Xây dựng công thức bào chế và đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của kem mafenid acetat 8,5%

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 13 XÂY DỰNG CÔNG THỨC BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA KEM MAFENID ACETAT 8,5% Nguyễn Thị Hồng Thắm1; Lương Quang Anh1; Nguyễn Như Lâm1 Trương Thị Thu Hiền1; Lê Việt Đức2 TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng công thức bào chế, đánh giá tiêu chuẩn chất lượng và tác dụng kháng khuẩn in vitro của kem mafenid acetat 8,5%. Phương pháp: xây dựng công thức bào chế kem thuốc dựa trên thay đổi thành phần pha dầu và pha nước, lựa chọn công thức bào chế thích hợp nhất dựa trên đánh giá độ bền vững về mặt vật lý của chế phẩm và khả năng giải phóng hoạt chất qua màng cellulose, từ đó tiến hành bào chế kem theo phương pháp nhũ hóa với tá dược nhũ tương có sẵn. Kiểm nghiệm chế phẩm kem theo tiêu chuẩn USP 38. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng phương pháp khuếch tán trên gel thạch có so sánh với thuốc đối chứng là kem silvirin 1% (Ấn Độ). Kết quả: lựa chọn công thức 7 với thành phần pha dầu: cetostearyl alcohol, axít stearic, eumulgin HRE 40, dầu parafin, vitamin E; thành phần pha nước: Tween 80, propylen glycol, mafenid acetat, EDTA, methyl paraben, propyl paraben, ethanol 96%, nước cất để bào chế kem mafenid acetat 8,5%. Chế phẩm bào chế đạt yêu cầu chỉ tiêu chất lượng theo USP 38 và có tác dụng kháng khuẩn trên chủng trực khuẩn mủ xanh với vòng vô khuẩn đạt 21,84 ± 3,12 mm. Kết luận: xây dựng được công thức bào chế kem mafenid acetat 8,5%, đánh giá tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm và đạt yêu cầu của USP 38; kem mafenid acetat 8,5% có tác dụng kháng khuẩn trên trực khuẩn mủ xanh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 5 lần so với thuốc đối chứng silvirin 1%. * Từ khóa: Mafenid acetat 8,5%; Công thức bào chế; Trực khuẩn mủ xanh. Formulation and Assessment of in Vitro Anti-bacterial Effect of 8.5% Mafenide Acetate Cream Summary Objectives: To formulate and evaluate the qualitative standards and in vitro anti-bacterial effect of 8.5% mafenide acetate cream. Methods: Preparation of cream was based on changing the composition of the oil phase and water phase. Choosing the optimized formulation was based on the assessment of the physical isolation and the liberation of active ingredient through cellulose acetate membrane. The selected formula was prepared by emulsification method with available emulsion excipients. The qualitative standards of cream were tested according to specifications of USP 38. The in vitro anti-bacterial effect of cream was conducted by the diffusive method on gel agar in comparison with 1% silvirin cream (India). Results: Selecting the formula 1. Bệnh viện Bỏng Quốc gia 2. Viện Kiểm nghiệm Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Hồng Thắm (dsthamvbqg@gmail.com) Ngày nhận bài: 16/07/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/08/2018 Ngày bài báo được đăng: 21/08/2018 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 14 number 7 with component in oil phase: Cetostearyl alcohol, acid stearic, eumulgin HRE 40, parafin oil, vitamin E; water phase including: Tween 80, propylen glycol, mafenide acetate, EDTA, methyl paraben, propyl paraben, ethanol 96%, water for the preparation of 8.5% mafenide acetate cream. The cream had anti-bacterial effect on Pseudomonas species (21.84 ± 3.12 mm in diameter). Conclusion: The 8.5% mafenide acetate cream was prepared sucessfully and the optimized product was passed through the specifications of USP 38. The cream showed its anti-bacterial effect on Pseudomonas species, that was five times stronger than 1% silvirin cream (India). * Keywords: 8.5% mafenide acetate cream; Formulation; Pseudomona aeruginosa. ĐẶT VẤN ĐỀ Mafenid acetat là hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn rộng, đặc biệt với các chủng vi khuẩn Pseudomonas và Enterococcus. Nhiều báo cáo đã chỉ ra tất cả chất kháng khuẩn có tác dụng như nhau nếu sử dụng sớm trên vết bỏng, trước khi có nhiễm khuẩn nặng [4]. Vì vậy, mafenid acetat thường được sử dụng trong điều trị vết bỏng có tổn thương toàn bộ da. Chất này được xem là lựa chọn thứ hai trong phòng ngừa và là lựa chọn chính trong điều trị nhiễm trùng tổn thương bỏng [5]. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có chế phẩm chứa hoạt chất mafenid, mà chỉ biết đến biệt dược như sulfamylon dạng cream 8,5% và dạng dung dịch 5% qua chương trình hợp tác với nước ngoài. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu điều trị và làm đa dạng chế phẩm sử dụng tại chỗ trong bệnh viện, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xây dựng công thức bào chế và đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của kem mafenid acetat 8,5%. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu. - Nguyên liệu: + Mafenid acetat (Mỹ) đạt tiêu chuẩn USP. + Mafenid acetat chuẩn - Sigma (đạt tiêu chuẩn phân tích hàm lượng 99,4%). + Tá dược dùng trong bào chế thuốc mỡ và trong kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn dược dụng. + Thuốc đối chứng kem silvirin 1% (Ấn Độ). - Thiết bị nghiên cứu: máy đánh thuốc mỡ, máy khuấy từ gia nhiệt, máy đo quang phổ UV-Vis, cân kỹ thuật. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phương pháp bào chế kem mafenid acetat 8,5%: - Thiết kế 10 công thức bào chế kem theo kiểu nhũ tương D/N dựa theo quy luật tăng dần lượng tá dược cetostearyl alcohol, axít stearic để tăng dần độ đông đặc của thuốc và giảm dần lượng dầu paraffin để điều chỉnh thể chất kem thuốc. - Tiến hành bào chế kem theo phương pháp nhũ hóa với tá dược nhũ tương chưa có sẵn theo các bước: + Hòa tan hoạt chất và tá dược pha nước, đun nóng ở 700C. + Hòa tan tá dược, chất phụ tan trong pha dầu, đun nóng ở 650C. + Phối hợp từ từ nước vào pha dầu và khuấy mạnh bằng máy đánh thuốc mỡ thu được nhũ tương D/N. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 15 + Trộn đều đến khi kem nguội hoàn toàn. + Đóng hộp. - Đánh giá lựa chọn công thức bào chế kem dựa trên tiêu chí: + Độ ổn định của kem thuốc: kiểm tra sơ bộ độ bền vững về mặt vật lý của chế phẩm bằng cách cho thuốc mỡ bào chế vào tủ ấm ở nhiệt độ 40 ± 20C trong vòng 72 giờ. Quan sát sự phân lớp của thuốc mỡ và lựa chọn công thức bền vững nhất để tiếp tục nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất [2]. + Khả năng giải phóng hoạt chất: đánh giá khả năng giải phóng của mafenid acetat ra khỏi kem bằng phương pháp khuếch tán qua màng cellulose acetat và xác định phần trăm giải phóng hoạt chất bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại với điều kiện cụ thể như sau: môi trường khuếch tán: dung dịch HCl 0,01N duy trì ở nhiệt độ 36 - 380C; màng giải phóng: màng cellulose acetat, kích thước lỗ xốp 0,45 µm; thể tích môi trường khuếch tán 130 ml; diện tích bề mặt khuếch tán 6,15 cm2; tốc độ khuấy: 370 vòng/phút. * Phương pháp đánh giá chất lượng kem mafenid acetat 8,5%: Dựa theo chuyên luận kem mafenid acetat trong USP 38 và chuyên luận về thuốc mỡ trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm theo tiêu chí: - Hình thức thể chất: thử bằng cảm quan. - Độ đồng nhất: thử theo phụ lục 1.10 - DĐVN IV. - Độ đồng đều khối lượng: thử theo phương pháp DĐVN IV, phụ lục 8.3. - Định tính: theo phương pháp quang phổ UV-Vis. Lấy 1 g chế phẩm vào bình gạn 60 ml, làm ấm để kem tan thành dung dịch, thêm 20 ml cloroform hòa tan hoàn toàn, sau đó thêm 20 ml nước cất, lắc trong vòng 2 phút cho tách lớp hoàn toàn. Sau đó, loại bỏ phần lớp cloroform ở phía dưới, lớp nước thu được tiếp tục chiết bằng 20 ml cloroform, thu được lớp nước ở phía trên. Tiến hành đo phổ hấp thụ tử ngoại và so sánh với phổ hấp thụ tử ngoại của chất chuẩn. - Định lượng: theo phương pháp quang phổ tử ngoại: dung dịch mafenid acetat chuẩn nồng độ 200 µg/ml trong axít hydroclorid 0,01N. Dung dịch mẫu pha theo cách sau: lấy một lượng kem chứa 100 mg mafenid acetat vào một phễu tách dung tích 60 ml. Thêm 20 ml cloroform hòa tan hoàn toàn, sau đó thêm 20 ml nước lắc trong vòng 2 phút cho tách lớp hoàn toàn. Chiết lại bằng 20 ml cloroform và loại bỏ lớp cloroform ở phía dưới. Chuyển pha nước lọc qua phễu lọc vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ nước vào bình 100 ml. Lấy 30 ml ly tâm cho vào bình định mức 100 ml, thêm 1 ml axít hydroclorid 0,01N và bổ sung nước vừa đủ. Tiến hành đo phổ bằng máy UV-Vis tại bước sóng 267 nm. Cột 1 cm. Nước trắng là axít hydroclorid 0,01N. Kết quả tính theo công thức: At x mc x HLc x dt x 100 X (%) = Ac x mt x HLnhãn x dc Trong đó, At, Ac: độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn; mt, mc: khối lượng cân của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (g); HLc, HLnhãn: hàm lượng của dung dịch chuẩn và hàm lượng theo nhãn (%); dt, dc: độ pha loãng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 16 * Phương pháp đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của sản phẩm: - Sử dụng phương pháp khuếch tán trên gel thạch theo nguyên tắc: mẫu thử đặt trên lớp gel thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch ức chế phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. - Chủng chỉ thị: trực khuẩn mủ xanh được phân lập tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Bệnh viện Bỏng Quốc gia. - Sử dụng thuốc đối chứng kem silvirin 1% (Ấn Độ). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả bào chế kem mafenid acetat 8,5%. * Thiết lập công thức bào chế kem mafenid acetat 8,5%: Thiết lập công thức bào chế kem mafenid acetat 8,5% với tỷ lệ các thành phần không thay đổi gồm: hoạt chất mafenid acetat 8,5 g; vitamin E 0,4 g; EDTA 0,07 g; methyl paraben/propyl paraben/ethanol 96%: 0,186 g/0,54 g/0,93 g; nước cất vừa đủ 100 g. Thành phần khác trong kem thay đổi từ công thức 1 đến công thức 10, thay đổi này quyết định đến thể chất và độ ổn định của kem thuốc và đánh giá theo phương pháp bào chế kem mafenid acetat 8,5% thu được kết quả: Bảng 1: Thành phần và độ ổn định của các công thức kem mafenid acetat khảo sát. Công thức Tên nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Pha dầu Cetostearyl alcohol 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Axít stearic 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Eumulgin HRE40 0 0 2 2 4 4 6 6 8 8 Dầu paraffin 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 Pha nước Tween 80 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 Propylen glycol 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 Khả năng tách lớp - - - - + + + + - - (-: tách lớp; +: không tách lớp) Chỉ có công thức 5, 6, 7, 8 đạt yêu cầu kiểm tra về độ ổn định, kem vẫn mịn đẹp, bền vững, không bị tách lớp. Điều này là do ở các công thức này, tỷ lệ chất nhũ hóa cũng như tỷ lệ các thành phần tá dược thân dầu, thân nước phù hợp, đảm bảo yêu cầu về độ ổn định của kem trong điều kiện lão hóa cấp tốc. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 17 * Kết quả đánh giá khả năng giải phóng mafenid acetat ra khỏi kem thuốc: Đánh giá khả năng giải phóng dược chất của 4 công thức kem vừa bào chế được (CT5, CT6, CT7, CT8) tại 4 thời điểm 30, 60, 90 và 120 phút. Hình 1: Đồ thị so sánh phần trăm mafenid acetat giải phóng. Phần trăm giải phóng mafenid acetat tăng theo thời gian ở các công thức. Khi so sánh giữa các công thức với nhau thấy, ở công thức 7, phần trăm giải phóng hoạt chất tốt nhất tại cả 4 thời điểm. Điều này cho thấy, ở công thức 7, tỷ lệ pha dầu và pha nước hoàn toàn phù hợp tạo ra một kem thuốc vừa đạt yêu cầu về thể chất, độ ổn định vừa có khả năng giải phóng hoạt chất ra khỏi cốt tá dược tốt nhất. Do đó, công thức 7 được lựa chọn để bào chế kem mafenid acetat 8,5% với thành phần pha dầu: cetostearyl alcohol, axít stearic, eumulgin HRE 40, dầu parafin, vitamin E; thành phần pha nước: mafenid acetat, Tween 80, propylen glycol, EDTA, methyl paraben, propyl paraben, ethanol 96%, nước cất. 2. Kết quả đánh giá chất lượng kem mafenid acetat 8,5%. - Về hình thức thể chất: kem thuốc mafenid acetat bào chế được có màu trắng, mịn màng đồng nhất, dễ bám dính lên bề mặt da khi bôi. - Độ đồng nhất: lấy 0,1 g kem, dàn thành lớp mỏng trên lam kính, quan sát thấy mẫu kem đều mịn màng, đồng nhất, không có tiểu phân lạ, hay tiểu phân có kích thước lớn. - Về độ đồng đều khối lượng: sai số độ đồng đều khối lượng của kem nằm trong giới hạn cho phép, vì vậy kem thuốc đóng hộp đạt yêu cầu về độ đồng đều khối lượng. - Định tính: tiến hành thực hiện theo phương pháp đánh giá chất lượng kem mafenid acetat 8,5% cho kết quả: phổ UV của dung dịch chuẩn và dung dịch thử có hình dạng giống nhau, hai đỉnh cực đại hấp thụ ở 267 nm và 274 nm, chứng tỏ hoạt chất mafenid acetat có mặt trong kem thuốc. - Định lượng: tiến hành thực hiện theo phương pháp đánh giá chất lượng kem mafenid acetat 8,5% cho kết quả: T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 18 Bảng 2: Kết quả định lượng kem mafenid acetat. Lần Hàm lượng (%) Mẫu 1 2 3 X ± SD 1 103,44 103,41 103,48 103,44 ± 0,55 2 102,34 102,42 102,41 102,39 ± 0,04 Hàm lượng mafenid acetat trung bình nằm trong giới hạn từ 90 - 110%. Vì vậy, chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng quy định trong chuyên luận của UPS 38. 3. Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của kem mafenid acetat 8,5%. Tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của kem mafenid acetat 8,5% trên chủng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh theo phương pháp khuếch tán trên gel thạch, tiến hành song song với thuốc đối chiếu silvirin 1%, kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn trình bày ở bảng 3 và hình 2. Hình 2: Hình ảnh thử tác dụng kháng khuẩn trên trực khuẩn mủ xanh. (A: kem mafenid acetat; B: kem silvirin) Bảng 3: So sánh đường kính vòng vô khuẩn của kem mafenid acetat 8,5% và thuốc đối chứng (n = 5). Đường kính vòng vô khuẩn (mm) (X ± SD) Vi khuẩn Mafenid acetat 8,5% Silvirin 1% p P. aeruginosa 21,84 ± 3,12 4,23 ± 0,12 < 0,05 Kết quả ở hình 2 và bảng 3: đường kính vòng vô khuẩn của kem mafenid acetat 8,5% rất rộng, lớn hơn gần 5 lần so với kem silvirin 1%. Điều này cho thấy, tác dụng kháng khuẩn lên chủng trực khuẩn mủ xanh của kem mafenid acetat rất hiệu quả và đạt yêu cầu của sản phẩm điều trị tại chỗ vết thương, vết bỏng. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 19 KẾT LUẬN Đã xây dựng được công thức bào chế kem mafenid acetat 8,5% đạt tiêu chuẩn chất lượng theo các tiêu chí được ghi trong chuyên luận thuốc mỡ của DĐVN IV và tiêu chuẩn của USP 38. Đồng thời, kem mafenid acetat 8,5% có tác dụng trên chủng trực khuẩn mủ xanh, đường kính vòng vô khuẩn lớn gấp 5 lần so với thuốc đối chứng kem silvirin 1% (Ấn Độ) trên cùng điều kiện thí nghiệm (p < 0,05). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội. Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc. 1997, tập I, tr.25-48. 2. Hướng dẫn của ASEAN về nghiên cứu độ ổn định của thuốc. 2005, tr.204-205. 3. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học. Hà Nội. 2009. 4. Afshari et al. 2.5% mafenide acetate: A cost-effective alternative to the 5% solution for burn wounds. Journal of Burn Care & Research. 2016, pp.26-30. 5. Maggi S.P et al. The efficacy of 5% sulfamylon solution for the treatment of contaminated explanted human meshed skin graftsp. 1999, pp.237-241. 6. United State Pharmacopeia 38. NF33. 2015, p.4168.