi của phản ứng PCR khuếch đại. Cặp mồi 1 (mồi WT): mồi xuôi nhận diện nucleotide không đột biến; Cặp mồi 2 (mồi F2.1): mồi xuôi nhận diện tại vị trí đột biến; Cặp mồi 3 (mồi F2.2): mồi xuôi vừa nhận diện tại vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm một vị trí đột biến kế bên vị trí của SNP; Cặp mồi 4 (mồi F2.3): mồi xuôi vừa nhận diện tại vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm một vị trí đột biến cách hai nucleotide so với vị trí của SNP; Cặp mồi 5 (mồi F2.4): mồi xuôi vừa nhận diện tại vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm một vị trí đột biến cách ba nucleotide so với vị trí của SNP. Bảng 1. Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR-giải trình tự và ASO PCR. (F:mồi xuôi, R: mồi ngược, WT: mồi nhận diện nucleotide C ở vị trí 421) Ký hiệu Trình tự mồi (5’- 3’) Kích thước (bp) Sản phẩm PCR (bp) Ghi chú Mồi phản ứng PCR khuếch đại exon 5 F GCAGGTTCATCATTAGCTAG 20 339 R CAGGGAAAGTCCTACTTATG 20 Tất cả phản ứng Mồi phản ứng ASO PCR WT GACGGTGAGAGAAAACTTAC 20 183 Cặp mồi 1 F2.1 GACGGTGAGAGAAAACTTAA 20 183 Cặp mồi 2 F2.2 GACGGTGAGAGAAAACTTCA 20 183 Cặp mồi 3 F2.3 GACGGTGAGAGAAAACTGAA 20 183 Cặp mồi 4 F2.4 GACGGTGAGAGAAAACCTAA 20 183 Cặp mồi 5 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 227 PCR khuếch đại và giải trình tự Sanger Sản phẩm khuếch đại exon 5 gen ABCG2 được kiểm tra bằng điện di cho băng sản phẩm đúng kích thước ước đoán. Giải trình tự Sanger cho phép xác định trình tự nucleotide ở vị trí 421 (Hình 1). Hình 1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại exon 5 (trái) và giải trình tự Sanger xác định kiểu gen CC, CA, AA (phải). Phân tích kiểu gen dựa trên kết quả điện di sản phẩm phản ứng ASO-PCR Mỗi phản ứng ASO PCR sẽ được thực hiện với cả hai cặp mồi, một cặp mồi nhận diện vị trí C và một cặp mồi nhận diện vị trí A. Mồi wide- type nhận diện C xuất hiện băng, mồi nhận diện A không xuất hiện băng thì mẫu DNA có kiểu gen là CC. Mồi wide-type nhận diện C xuất hiện băng, mồi nhận diện A có xuất hiện băng thì mẫu DNA có kiểu gen là CA. Mồi wide-type nhận diện C không xuất hiện băng nên nucleotide C đã đột biến thành A, mồi nhận diện Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Nội Khoa 228 A có băng sản phẩm điện di là alen A, nên có kiểu gen là AA (Hình 2). Hình 2. Phân tích kết quả điện di sản phẩm ASO- PCR xác định kiểu gen CC, AA và CA. So sánh kết quả ASO-PCR với giải trình tự Sanger xác định cặp mồi đặc hiệu nhận diện điểm đa hình rs2231142 Mồi wild-type nhận diện đúng C ở tất cả 30 mẫu DNA bằng phương pháp ASO PCR. Bốn cặp mồi nhận diện vị trí đột biến thì có hai cặp mồi F2.3 và F2.4 cho kết quả nhận diện đều giống nhau, trong khi đó cặp mồi F2.2 nhận diện không giống hai cặp mồi F2.3 và F2.4 tất cả mười vị trí, còn cặp mồi F2.1 nhận diện không giống một vị trí. Trong các cặp mồi nhận diện vị trí đột biến, tất cả bốn cặp mồi đều có độ đặc hiệu là 100%; hai cặp mồi F2.3 và F2.4 nhận diện đúng vị trí A có độ nhạy là 100%, cặp mồi F2.1 có độ nhạy 93,75% và cặp mồi F2.2 có độ nhạy là 60% (Bảng 2). BÀN LUẬN Trong những năm gần đây, có nhiều phương pháp phân tích biến thể nucleotide khác nhau như RFLP, AFLP, giải trình tự gen là tiêu chuẩn vàng đã được mô tả. Mặc dù các phương pháp này cho hiệu quả cao so với các phân tích kiểu gen truyền thống khác bằng điện di, nhưng việc trang bị nhiều thiết bị đặc biệt đắt tiền, thời gian trả kết quả chậm đã hạn chế việc sử dụng các phương pháp đó trong các phòng thí nghiệm. Phương pháp ASO PCR đặc hiệu đã được phát triển để phân tích alen các đột biến có ý nghĩa lâm sàng. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp ASO PCR trên bệnh nhân Parkinson nhằm khuếch đại exon 5 trên gen ABCG2 tìm alen A trong các mẫu phân tích, so sánh với kết quả giải trình tự. Đối với phản ứng ASO PCR, quan trọng nhất là thiết kế mồi đặc hiệu để nhận diện điểm đa hình. Trong nghiên cứu này, điểm đa hình mà chúng tôi muốn xác định là rs2231142 trên gen ABCG2 nghĩa là phát hiện đột biến làm thay đổi nucleotide C thành A tại vị trí nucleotide 421 trên exon 5 của gen ABCG2 nên chúng tôi tiến hành thiết kế mồi nhận diện nucleotide C có trình tự nucleotide bình thường và mồi nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A. Có nhiều cách thiết kế khác nhau để nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A. Thông thường, khi thiết kế ngoài vị trí đột biến cần nhận diện cần gây thêm vị trí đột biến khác tùy từng vị trí gây thêm mà xác định cặp mồi nào đặc hiệu hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế được 4 cặp mồi nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A với các vị trí thêm vào đột biến khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận thiết kế mồi nhận diện ngay tại vị trí đột biến cần gây thêm một vị trí đột biến khác cách 2 hoặc 3 nucleotide kể từ vị trí đột biến cần nhận diện thì sẽ đặc hiệu hơn. Kết quả của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với kết quả của tác giả Jing Liu và cộng sự (2012) trong việc gây thêm vị trí đột biến nucleotide thứ 3 từ đầu 3’, có độ đặc hiệu alen cao nhất (81,9%)(2). Tuy nhiên, tác giả Jing Liu và cộng sự áp dụng kỹ thuật ASO PCR trên đối tượng khác với của chúng tôi. Từ kết quả so sánh độ nhạy độ đặc hiệu của các mồi với giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger, chúng tôi nhận thấy giải trình tự là tiêu chuẩn vàng nhưng có nhược điểm mất rất nhiều thời gian qua nhiều giai đoạn dẫn đến chi phí cao và thời gian trả kết quả chậm mất ít nhất 02 ngày trong khi đó kỹ thuật ASO PCR rút ngắn thời Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 229 gian trả kết quả nên đã hạn chế được nhược điểm qui trình phức tạp đòi hỏi chuyên môn cao và tốn nhiều thời gian của giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger. ASO PCR chỉ tốn tối đa khoảng 4 - 5 giờ để cho ra kết quả với một quy trình đơn giản, dễ tiến hành hơn giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger (Hình 3). Bảng 2. Kết quả so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của bốn cặp mồi sử dụng trong phản ứng ASO-PCR Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Nội Khoa 230 Hình 3. Thời gian tiến hành thực hiện phản ứng ASO PCR (5 giờ) Kỹ thuật ASO PCR tương đối khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về gen ABCG2 nhưng đa số là nghiên cứu về mối liên quan giữa gen ABCG2 và các bệnh lý, tuy nhiên kỹ thuật phát hiện đột biến thì sử dụng các kỹ thuật khác. Hiện tại chúng tôi chưa ghi nhận được trường hợp nào phát hiện biến thể Q141K bằng kỹ thuật ASO PCR trên thế giới cũng như ở Việt Nam nên chúng tôi chưa có dữ liệu để so sánh kết quả với các tác giả khác. KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi xác định hai cặp mồi nhận diện đúng nucleotide A ở vị trí 421 của gen ABCG2 với độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% cũng như giá trị chẩn đoán âm là 100%, cho kết quả hoàn toàn trùng hợp với phương pháp PCR giải trình gen bằng kỹ thuật Sanger như sau: Mồi xuôi: GACGGTGAGAGAAAACTGAA hoặc GACGGTGAGAGAAAACCTAA. Mồi ngược: CAGGGAAAGTCCTACTTATG TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Doyle LA, et al. (1998), "A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells". Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (26),pp.15665-70 2. Jing L, et al. (2012), "An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application". Plant Methods, 8 (1),pp.1 3. Woodward OM, Köttgen A, Coresh J, Boerwinkle E, Guggino WB, Köttgen M (2009), "Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout". Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (25),pp.10338-10342. Ngày nhận bài báo: 16/11/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 17/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018