Xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài tảo Pseudonitzschia sp.G3 được phân lập ở thành phố Hải phòng dựa trên trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8 S-ITS2 - Hoàng Thị Lan Anh

68 28(4): 68-73 Tạp chí Sinh học 12-2006 Xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài tảo Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc phân lập ở thành phố Hải phòng dựa trên trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8 S-ITS2 Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Chu Văn Thuộc Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng biển Hiện nay, tảo độc đang là mối quan tâm hàng đầu của ngành nuôi trồng thủy hải sản bởi những thiệt hại do chúng gây ra −ớc tính lên tới hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm [3]. Nhiều loài tảo đã đ−ợc khẳng định là nguồn gốc sinh ra các độc tố đe doạ tàn phá khu hệ động thực vật và ảnh h−ởng nghiêm trọng tới sức khỏe của con ng−ời. Để giảm thiểu những tác hại do tảo độc gây ra, vấn đề giám sát cần đ−ợc tiến hành th−ờng xuyên và rộng khắp. ở n−ớc ta, việc nghiên cứu tảo độc mới đ−ợc tiến hành một vài năm gần đây. Theo thống kê của Lasen và cs. (2004), trong số trên 70 loài tảo có khả năng gây độc đ−ợc xác định phân bố ở các vùng ven biển Việt Nam, có 11 loài tảo silic thuộc chi Pseudonitzschia đã đ−ợc mô tả, trong đó 2 loài Pseudonitzschia pungens và P. calliantha đ−ợc xem là những loài chiếm −u thế, có sự tích tụ tiềm tàng độc tố axit domoic gây hội chứng ngộ độc mất trí nhớ tạm thời (ASP-amnesic shellfish poisoning) trong các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ [7]. Chi Pseudonitzschia bắt đầu đ−ợc quan tâm nhiều hơn kể từ khi phát hiện ra axit domoic do loài P. multiseries sinh ra làm 153 ng−ời trên đảo Hoàng tử Edward (Canada) bị ngộ độc và theo con số thống kê gần đây, đã phát hiện trên thế giới có 10 loài thuộc chi này có khả năng sinh ra axit domoic, gây ảnh h−ởng tới hệ tiêu hóa, hệ thần kinh và có thể gây tử vong cho ng−ời [2, 4, 7]. Do vậy, việc phát hiện sự có mặt của các loài trong chi tảo này trong các thủy vực, để đ−a ra các biện pháp nhằm giảm thiểu tác hại của chúng là rất quan trọng. Hiện nay trên thế giới, trong phân loại tảo, các kỹ thuật sinh học phân tử nh− đọc và so sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S- ITS2 đang đ−ợc sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu phát sinh chủng loại của tảo nói chung và của chi Pseudonitzschia nói riêng, bởi đây là vùng xảy ra nhiều biến đổi đặc tr−ng cho loài trong quá trình tiến hóa [1, 3, 5, 6, 8]. Với mẫu nghiên cứu là loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc phân lập ở Đồ Sơn thuộc thành phố Hải Phòng, chúng tôi đã tiến hành định tên bằng ph−ơng pháp quan sát hình thái và phân tích trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2. Những kết quả thu đ−ợc đã góp phần khẳng định vai trò của sinh học phân tử trong việc hỗ trợ ph−ơng pháp phân loại tảo truyền thống dựa vào hình thái. I. Ph−ơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu - Vật mẫu của loài tảo Pseudonitzschia sp.G3 do Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng biển Hải Phòng phân lập và cung cấp, đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng K có nồng độ muối 24‰, ở nhiệt độ 25oC để thu sinh khối cho b−ớc tách chiết ADN. - Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8S-ITS2 của 12 loài thuộc chi Pseudonitzschia bao gồm: Pseudonitzschia pungens (Grunow ex P. T. Cleve) Hasle 1993 có số đăng ký tại Ngân hàng gien quốc tế là AY544769, Pseudonitzschia sp..Hobart5 (AY257851), P. australis Frenguelli (ay452528), P. calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle 2003 (AY257857), P. cf. australis Frenguelli (AY559850), P. cf. subpacifica (Hasle) Hasle (AY257860), P. cuspidata (Hasle) Hasle 69 1993 (AY257853), P. delicatissima (P. T. Cleve) Heiden 1928 (AY257849), P. fraudulenta (P. T. Cleve) Hasle (AY257840), P. galaxiae Lundholm et Moestrup (AY257850), P. micropora Priisholm et Moestrup 2002 (AY257847) và P. multiseries (Hasle) Hasle (AY257844) đ−ợc sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại. - TOPO Kit của hãng Invitrogen (Mỹ) dùng để tách dòng gien. 2. Ph−ơng pháp - ADN tổng số của loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc tách chiết theo ph−ơng pháp của Y. K. Hong có cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam [5]. - Đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 đ−ợc nhân bằng kỹ thuật PCR từ ADN tổng số với cặp mồi: Pseu F: 5’-GGATCATTACCACACCGAT- CCAAG -3’. PseuR: 5’-CGCAGATTCACATCCTGAG- CTAGT- 3’. - Phản ứng PCR đ−ợc thực hiện với 20 àl hỗn hợp phản ứng chứa 1 àl ADN khuôn; 2 àl đệm 10X; 1,5 àl dNTP với nồng độ 2,5 mM mỗi loại; 0,3 àl Taq polymeraza. Chu trình nhiệt đ−ợc tiến hành nh− sau: 94oC-3 phút (94oC-30 giây, 55oC-1 phút, 72oC-1 phút), lặp lại 35 chu kỳ; 72oC-5 phút; giữ sản phẩm ở 4oC. Sau khi chạy điện di để kiểm tra trên gel agaroza 0,8%, sản phẩm PCR đ−ợc gắn vào vectơ pCR2.1 TOPO và đ−ợc biến nạp vào chủng vi khuẩn Esherichia coli DH5αT1’; cuối cùng đ−ợc nuôi trên môi tr−ờng chọn lọc LB có bổ sung ampixilin, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β- D-galactopyranosit). ADN plasmit đ−ợc tách chiết và kiểm tra sự có mặt của đoạn gien ITS1- 5,8S-ITS2 [9]. - Trình tự nucleotit ở mẫu nghiên cứu đ−ợc thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM (R) 3100-Avant Genetic Analyzer (USA) của Viện Công nghệ sinh học. Dựa trên ch−ơng trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000) và DNASTAR, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài Pseudonitzschia sp.G3 thu tại Đồ Sơn, với trình tự nucleotit của 12 loài Pseudonitzschia đã đ−ợc công bố tại Ngân hàng gien quốc tế. II. Kết quả và thảo luận 1. Mô tả hình thái của loài tảo Pseudo- nitzschia sp.G3 đ−ợc phân lập tại Hải Phòng Hình 1. Chuỗi hai tế bào của loài Pseudonizschia sp.G3 d−ới kính hiển vi quang học D−ới kính hiển vi quang học, vỏ có cấu trúc đối xứng. Hai mép vỏ thuôn đều về hai đỉnh của tế bào, từ khoảng 1/4 chiều dài của tế bào; hai đỉnh của tế bào tròn. Chiều dài của mặt vỏ: 80 ± 4,32, chiều rộng 2 ± 0,36 àm. Trong chuỗi các tế bào gối lên nhau một đoạn bằng 1/4 chiều dài của tế bào. Dựa trên các đặc điểm hình thái, mẫu Pseudonizschia sp.G3 có thể là loài P. pungens [7]. 2. Nhân đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 từ ADN tổng số ADN tổng số đ−ợc tách chiết từ sinh khối của loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ cần thiết để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả đ−ợc chỉ ra trên hình 2. Đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 đ−ợc nhân lên bởi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đ−ợc ký hiệu là Pseu F-Pseu R (cặp mồi này đ−ợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotit của các loài thuộc chi Pseudonitzschia đã công bố tại Ngân hàng gien quốc tế). Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR sẽ có kích th−ớc khoảng 825 bp. Sản phẩm PCR thu đ−ợc là đặc hiệu với kích th−ớc đúng nh− tính toán lý thuyết (hình 3). 70 Hình 2. ảnh điện di kiểm tra ADN của loài Pseudonitzschia sp.G3 Cột 1: thang chuẩn của ADN có kích th−ớc 1 Kb. Cột 2: ADN tổng số của loài Pseudonitzschia sp.G3 Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR Cột 1: thang chuẩn của ADN có kích th−ớc 1 Kb. Cột 2, 3: sản phẩm PCR với cặp mồi Pseu F-Pseu R. 3. Tách dòng đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 Sản phẩm PCR đặc hiệu đ−ợc gắn vào vectơ tách dòng pCR2.1 và biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α T1’. Những khuẩn lạc trắng mọc trên môi tr−ờng nuôi cấy có bổ sung ampixilin và X-gal đ−ợc chọn làm ADN khuôn cho phản ứng PCR-checking với cặp mồi đặc hiệu Pseu F và Pseu R (hình 4). Sau phản ứng PCR-checking, các khuẩn lạc trắng đ−ợc nghi ngờ có mang đoạn gien mong muốn, đ−ợc nuôi cấy và tách chiết ADN plasmit. Các ADN plasmit đ−ợc chọn và cắt kiểm tra bằng enzim cắt giới hạn EcoRI. Kết quả sau khi cắt thu đ−ợc 2 băng: một băng có kích th−ớc khoảng 3,9 kb (kích th−ớc của vectơ gốc) và một băng có kích th−ớc khoảng 825 bp đã chứng tỏ đoạn gien mong muốn đã đ−ợc gắn thành công vào vectơ tách dòng pCR2.1 (hình 5). Cuối cùng, các dòng plasmit tái tổ hợp đ−ợc tách chiết và tinh sạch một l−ợng đủ lớn để dùng cho việc đọc trình tự nucleotit. Hình 4. Kết quả PCR-checking các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp Cột 1-15: các dòng tế bào có mang đoạn gien ITS1- 5,8S-ITS2. Cột 16: thang chuẩn ADN có kích th−ớc 1 kb Hình 5. Kết quả cắt kiểm tra ADN plasmit tái tổ hợp bằng enzim EcoR I. Cột 1-2: vectơ pCR(R) đã gắn sản phẩm PCR của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2. Cột 3: thang chuẩn ADN có kích th−ớc 1 kb 4. So sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của các loài Pseudonitzschia Sau khi xác định đ−ợc trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudo- nitzschia sp.G3, chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự thu đ−ợc với trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của 12 loài Pseudo- nitzschia đã đ−ợc công bố tại Ngân hàng gien quốc tế với sự hỗ trợ của phần mềm DNASTAR và Clustal X nhằm định tên mẫu vật này. Trên hình 6, chúng tôi đ−a ra kết quả so sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 với trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài P. pungens (kết quả so sánh với 11 loài Pseudonitzschia khác không chỉ ra ở đây). Tỷ lệ phần trăm t−ơng đồng của từng cặp trình tự nucleotit của các loài 21 kb 1 2 825 bp 1 2 3 825 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 825 bp 1 2 3 71 Pseudonitzschia đ−ợc thống kê d−ới dạng ma trận tại bảng 1. Kết quả ở bảng 1 cho thấy độ t−ơng đồng của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia nằm trong khoảng 53,1-99,6% và loài Pseudonitzschia sp.G3 có độ t−ơng đồng cao nhất (98,8%) với loài P. pungens (AY544769) và thấp nhất với loài P. calliantha (AY257857 ) (53,1%). P. sp.G3 GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATCTGATTGCACTGGTCTA P.pungens GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATCTGATTGCACTGGTCTA ************************************************************ P.sp.G3 GTATTTTTACTAAACCGCTGCCGTCAAACTTAAACTTGCAACGCGATGATTAATTCCGCC P.pungens GTATTTTTACTAAACCGCTGCCGTCAAACTTAAACTTGCAACGCGATGATTAATTCCGCC ************************************************************ P.sp.G3 TTGCTGCCATTCTTCACGATTGGTAACTGGAAAGAACCAAATGACCTAAAGCAAAAATGA P.pungens TTGCCGCCATTCTTCACGATTGGTAACTGGAAAAAACCAAATGACCTAAAGCAAAAATGA **** **************************** ************************** P.sp.G3 TGCAGTGTTTCGGAGCGCTGAGCGGGCGTCTTAAGTATTAGATGCATACCAAACCGACTC P.pungens TGCGGTGTTTCGGAGCGCTGAGCGGGCGTCTTAAGTATTAGATGCATACCAAACCGACTC *** ******************************************************** P.sp.G3 TATTGCTGGCACTGCACATTACACCTAATACATTACAACTTTCAGCGGTGGATGTCTAGG P.pungens TATTGCTGGCACTGCACATTACACCTAATACATTACAACTTTCAGCGGTGGATGTCTAGG ************************************************************ P.sp.G3 TTCCC-ACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAAGACCTC P.pungens TTCCCCACAATGA--AAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAAGACCTC ***** **** ** ********************************************* P.sp.G3 GTGAATCATCAAGATTTTGAACGCACATTGCGCTTTCGGGTATTCCCGGTAGCATGCTTG P.pungens GTGAATCATCAAGATTTTGAACGCACATTGCGCTTTCGGGTATTCCCGGTAGCATGCTTG ************************************************************ P.sp.G3 TCTGAGTGTCTGTGGATCCCACTCAGCGCTGGCTTCGTGCTGGCTGCTGGTATTTTGGCC P.pungens TCTGAGT--CTGTGGATCCCACTCAGCGCTGGCTTCGTGCTGGCTGCTGGTATTTTGGCC ******* *************************************************** P.sp.G3 GTGACTGAATTTGTTTAGTCTCGGCTTAAGTTTTACGTTAAGTACGTGCATAGATCTAGA P.pungens GTGACTGAATTTGTTTAGTCTCGGCTTAAGTTTTACGTTAAGTACGTGCATAGATCTAGA ************************************************************ P.sp.G3 AAGCTCTGCCCGTTTAGTTAAAAACACGGCGTTGACACTCTTGTCTATCTCTGGTAGGTT P.pungens AAGCTCTGCCCGTTTAGTTAAAAACACGGCGTTGTCACTCTTGTCTATCTCTGGTAGGTT ********************************** ************************* P.sp.G3 TATTCGACTGGAGTTTGCTACGAGTTGTCTATAGCTGTTTTGAAACTACTGGAATGAGCG P.pungens TATTCAACTGGAGTTTGCTACGAGTTGTCTATAGCTGTTTTGAAACTACTGGAATGAGCG ***** ****************************************************** P.sp.G3 CTTGTAGATCTAACTAGCTGGAAACAGTTAGTTATACAATTCCGGATCTCAGATCAAGCA P.pungens CTTGTAGATCTAACTAGCTGGAAACAGTTAGTTATACAATTCCGGATCTCAGATCAAGCA ************************************************************ P.sp.G3 AGAGGACCCGCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTC P.pungens AGAGGACACGCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTC ******* **************************************************** P.sp.G3 CCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG P.pungens CCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG ************************************************* Hình 6. Kết quả so sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 với trình tự nucleotit của đoạn giem ITS1-5,8S-ITS2 của loài P. pungens có mã số là AY544769 tại Ngân hàng gien quốc tế Nh− vậy, có thể thấy 11 sự sai khác trong trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 so với loài P. pungens nh− sau: C125T (đột biến thay thế C bằng T tại vị trí nucleotit thứ 125), A154G, G184A, C306Del (đột biến mất C ở vị trí 306); đột biến thêm nucleotit T, G, G, T ở vị trí 314, 315, 428, 429, t−ơng ứng; T575A; A606G và A728C. Mồi Pseu F Mồi PseuR 72 Bảng 1 Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm t−ơng đồng (ma trận tam giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác d−ới) của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 giữa các loài trong chi Pseudonitzschia Tỷ lệ phần trăm t−ơng đồng 1 2 3 4 5 6 7 8 8 10 11 12 13 1 79,5 99,6 76,3 77,4 80,5 80,3 77,9 84,8 81,0 77,7 76,6 79,1 1 2 29,1 79,0 76,8 74,0 82,7 74,3 81,0 84,8 74,5 52,3 74,1 53,1 2 3 0,1 29,2 76,8 77,7 81,2 81,1 78,4 85,2 81,4 78,0 76,6 79,4 3 4 33,4 30,9 33,5 74,2 81,6 76,2 79,2 83,5 75,8 73,4 73,7 74,0 4 5 28,7 33,8 28,8 35,6 84,3 76,7 82,5 74,6 61,3 75,0 95,1 60,9 5 6 22,7 22,4 22,8 30,6 25,4 82,3 84,2 94,0 76,6 75,1 82,3 76,5 6 7 29,5 29,2 29,6 31,0 32,4 26,2 81,0 86,1 80,3 74,9 76,7 63,7 7 8 29,4 32,8 29,5 29,8 18,3 21,5 27,8 85,5 75,8 72,5 80,4 73,7 8 9 22,0 19,8 22,1 27,9 23,5 7,6 23,9 19,5 77,8 76,0 71,2 77,3 9 10 24,4 33,7 24,5 36,4 33,1 30,4 29,4 34,0 28,8 82,4 61,3 83,2 10 11 22,4 36,4 22,5 36,0 30,4 32,7 32,6 33,6 29,6 16,4 73,4 98,8 11 12 30,6 36,1 30,9 36,7 3,6 27,6 34,5 21,4 26,3 35,5 33,3 73,9 12 K h oả n g cá ch d i tr u yề n 13 21,4 34,7 21,6 35,0 28,8 31,1 31,4 32,2 28,0 15,8 1,0 31,9 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ghi chú: các loài đ−ợc đánh số theo thứ tự: 1. P. australis; 2. P. calliantha; 3. P. cf. australis; 4. P. cf. subpacifica; 5. P. cuspidata; 6. P. delicatissima; 7. P. fraudulenta; 8. P. galaxiae; 9. P. micropora; 10. P. multiseries; 11. P. pungens; 12. Pseudonitzschia sp. Hobart5; 13. Pseudonitzschia sp. G3. Hình 7. Cây phát sinh chủng loại của 13 loài Pseudonitzschia dựa trên việc so sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 Dựa vào khoảng cách di truyền và tỷ lệ % t−ơng đồng trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của các loài Pseudonitzschia và bằng ch−ơng trình DNASTAR, chúng tôi đã xây dựng cây phát sinh chủng loại của 13 loài Pseudonitzschia. Cây phát sinh chủng loại đ−ợc chỉ ra trên hình 7 cho thấy 13 loài trong chi Pseudonitzschia đã chia thành 3 nhóm chính: nhóm 1 có một loài là P. cf. subpacifica; nhóm 2 có 3 loài gồm: P. calliantha, P. delicatissima và P. micropora; nhóm 3 chia thành hai nhóm nhỏ, bao gồm các loài: P. galaxiae, Pseudonitzschia sp.Hobart5, P. cuspidata, P. flaudulenta, P. australis, P. cf. australis, P. multiseries, P. pungens và Pseudonitzschia sp. G3; trong đó, loài Pseudonitzschia sp.G3 có mối quan hệ di truyền rất gần gũi với loài P. pungens. Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8S-ITS2 thu đ−ợc của loài Pseudonitzschia P. galaxiae Pseudonitzschia sp.Hobart5 P. cf. subpacifica P. calliantha P. delicatissima P. micropora P. cuspidata P. fraudulenta P. australis P. cf. australis P. multiseries Pseudonizschia sp.G3 P. pungens 73 sp.G3 đã đ−ợc đăng ký tại Ngân hàng gien quốc tế với số đăng ký đ−ợc cấp là DQ166533. III. Kết luận 1. Việc phân tích trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 đã cho thấy loài này có quan hệ di truyền gần gũi với loài Pseudonitzschia pungens (AY544769) với độ t−ơng đồng đạt đến 98,8%. Kết quả thu đ−ợc cùng với kết quả trong nghiên cứu về đặc điểm hình thái đã cho phép chúng tôi kết luận loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc thu tại Đồ Sơn, thành phố Hải Phòng có thể là loài P. pungens. 2. Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 đã đ−ợc đăng ký tại Ngân hàng gien quốc tế với số đăng ký là DQ166533. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Đức Bách và cs., 2003: Tạp chí Sinh học, 25(3): 1-4. Hà Nội. 2. Bates S. S., 2000: J. Phycol., 36: 978- 985. 3. Cagelost G. A. et al., 1997: Applied and Environmental Microbiology, 63(12): 4859- 4865. 4. Fehling J. et al., 2004: J. Phycol., 40: 622- 630. 5. Đặng Diễm Hồng và cs., 2003: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống: 913-916. Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ 2 nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học. Huế. 6. Đặng Diễm Hồng và cs., 2002: Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 40(số đặc biệt): 161-167. 7. J. Lasen and N. L. Nguyen, 2004: Opera Botanica 140. 8. Nina Lundholm N. et al., 2003: Phycol., 39: 797-813. 9. Sambrook J. and Russell D. W., 2001: A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Construction of the phylogenetic tree of Pseudonitzschia sp.G3 isolated from HaiPhong city basing on the nucleotide sequence of the ITS1-5.8S-ITS2 gene fragment Hoang Thi Lan Anh, Dang Diem Hong, Chu Van Thuoc Summary Some species belonging to the marine diatom genus Pseudonitzschia were recognized to have capacity to produce domoic acid which caused amnesic shellfish poisoning (ASP). According to the traditional classification, researchers have relied on the morphological characters to identify the species of the genus Pseudonitzschia. In addition, the morphological study of the species belonging to the genus Pseudonitzschia were supported by phylogenetic analyses of the nuclear- encoded internal transcribed spacer 1-5.8S and the internal transcibed 2 rDNA (ITS1-5.8S-ITS2). In this study, the length of the ITS1-5.8S-ITS2 gene fragment of Pseudonitzschia sp.G3 was estimated about 825 bp. After, this fragment was amplified from Pseudonitzschia sp.G3 by using genomic DNA; the PCR products have been cloned into the pCR2.1 vector and the recombinant plasmids were transformed into the E. coli strain DH5α T1’. The result of the cloning was confirmed by PCR checking method and the restriction analysis by EcoRI enzyme. By comparing the Pseudonitzschia sp.G3 nucleotide sequence with the published nucleotide sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 gene fragments of Pseudonitzschia species in Gene Bank and constructing the phylogenetic tree, the phylogenetic relationships between Pseudonitzschia sp.G3 and 12 other Pseudonitzschia species were established. Our results indicated that Pseudonitzschia sp.G3 collected in Haiphong city had close phylogenetic relationship with Pseudonitzschia pungens (with accession number AY544769) with homological coefficient of 98.8%. The obtained results in this paper allowed us to conclude that may be the studied Pseudonitzschia sp.G3 species was Pseudonitzschia pungens. Ngày nhận bài: 30-8-2005