Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao

86 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP 1. Đặt vấn đề Rau đắng biển (Bacopa monnieri (L�) Wettst) còn có tên gọi khác là rau sam đắng� Từ lâu, loài cây này đã được sử dụng rất phổ biến trong đời sống của con người như dùng làm rau ăn hoặc dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Ấn Độ từ 3000 năm trước, có tác dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh và tăng cường nhận thức, hiện đang được nghiên cứu theo hướng để bảo vệ thần kinh [2], [4]� Hiện nay, nhiều tác giả trong và ngoài nước đã nghiên cứu về thành phần hóa học Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao Trần Trung nghĩa1, nguyễn Văn Tài2, Lê hùng Tiến1, Lê Chí hoàn1, Phạm Thị Lý1, nguyễn Văn Kiên1, nguyễn Thu Trang2, Phan Thị Trang2 1 Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ; 2 Viện Dược liệu TÓM TẮT Phương pháp định lượng các bacoside tính theo bacoside A3 trong rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst) bằng HPLC-UV được xây dựng và thẩm định. Điều kiện phân tích được thực hiện trên cột pha đảo VertisepTM C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 205 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích bacoside là 13,5-270 µg/ml (r2=0,9999). Phương pháp cho độ đúng và độ lặp lại cao. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 2,70 µg/ml và 8,91 µg/ml. Phương pháp này được áp dụng để xác định hàm lượng bacoside trong một số mẫu rau đắng biển, kết quả cho thấy hàm lượng bacoside trong khoảng 1,71–4,45%, mẫu có hàm lượng bacoside cao nhất là mẫu RĐB 2-13 (4,45 ± 0,02%). Từ khóa: Rau đắng biển, định lượng bacoside, HPLC Nhận bài ngày 05/11/2017, Phản biện xong ngày 27/12/2017, Duyệt đăng ngày 28/12/2017 và tác dụng dược lý của rau đắng biển� Kết quả nghiên cứu cho thấy rau đắng biển được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để điều trị các chứng tâm phiền khác nhau� Rau đắng biển có chứa alkaloid brahmine, nico- tinine, herpestine, bacosides A [3-(α-L-arab- inopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside-10, 20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-ene], sa- ponin triterpenoid, saponin A, B và C, axit betulinic, D-mannitol, stigmastanol, β-sit- osterol, stigmasterol và pseudojujubogenin glycoside� Các nghiên cứu dược lý cho thấy Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 87 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP rau đắng biển có nhiều tác dụng dược lý, bao gồm các phản ứng thần kinh trung ương (tăng cường trí nhớ, chống trầm cảm), giảm đau, chống co giật, chống oxy hóa, tiêu hóa, nội tiết, chống vi khuẩn, chống viêm, giảm đau, tim mạch và các tác động làm giãn cơ trơn� Tổng quan hiện tại tập trung vào các thành phần hóa học và hiệu quả dược lý của rau đắng biển [1], [3], [5-7]� Ở Việt Nam hiện có dược phẩm “Ích Trí Mộc Linh” (công ty Dược phẩm Tuệ Linh) được kết hợp từ rau đắng biển với các thảo dược khác có tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng khả năng tập trung, giảm căng thẳng và tình trạng lo lắng, khắc phục tình trạng hay quên, chứng lơ đãng, tăng cường sức khỏe và khả năng miễn dịch� Tuy nhiên, vẫn chưa có vùng sản xuất dược liệu rau đắng biển ở Việt Nam, chỉ dựa vào khai thác tự nhiên� Nghiên cứu này có mục tiêu xây dựng được phương pháp định lượng hàm lượng bacoside trong rau đắng biển bằng HPLC, đồng thời đánh giá được hàm lượng bacoside của các mẫu rau đắng biển thu từ các địa phương khác nhau và sau khi trồng nhân giống tại cùng địa điểm nhằm tuyển chọn được các dòng có hàm lượng bacoside cao, đáp ứng được yêu cầu sản xuất nguồn dược liệu này� 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các mẫu dược liệu (toàn cây) rau đắng biển do Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ – Viện Dược liệu thu thập� Thu thập mẫu nghiên cứu và định danh đúng loài (Bacopa monnieri (L�) Wettst, đúng bộ phận dùng (toàn cây)� Thu mẫu rau đắng biển tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam gồm 18 mẫu ký hiệu từ RĐB 01 đến RĐB 18� Thu mẫu rau đắng biển sau khi nhân giống và trồng tại Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa), ký hiệu từ RĐB 2-01 đến RĐB2-18 (Bảng 1)� 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng tổng bacoside trong dược liệu rau đắng biển Dung dịch chuẩn: Hòa tan bacoside A3 chuẩn trong methanol và pha loãng để tạo Bảng 1. Danh sách các mẫu dược liệu nghiên cứu TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu 1 RĐB 01 Thanh Hóa2 RĐB 02 3 RĐB 03 4 RĐB 04 Nghệ An5 RĐB 05 6 RĐB 06 7 RĐB 07 Đà Nẵng8 RĐB 08 9 RĐB 09 10 RĐB 10 Lấp Vò - Đồng Tháp 11 RĐB 11 Vũng Tàu12 RĐB 12 13 RĐB 13 Long An14 RĐB 14 15 RĐB 15 16 RĐB 16 Đồng Tháp17 RĐB 17 18 RĐB 18 TP� Hồ Chí Minh 19 RĐB 2-01 Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa) 20 RĐB 2-02 21 RĐB 2-03 22 RĐB 2-04 23 RĐB 2-05 24 RĐB 2-06 25 RĐB 2-07 26 RĐB 2-08 27 RĐB 2-09 28 RĐB 2-10 29 RĐB 2-11 30 RĐB 2-12 31 RĐB 2-13 32 RĐB 2-14 33 RĐB 2-15 34 RĐB 2-16 35 RĐB 2-17 36 RĐB 2-18 88 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP thành dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 235 ppm� Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn gốc này bằng methanol để thu được các dung dịch có nồng độ từ 11,75–235 ppm� Các dung dịch chuẩn được lọc qua màng lọc có kích cỡ 0,45 µm thu được dung dịch dùng để triển khai sắc ký� Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,5 g bột dược liệu rau đắng biển, chiết hồi lưu với methanol đến khi dịch lọc nhạt màu� Lọc dịch chiết vào bình định mức, bổ sung dung môi đến vạch� Sau đó, lọc dịch chiết qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm thu được dung dịch thử dùng để triển khai sắc ký� • Cột tách: Vertisep C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)� • Detector UV-Vis: bước sóng 205 nm� • Pha động: Dung dịch đệm (A)– Acetonitril (B)� • Dung dịch đệm pH 2,15 (A): Hòa tan 0,07 g KH2PO4 khan và 0,3 ml H3PO4 85% trong nước cất, định mức chính xác thành 500 ml, lắc đều, lọc, siêu âm loại bọt khí� Pha động được rửa giải theo chương trình gradient trình bày trong bảng 2. • Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút� • Thể tích tiêm mẫu: 20 µl� • Nhiệt độ cột: 28oC� a) Xây dựng phương pháp định lượng Tiến hành các khảo sát về dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích Bảng 2. Chương trình gradient rửa giải pha động Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%) 0 70 30 25 60 40 26 70 30 30 70 30 tiêm mẫu� để tìm ra chương trình định lượng phù hợp nhất� b) Thẩm định phương pháp định lượng HPLC ■ Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích: Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ� Nếu có đáp ứng pic phải ≤1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn� Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê đối với pic của chất chuẩn trên sắc ký đồ các mẫu chuẩn� Trên sắc ký đồ dung dịch thử, nếu xuất hiện thêm các pic khác không phải pic của chất chuẩn thì phải tách hoàn toàn khỏi pic và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định trong Dược điển Việt Nam� ■ Tính thích hợp của hệ thống Thực nghiệm: Dung dịch chuẩn: tiến hành sắc ký lặp lại 06 lần� Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng� Thời gian lưu có RSD ≤1,0%, diện tích pic có RSD ≤2,0%� ■ Khoảng tuyến tính Thực nghiệm: Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn có nồng độ từ 13,5-270 ppm bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau� Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch lặp lại 03 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic� Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 89 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu� ■ Độ thu hồi Độ đúng của phương pháp hay tỷ lệ thu hồi (%) = Khối lượng hoạt chất thu hồi/Khối lượng hoạt chất thêm vào × 100� Nếu phương pháp đúng, tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 97,0-103,0%, RSD tỷ lệ thu hồi (≤2,0%) ở mỗi mức nồng độ� ■ Độ lặp lại Tiến hành định lượng 06 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu lặp lại 03 lần� Xác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu thử bằng cách sử dụng đường chuẩn ở mục xác định khoảng tuyến tính� Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng bacoside trong mẫu� Nếu phương pháp đúng, giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng bacoside có trong các mẫu ≤2,0%� ■ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD): Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC đến khi tín hiệu của chất định phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (tín hiệu/nhiễu) = 2H/h đạt khoảng từ 2–3, trong đó H là chiều cao pic định phân tích, h là chiều cao tín hiệu nhiễu nền lớn nhất� Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất định phân tích� Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện� LOQ=3,3 × LOD� 2.2.2. Định lượng các mẫu rau đắng biển Tiến hành sắc ký riêng biệt các dung dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất cần phân tích� Nồng độ của chất cần phân tích trong dung dịch thử (C, ppm) = [(S-a)/b] xH/100� Với S là diện tích pic bacoside; a,b là các hệ số của phương trình đường chuẩn; H là độ tinh khiết của chất chuẩn (%)� Hàm lượng chất phân tích trong dược liệu (%) = [(C×100×100)/(m×1000000)]×[100/ (100-a)� Với C: nồng độ bacoside trong dung dịch mẫu thử, xác định được bằng đường chuẩn (ppm); m: khối lượng dược liệu (g); a: độ ẩm dược liệu (%)� 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Tập hợp kết quả và loại bỏ giá trị thô theo test Dixon� 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Chúng tôi tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn và dung môi pha mẫu theo điều kiện đã mô tả ở trên� So sánh thời gian lưu của pic bacoside A3 chuẩn� Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 1� Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic bacoside A3 ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic bacoside A3 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn� Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với pic của chất chuẩn bacoside A3 trong sắc ký đồ mẫu chuẩn� Trên sắc ký đồ dung dịch thử không xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) ảnh hưởng đến pic chuẩn bacoside A3� Pic của bacoside A3 trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và thử tinh khiết� Hệ số tinh khiết pic bacoside A3 trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử xấp xỉ 1,0� Như vậy, phương pháp đã chọn có tính đặc hiệu cao với bacoside A3 và có thể dùng 90 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP để phân tích thành phần hợp chất bacoside A3 trong dược liệu rau đắng biển� 3.1.1. Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ 135 µg/ml với điều kiện đã chọn� Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống được trình bày ở bảng 3. Kết quả độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và diện tích pic tương ứng là 0,1497 và 0,2015%, đều thấp hơn 2%� Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích bacoside trong rau đắng biển� 3.1.2. Độ tuyến tính Chúng tôi tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả đối với các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 13,5-270µg/ml, kết quả thu được thể hiện trong bảng 4. Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của bacoside A3 Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic 13,5 51351 27,0 103830 67,5 258925 135 522013 216 821108 270 1034329 Hình 1. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu A: Mẫu thử; B: bacoside A3 chuẩn, C: dung môi Bảng 3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic 1 20,302 523533 2 20,323 524442 3 20,323 524916 4 20,332 524622 5 20,354 524091 6 20,389 522013 TB 20,337 523936,2 SD 0,03045 1055,594 RSD (%) 0,1497 0,2015 Hình 2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của bacoside A3 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 91 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ bacoside A3 trong dung dịch theo phương trình: y= 3820,8x + 1037,2 với hệ số tương quan r2=0,9999� 3.1.3. Độ thu hồi Độ thu hồi là đại lượng đặc trưng cho sự sai số của một phương pháp phân tích� Để xác định độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi sử dụng phương pháp thêm chuẩn được trình bày ở mục 2�2� với lượng bacoside A3 đã thêm vào mẫu thử là 218 µg� Chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn; xác định lượng chất đã thêm vào dựa trên phương trình đường chuẩn đã xây dựng� Kết quả thu được trình bày ở bảng 5. Kết quả cho thấy khi thêm các lượng bacoside A3 chuẩn khác nhau, phương pháp này đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng 98-102% và độ lệch chuẩn tương đối <2%� Kết quả này chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp để định lượng bacoside trong dược liệu rau đắng biển� 3.1.4. Độ lặp lại Chúng tôi tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt trên cùng một mẫu dược liệu rau đắng biển� Kết quả thu được được trình bày ở bảng 6. Kết quả độ lệch chuẩn tương đối RSD <2%, vậy phương pháp có độ lặp lại tốt và có thể ứng dụng trong phân tích bacoside trong dược liệu rau đắng biển� 3.1.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là những thông số quan trọng của một phương pháp phân tích, đặc trưng cho khả năng phát hiện, độ nhạy của một phương pháp phân tích� Kết quả thu được: LOD = 2,70 µg/ml LOQ = 3,3 × LOD = 2,70 × 3,3 = 8,91 (µg/ml) Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện LOD = 2,70 µg/ ml và giới hạn định lượng LOQ = 2,70 × 3,3 = 8,91 (µg/ml) tương đối thấp, phù hợp để xác định hàm lượng bacoside trong dược liệu rau đắng biển� Bảng 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp STT Khối lượng (g) Diện tích pic Hàm lượng (%) 1 2,502 1011017 1,961 2 2,510 1011106 1,970 3 2,504 1011128 1,992 4 2,506 1011095 1,959 5 2,509 1011126 1,990 6 2,507 1012689 2,001 Trung bình 2,506 1011360 1,979 SD 0,0033 652,259 0,0177 RSD (%) 0,12 0,064 0,898 Bảng 5. Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp STT Lượng bacoside A3 thêm vào (µg) Lượng bacoside A3 thu hồi được (µg) Thu hồi (%) 1 218,0 221,5 101,60 2 218,0 218,7 100,30 3 218,0 221,7 101,70 Trung bình 101,20 92 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP 3.2. Định lượng các mẫu dược liệu rau đắng biển Kết quả định lượng bacoside trong các mẫu dược liệu rau đắng biển tính theo khối lượng dược liệu khô kiệt được trình bày ở bảng 7. Chúng tôi đã định lượng tổng bacoside tính theo bacoside A3 của 18 mẫu dược liệu rau đắng biển thu hái trong tự nhiên tại các địa điểm khác nhau và 18 mẫu rau đắng biển sau khi nhân giống và trồng tại Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa)� Kết quả định lượng cho thấy các mẫu rau đắng biển có hàm lượng bacoside rất khác nhau theo địa điểm thu hái� Các mẫu có hàm lượng bacoside dao động từ 1,71-4,45% tính theo khối lượng dược liệu khô kiệt� Hai mẫu có hàm lượng bacoside cao nhất là mẫu RĐB 2-13 (4,45± 0,02%) và mẫu RĐB 2-14 (4,09±0,02%)� Đây là các mẫu rau đắng biển được nhân giống rồi trồng tại Thanh Hóa� Trong khi tiêu chuẩn nguyên liệu rau đắng biển được quy định trong Dược điển Mỹ chỉ là 2,5% bacoside� Các kết quả này cho thấy nguồn nguyên liệu rau đắng biển của Việt Nam có chất lượng tốt thể hiện ở hàm lượng bacoside cao, nhiều hứa hẹn dùng làm nguyên liệu phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu� 4. Kết luận Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC- UV định lượng bacoside tính theo bacoside A3 trong rau đắng biển� Áp dụng để định lượng bacoside trong 36 mẫu dược liệu rau đắng biển (18 mẫu rau đắng biển thu hái tự nhiên và 18 mẫu rau đắng biển sau khi nhân giống và trồng tại Thanh Hóa)� Kết quả thu được hàm lượng bacoside nằm trong khoảng 1,71–4,45%, trong đó cao nhất là mẫu RĐB 2-13 (4�45±0,02%)� Kết quả cho thấy rau đắng biển được thu từ nhiều địa phương khác nhau cũng như được trồng tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa) là nguồn nguyên liệu tốt phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe trong nước và xuất khẩu� Bảng 7. Kết quả định lượng bacoside trong dược liệu rau đắng biển TT Kí hiệu mẫu Tổng hàm lượng bacoside (%) Địa điểm lấy mẫu 1 RĐB 01 2,70 ± 0,01 Thanh Hóa2 RĐB 02 2,65 ± 0,01 3 RĐB 03 3,01 ± 0,01 4 RĐB 04 2,77 ± 0,02 Nghệ An5 RĐB 05 1,86 ± 0,01 6 RĐB 06 1,84 ± 0,02 7 RĐB 07 4,24 ± 0,02 Đà Nẵng8 RĐB 08 3,89 ± 0,02 9 RĐB 09 3,70 ± 0,01 10 RĐB 10 3,89± 0,02 Đồng Tháp 11 RĐB 11 2,23 ± 0,01 Vũng Tàu12 RĐB 12 1,95 ± 0,02 13 RĐB 13 1,86 ± 0,02 Long An14 RĐB 14 2,45 ± 0,01 15 RĐB 15 2,87 ± 0,02 16 RĐB 16 2,86 ± 0,01 Đồng Tháp17 RĐB 17 3,54 ± 0,01 18 RĐB 18 1,96 ± 0,02 TP� Hồ Chí Minh 19 RĐB 2-01 2,53 ± 0,02 Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa) 20 RĐB 2-02 2,49 ± 0,01 21 RĐB 2-03 3,02 ± 0,01 22 RĐB 2-04 1,85 ± 0,01 23 RĐB 2-05 2,09 ± 0,02 24 RĐB 2-06 2,47 ± 0,02 25 RĐB 2-07 1,99 ± 0,02 26 RĐB 2-08 1,93 ± 0,01 27 RĐB 2-09 1,71 ± 0,01 28 RĐB 2-10 2,24 ± 0,01 29 RĐB 2-11 2,14 ± 0,01 30 RĐB 2-12 2,76 ± 0,02 31 RĐB 2-13 4,45 ± 0,02 32 RĐB 2-14 4,09 ± 0,02 33 RĐB 2-15 2,63 ± 0,01 34 RĐB 2-16 2,91 ± 0,02 35 RĐB 2-17 3,61 ± 0,02 36 RĐB 2-18 2,27 ± 0,01 Tạp chí Khoa học & Công nghệ số 4 (9) – 2017 93 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Tài liệu tham khảo [1] Ali Esmail Al-Snafi (2013), The pharmacology of Bacopa monniera. A review, International Journal of Pharma Sciences and Research [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tr� 511, NXB Y học, Hà Nội� [3] D� Kar Chowdhuri , D� Parmar, P� Kakkar, R� Shukla, P� K� Seth, R� C� Srimal (2002), Antistress effects of bacosides of Bacopa monnieri: Modulation of Hsp70 expression, superoxide dismutase and cytochrome P450 activity in rat brain, Phytotherapy Research, 16(7): 639-645� [4] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam – tập II, tr� 902, NXB Trẻ, TP� HCM [5] Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thanh Duyên, Hồ Việt Anh (2009), “Tác dụng cải thiện trí nhớ và tác dụng chống stress của saponin toàn phần từ rau đắng biển”, Tạp chí Dược liệu, tập 13 (số 3), tr�173-175� [6] Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thanh Duyên, Trần Thị Mỹ Tiên (2006), “Tác dụng của cao mềm chiết cồn từ rau đắng biển trên khả năng học tập-ghi nhớ nhận thức”, Nghiên cứu phát triển dược liệu và đông dược ở Việt Nam, Viện Dược liệu, tr� 200-206, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội� [7] Nguyễn Trung Nhân, Đặng Hoàng Phú, Phan Nguyễn Hữu Trọng (2012), “Khảo sát thành phần hóa học cao chloroform của cây rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn�) Wettst), Vietnam Journal of Chemistry, 50 (4A), tr�238-241� SUMMARY Validation of quantative hplc method for bacosides in Bacopa monnieri (L.) Wettst and selection of clones containing high content of bacoside Tran Trung nghia1, nguyen Van Tai2, Le hung Tien1, Le Chi hoan1, Pham Thi Ly1, nguyen Van Kien1 nguyen Thu Trang2, Phan Thi Trang2 1 Northern Center for Medicinal Materials Research; 2 National Institute of Medicinal Materials An HPLC-UV method for quantification of bacosides calculated by bacoside A3 in Bacopa monnieri (L.) Wettst has been established and validated. The experimental conditions were carried out using a Vertisep C18 (4.6 x 250 mm, 5 µm) reversed phase column with UV-detection at 205 nm and flow rate of 1.5 ml/min. The calibration curve showed good relationship between linear regression with concentration range from 13.5 to 270 µg/ml (r2=0.9999). The HPLC method improved precision and accu- racy. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 2.70 µg/ml and 8.91 µg/ml. The developed method was applied for analysis of bacosides in some Bacopa monnieri (L.) Wettst samples, results showed the bacosides contents ranged from 1.71 to 4.45%. RĐB2-13 was the sample containing highest bacoside (4.45 ± 0.02%). Keywords: Bacopa monnieri (L.) Wettst, quantification of bacosides, HPLC