Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong dịch chiết nhân hạt gấc bằng quang phổ UV-Vis

Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43 39 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TRONG DỊCH CHIẾT NHÂN HẠT GẤC BẰNG QUANG PHỔ UV-Vis Nguyễn Thu Quỳnh*, Nguyễn Thị Lan Anh, Bùi Thị Luyến, Nguyễn Duy Thư Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nhân hạt gấc (mộc miết tử) là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn thương, làm vết thương mau lành. Mục đích của nghiên cứu ứng dụng phương pháp đo quang phổ UV-Vis để định lượng saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc. Nhân hạt gấc được chiết xuất bằng phương pháp soxhlet với metanol trong 5 giờ. Tiến hành tinh chế bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi n-butanol. Dịch chiết được tiến hành phản ứng Rosenthaler với thuốc thử là axit pecloric và vanilin trong axit axetic băng. Tiến hành quét phổ dung dịch sản phẩm ở dải bước sóng 400-700 nm. Từ đó lựa chọn được bước sóng hấp thụ cực đại là 555 nm để định lượng saponin tổng (so sánh chất chuẩn gypenoside XVII, hàm lượng 98,9%). Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có khoảng tuyến tính nồng độ từ 50 - 150 µg/ml, độ thu hồi đạt 100,2% với sai số tương đối (RSD) là 1,59%. Phương pháp đo quang phổ UV-Vis đề xuất đạt yêu cầu của phép định lượng saponin tổng trong nhân hạt gấc. Từ khóa: mộc miết tử, định lượng, phương pháp, quang phổ UV-VIS. ĐẶT VẤN ĐỀ* Nhân hạt gấc (mộc miết tử) là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn thương, làm vết thương mau lành. Từ lâu, nhân dân ta đã biết cách chế dầu từ nhân hạt gấc theo phương pháp thủ công làm thuốc dùng trong gia đình, dùng được cho tất cả vết thương bị bầm dập, tụ máu, bị mụn nhọt, quai bị, viêm tuyến vú,... ngoài ra còn có tác dụng chữa trĩ, chữa chai bàn chân. Hiện nay, trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu về ứng dụng phương pháp quang phổ UV-Vis để định lượng saponin tổng trong dược liệu [6], [7]. Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận định lượng saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. Nghiên cứu được tiến hành với mục đích xác định hàm lượng saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm có chứa hạt gấc đang được sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc. * Tel: 01232 969898 THỰC NGHIỆM Thiết bị, hóa chất, chất chuẩn Thiết bị, dụng cụ Máy quang phổ UV-Vis HALO- RB-10, máy siêu âm Banson, bộ soxhlet, bếp điện, bộ cách thủy MEMMER, cân phân tích Sartorius (độ chính xác 0,0001 g) và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. Chất chuẩn, hóa chất Chất chuẩn Gypenoside XVII (hàm lượng 98,9%), metanol, n- butanol, ethanol,... (tinh khiết hóa học). Đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Nhân hạt gấc đạt tiêu chuẩn DĐVN IV [2], được thu hái tại Thái Nguyên. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chiết xuất: Cân khoảng 5 g bột hạt gấc, đem chiết bằng phương pháp soxhlet trong 5 giờ hoặc siêu âm trong 1 giờ với khoảng 250 ml dung môi [3], [4], [5]. Phương pháp tinh chế saponin bằng chiết lỏng- lỏng: Lấy 25 ml dịch chiết, cô quay chân không được khoảng 1 - 2 ml dịch chiết Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43 40 đã cô đặc. Chuyển toàn bộ dịch chiết trên vào bình gạn, tráng bình chiết bằng nước cất (5 ml×2 lần). Thêm vào bình gạn 10 ml dung môi n-butanol đã bão hòa nước. Lắc 5 phút, để yên. Gạn phần dịch chiết n-butanol. Chiết thêm 2 lần, lần lượt với 10 ml và 5 ml dung môi n-butanol. Lấy toàn bộ dung dịch n- butanol. Cô quay chân không để thu được cắn. Hòa tan cắn trong metanol lần lượt với 10 ml - 5 ml - 5 ml và chuyển vào bình định mức 25 ml và sau đó thêm metanol đến vừa đủ thể tích [3], [4]. Chuẩn bị dung dịch thử và chuẩn: - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu, tiến hành chiết soxhlet với dung môi metanol, chiết trong 5 giờ. Lọc (bỏ 10-20 ml dịch lọc đầu), lấy 25 ml dịch lọc đem cô quay chân không thu được 1- 2 ml dịch chiết, thêm 4 - 5 ml nước cất, chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình gạn. Chiết với n- butanol đã bão hòa nước 3 lần. Cô quay thu hồi dung môi tới cắn. Hòa tan cắn trong metanol và thêm metanol đến vừa đủ thể tích 25,0 ml. - Dung dịch chuẩn: Gypenoside XVII pha trong metanol nồng độ 0,1 mg/ml. - Phản ứng màu và đo độ hấp thụ quang: Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên đem cô cách thủy đến cắn. Thêm 0,4 ml dung dịch vanilin 5% trong axit axetic băng và 2,4 ml acid pecloric 70%, đun cách thủy 80°C trong 20 phút. Làm lạnh trong nước đá. Chuyển dung dịch vào bình định mức, tráng và bổ sung etyl axetat vừa đủ 10,0 ml. Lắc đều để thu được dung dịch có màu tím hoa cà [3], [4], [6], [7]. Tiến hành định lượng - Quét phổ dung dịch chuẩn ở dải bước sóng 400 - 700 nm. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng cực đại. - Thẩm định phương pháp định lượng: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và độ lặp lại [1]. - Tính toán kết quả: Dựa vào phương trình hồi quy giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thụ quang (A), xác định nồng độ của saponin tổng trong dung dịch thử (µg/ml), từ đó tính ra hàm lượng saponin tổng có trong mẫu thử (%). Xử lý số liệu bằng công cụ Excel KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khảo sát và lựa chọn quy trình chiết xuất và tinh chế Cân chính xác khoảng 5 g bột nhân hạt gấc, tiến hành chiết xuất bằng các phương pháp soxhlet trong 5 giờ hoặc siêu âm 1 giờ với các dung môi ethanol 70%, 96% và metanol. Kết quả lựa chọn được phương pháp chiết soxhlet với metanol cho hiệu suất chiết và hàm lượng saponin toàn phần cao nhất. Tiến hành tinh chế saponin bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng được trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu thu được saponin toàn phần. Dịch chiết saponin được dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng. Xây dựng phương pháp định lượng Xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại Do các saponin ít có các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm. Vì vậy để định lượng được saponin bằng phương pháp đo quang, cần tiến hành phản ứng Rosenthaler của saponin với thuốc thử axit pecloric và vanilin trong axit axetic băng theo phương pháp được trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu cho sản phẩm màu tím hoa cà. Sau đó tiến hành quét phổ dung dịch sản phẩm trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 400 – 700 nm. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu. Kết quả thu được cực đại hấp thụ của dung dịch chuẩn tại bước sóng 555 nm. Do vậy, bước sóng 555 nm được sử dụng để định lượng saponin trong các khảo sát tiếp theo. Thẩm định phương pháp Độ chọn lọc Tính chọn lọc được đánh giá qua phân tích mẫu placebo (dung môi chiết) và mẫu chuẩn (nồng độ gypenoside 0,1 mg/ml). Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43 41 Mẫu placebo được chuẩn bị như sau: cô 25 ml metanol tới cắn, thêm vào đó 25 ml n-butanol, lắc. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong vừa đủ 25 ml metanol (với lần lượt 10 ml - 5 ml- 5 ml chuyển vào bình định mức và thêm metanol đến vừa đủ thể tích). Tiến hành phản ứng Rosenthaler và đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu placebo với mẫu trắng là metanol làm phản ứng tương tự. Kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả độ chọn lọc của phương pháp định lượng STT Độ hấp thụ Ảnh hưởng của mẫu placebo (%) Mẫu chuẩn Mẫu placebo 1 0,418 0,054 12,92 2 0,433 0,054 12,47 3 0,450 0,053 11,77 Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml 125 µg/ml 150 µg/ml Độ hấp thụ quang A 0,285 0,370 0,480 0,570 0,670 Phương trình hồi qui y= 0,0039x + 0,087; R 2 = 0,9988 Độ thu hồi xác định lại từ đường chuẩn (%) 101,5 96,7 100,8 99,0 99,6 Kết quả cho thấy, tại bước sóng định lượng (555 nm), mẫu placebo có độ hấp thụ quang, tuy nhiên độ hấp thụ của mẫu placebo không đáng kể (< 20%) so với độ hấp thụ của mẫu chuẩn. Như vậy, phương pháp phân tích đảm bảo tính đặc hiệu và có độ chọn lọc cao. Xác định khoảng tuyến tính Từ dung dịch chuẩn gốc của gypenoside XVII (0,1 mg/ml) pha loãng bằng metanol được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 50 µg/ml; 75 µg/ml; 100 µg/ml; 125 µg/ml; 150 µg/ml. Hút chính xác 1,0 ml mỗi dung dịch vào 5 ống nghiệm và đem cô đến cắn. Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,4 ml dung dịch vanilin 5% trong axit axetic băng và 2,4 ml axit pecloric 70%. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ trong nồi cách thủy ở 80°C trong 20 phút. Ngâm ống nghiệm trong nước đá, chuyển dung dịch vào bình định mức, tráng ống nghiệm bằng etyl axetat và bổ sung etyl axetat vừa đủ 10,0 ml. Lắc đều, đo độ hấp thụ quang của các dung dịch tại bước sóng 550 nm. Tiến hành làm song song mẫu trắng. Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ 50- 150 µg/ml, có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ saponin chuẩn và độ hấp thụ quang, hệ số tương quan bằng 0,9988. Độ thu hồi xác định lại từ đường chuẩn đều nằm trong khoảng 80 - 120%. Điều này chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chất khảo sát. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ của chất chuẩn được trình bày ở bảng 2 và hình 1: Hình 1. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chất chuẩn Độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của phương pháp được xác định khi phân tích 06 mẫu song song trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Tiến hành định lượng 06 lần độc lập trên một mẫu thử theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn. Tính hàm lượng saponin toàn phần theo gypenoside XVII trong mẫu thử theo dược liệu khô. Kết quả được trình bày trong bảng 3 như sau: Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43 42 Bảng 3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp STT Lượng cân (g) Độ hấp thụ quang A Nồng độ saponin tìm lại theo đường chuẩn (µg/ml) Độ thu hồi saponin tìm lại theo đường chuẩn (%) 1 5,0056 0,612 134,6 89,7 2 5,0060 0,630 139,2 92,8 3 5,0059 0,622 137,2 91,5 4 5,0064 0,626 138,2 92,1 5 5,0063 0,634 140,3 93,5 6 5,0067 0,622 137,2 91,5 TB (%) 91,3 RSD (%) 1,42 Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp STT Lượng thử thêm vào (µg/ml) Độ hấp thụ A Lượng tìm lại (µg/ml) Độ thu hồi (%) Thống kê 1 80 0,391 77,9 97,4 TB = 99,3% RSD = 1,59% 2 80 0,399 80,0 100,0 3 80 0,400 80,3 100,3 4 100 0,481 101,0 101,0 TB = 101,5% RSD = 0,96% 5 100 0,487 102,6 102,6 6 100 0,480 100,8 100,8 7 120 0,549 118,5 98,7 TB = 100,2% RSD = 1,33% 8 120 0,561 121,5 101,3 9 120 0,558 120,8 100,6 Kết quả cho thấy giá trị RSD < 2%. Vậy phương pháp định lượng đạt yêu cầu độ lặp lại. Xác định độ đúng Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách thêm chính xác 1 lượng dung dịch thử đã biết hàm lượng saponin vào mẫu placebo. Lượng thêm vào tương ứng 80%, 100%, 120% so với nồng độ phân tích trong dung dịch thử. Tại mỗi nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập, tiến hành định lượng và xác định lượng tìm lại được so với lượng thêm vào. Kết quả độ đúng được trình bày ở bảng 4. Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích có độ thu hồi từ 97,4 - 102,6% với giá trị RSD < 2%. Vì vậy phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đúng. KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu định lượng saponin trong nhân hạt gấc bằng phương pháp quang phổ UV-Vis có độ nhạy tốt, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp thụ quang, độ lặp lại đạt yêu cầu, độ đúng của phương pháp xây dựng có độ thu hồi cao. Như vậy phương pháp có thể áp dụng để định lượng saponin tổng trong nhân hạt gấc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ y tế (2011), Kiểm nghiệm thuốc, Sách đào tạo dược sĩ đại học, Nxb giáo dục Việt Nam. 2. Dược điển Việt Nam IV (2009), Chuyên luận gấc (hạt). 3. Nguyễn Thu Hương (2016), Nghiên cứu định lượng saponin toàn phần trong dược liệu Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh (2014), “Định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở 3 vùng bằng phương pháp đo quang”, Tạp chí Dược học, số 2, tr. 54. 5. Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyễn Duy Thư, Hoàng Thị Cúc, Bùi Thị Luyến, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2018), “Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất đến chất lượng của cồn thuốc mộc miết tử”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, tập 177 (01), tr. 39-43. 6. Han Benyong, Chen Ying, Ren Ying et al (2014), “Content determination of total saponins from Opuntia”, Bio Technology An Indian Journal, 10(18), pp.10400-10404. 7. Yoko Uematsu, Keiko Hirata, Kazuo Saito (2000), “Spectrophotometric Determination of Saponin in Yucca Extract Used as Food Additive”, Journal of Aoac International, 83(6), pp.1451-1454. Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43 43 ABSTRACT CONTENT DETERMINATION OF TOTAL SAPONINS FROM MOMORDICA COCHINCHINENSIS BY THE UV-VIS SPECTROPHOTOMETRIC METHOD Nguyen Thu Quynh * , Nguyen Thi Lan Anh, Bui Thi Luyen, Nguyen Duy Thu University of Medicine and Pharmacy - TNU Cochinchina Momordica seed (Moc Miet Tu) is a medicinal herb that has been used in various Vietnamese traditional medicines for the treatment of bruises, mumps and mammary gland infections. Objective: To establish for content determination of total saponins in Moc Miet Tu. Methods: Total saponins was determined by UV-Vis spectrophotometry after extracts of the sample had been coloured. Results: The Moc Miet Tu was extracted soxhlet in 5 hours by metanol. The extracts was refined by n-butanol. The quantitative methods was scaned for 400-700 nm wavelength range and choosed 555 nm as the determination of the wavelength. The methods was linear in the range of 50- 150 µg/ml (r = 0.9988), and the average recovery was 100.2 %; RSD was 1.59%. Conclusion: The methods is sensitive, reliable, simple and reproducible for the determination of the contents of total saponins in Moc Miet Tu. Keywords: Cochinchina Momordica seed, quantitative, method, UV-Vis spectrophotometry. Ngày nhận bài: 27/8/2018; Ngày phản biện: 04/9/2018; Ngày duyệt đăng: 12/10/2018 * Tel: 01232 969898