Xác định, xếp loại và khảo sát sự biểu hiện của các gen mã hóa dehydrin (dhn) ở cây đậu tương (glycine max (l.) merr.) bằng phân tích in silico

TẠP CHÍ KHOA HỌC Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Số 10 (9/2017) tr 47 - 54 47 XÁC ĐỊNH, XẾP LOẠI VÀ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA DEHYDRIN (DHN) Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merr.) BẰNG PHÂN TÍCH IN SILICO Vũ Thị Nự, Nguyễn Thị Sơn, Hà Mạnh Linh6 Trường Đại học Tây Bắc Tóm tắt: Bằng phân tích in silico, chúng tôi đã xác định được 11 gen mã hóa cho các protein Dehydrin (DHN) trong hệ gen của cây đậu tương. Các protein suy diễn của các gen này đều có mang trình tự bảo thủ đặc hiệu cho DHN là phân mảnh K đã được báo cáo ở nhiều loài. Phân tích cây phát sinh chủng loại cho thấy, các DHN của cây đậu tương nằm trên ba nhánh khác nhau, có một số hiện tượng nhân gen xảy ra sau quá trình biệt hóa loài. Kết quả phân tích RNAseq cho thấy có 7 trong 11 gen DHN biểu hiện ở ít nhất một loại mô của cây đậu tương, chỉ hai gen GmDHN1 và GmDHN9 biểu hiện ở tất cả các loại mô nghiên cứu, đồng thời hai gen này cũng biểu hiện mạnh hơn các gen khác ở hầu hết các mô. Hai gen GmDHN1 và GmDHN9 biểu hiện mạnh ở mô hoa, mô vỏ quả, rễ và biểu hiện yếu hơn ở mô hạt, lá non và nốt sần. Gen GmDHN6 và GmDHN8, biểu hiện mạnh hơn so với các gen còn lại ở hạt trong giai đoạn phát triển muộn, các gen GmDHN2, GmDHN3, GmDHN5 và GmDHN11 không biểu hiện ở các loại mô được nghiên cứu. Từ khóa: Biểu hiện gen, cây di truyền, Dehydrin (DHN), đậu tương. 1. Mở đầu Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là một trong những cây trồng quan trọng, có lịch sử trồng trọt lâu đời, được trồng ở nhiều nước trên thế giới từ châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ, nhất là ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Hạt đậu tương là loại sản phẩm có giá trị đồng thời cả về protein và lipit [3]. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương rất cao, với hàm lượng protein từ 38 - 40%, lipit từ 15 - 20%, hyđratcacbon từ 15 - 16% và muối khoáng quan trọng cho sự sống. Ở nước ta, trong những thập niên gần đây diện tích trồng đậu tương không ngừng tăng lên [9]. Nhờ giá trị cao, hệ gen của đậu tương đã được giải trình tự vào năm 2010 bởi tập thể các nhà khoa học dẫn đầu bởi G. Stacey, R. Shoemaker, S. Jackson, J. Schmutz, và D. Rokhsar. Phiên bản hệ gen của cây đậu tương hiện có kích thước xấp xỉ 975 Mb, gồm có 20 nhiễm sắc thể [15]. Đối với một loài sinh vật có hệ gen được giải trình tự, việc nghiên cứu về cấu trúc và chức năng hệ gen (genomics) có ý nghĩa rất quan trọng. Ở Việt Nam, có nhiều nguyên nhân làm giảm diện tích cũng như năng suất đậu tương như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ, kĩ thuật, mùa vụ, hạn hán, đặc điểm di truyền của các giống. Trong đó, hạn hán là nguyên nhân chủ yếu làm giảm diện tích và năng suất của đậu tương do đó việc xác định và nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương là việc làm cần thiết. Dehydrin (DHN) là một họ bao gồm nhiều loại protein có số lượng lớn trong giai đoạn phát triển phôi muộn, đóng vai trò quan trọng trong khả năng thích nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi [5, 8]. DHN gồm các protein được xếp vào nhóm II (LEA2-D11) của họ Late 6 Ngày nhận bài: 03/01/2017. Ngày nhận kết quả phản biện: 10/5/2017. Ngày nhận đăng: 20/9/2017 Liên lạc: Vũ Thị Nự, e - mail: vuthinu09@gmail.com 48 Embryogenesis Abundant protein (LEA) [5]. Các DHN được xác định đều có ái lực cao với nước, tính chất này giúp chúng giữ được nước ngay cả trong điều kiện tế bào mất nước mạnh. DHN bền với nhiệt và có thể giữ nguyên vẹn cấu trúc không bị thay đổi trong dung dịch nước ở nhiệt độ đến 100C, nhóm này có 3 đoạn bảo thủ kí hiệu là Y, S, K [5, 8]. Dựa vào cấu trúc DHN được chia thành 6 nhóm: Kn, SKn, KnS, YnKn và YnSKn và SKS [11]. DHN phân bố trong nhiều mô tế bào ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau: Mô sinh dưỡng và mô sinh thực. Một số DHN như protein RAB18 của Arabidopsis và RAB (response to abscisic acid) của ngô tìm thấy trong hạt; ở hầu hết các mô của mầm và lá mầm [8]. Trong tế bào, DHN được phát hiện ở tế bào chất, nhân, màng tế bào và ty thể. Phần lớn các DHN được tìm thấy trong cây khi bị tác động của điều kiện bất lợi, tác động của abscisic acid (ABA), hạn, lạnh, độ mặn cao [10]. Hiện nay, đã có hơn 800 trình tự gen DHN đã được phân lập và hơn 700 trình tự protein DHN đã được xác định từ nhiều loài thực vật khác nhau (hạt kín, hạt trần và thực vật bậc thấp) [8]. Trên cây đậu tương, một số gen DHN cũng đã được tách dòng và xác định trình tự [12, 18]. Trong nghiên cứu này, bài báo sử dụng phương pháp In Silico để xác định trình tự của các DHN trong hệ gen của cây đậu tương, xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân loại các DHN, đồng thời khảo sát sự biểu hiện của các gen DHN ở loài cây này. 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Cơ sở dữ liệu về các trình tự hệ gen và RNAseq ở cây đậu tương Các trình tự được khai thác từ cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen (NCBI). Trong đó, trình tự hệ gen của cây đậu tương theo công bố của Schmutz và cs. (2010), dữ liệu RNAseq theo Severin và cs. (2010), các trình tự DHN của cây Arabidopsis theo Hundertmark và Hincha (2008) [6, 15, 16]. 2.2. Xác định các gen thuộc họ DHN ở cây đậu tương Mười protein DHN của cây Arabidopsisthaliana (AT1G20440, AT1G20450, AT1G54410, AT1G76180, AT2G21490, AT3G50970, AT3G50980, AT4G38410, AT4G39130, AT5G66400) [6] được dùng làm khuôn dò để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu nucleotide của toàn hệ gen của cây đậu tương nhờ chương trình TBLASTN theo Cao Phi Bằng và Trần Thị Thanh Huyền (2015) [1]. 2.3. Các đặc điểm hóa - lí Các đặc điểm vật lí, hóa học của các gen/protein nghiên cứu được khảo sát nhờ các công cụ của ExPASy (Expert Protein Analysis System) [3]. 2.4. Xây dựng cây phả hệ Cây phả hệ được xây dựng từ các trình tự protein nghiên cứu của các loài Arabidopsis, dương và quýt đường đã được sắp xếp nhờ phần mềm MEGA5 bằng sử dụng phương pháp Maximum Likelihood và tuân theo các tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), dữ liệu được xử lí là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại [17]. 49 2.5. Khảo sát sự biểu hiện gen Bảng 1. Đặc điểm gen dehydrin của cây đậu tƣơng Gen Tên locus Chiều dài gen/ đoạn mã hóa Kích thước protein suy diễn (aa) Khối lượng phân tử protein suy diễn (KD) Chỉ số ưa nước Chỉ số béo pI Số itron GmDHN1 Glyma04g01130 1375/645 214 24,16 -1,509 50,09 5,53 1 GmDHN2 Glyma04g01181 657/501 166 17,32 -0,971 51,81 9,22 1 GmDHN3 Glyma06g01171 540/400 132 13,34 -1,36 51,17 5,22 2 GmDHN4 Glyma07g10030 1730/732 243 26,55 -1,211 39,58 6,18 2 GmDHN5 Glyma08g05361 276/276 91 9,90 -1,062 55,71 6,64 0 GmDHN6 Glyma09g31740 1218/762 253 26,63 -1,244 27,79 6,29 2 GmDHN7 Glyma12g36430 1650/408 135 14,69 -1,066 62,15 5,54 1 GmDHN8 Glyma13g27120 1815/420 139 15,13 -1,186 51,22 5,52 1 GmDHN9 Glyma16g04190 1406/339 112 12,59 -1,874 31,34 6,24 1 GmDHN10 Glyma16g04200 1351/255 84 9,44 -1,942 32,50 6,21 1 GmDHN11 Glyma17g24193 3231/498 165 18,89 -1,623 46,06 6,92 2 Sự biểu hiện của các gen được phân tích thông qua ngân hàng RNAseq của cây đậu tương được xây dựng bởi Severin và cs. (2010) [16]. Các gen được khảo sát bằng cách đếm số lượng trình tự biểu hiện trong các cơ sở dữ liệu tồn tại trên trang web NCBI nhờ chương trình TBLASTN [1]. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Số lượng và đặc điểm các gen dehydrin của cây đậu tương Sử dụng mười protein dehydrin của cây Arabidopsis thaliana làm khuôn dò, đã tìm thấy tổng số 11 gen mã hóa cho các dehydrin ở trong toàn bộ hệ gen của cây đậu tương. Các locus gen tìm được tương ứng với các protein khuôn dò như sau: Protein AT1G20440 tìm được 4 gen (Glyma09g31740, Glyma06g01171, Glyma04g01181 và Glyma04g01130); AT1G20450 tìm được 1 gen (Glyma16g04190); AT1G54410 tìm được 2 gen (Glyma17g24193 và Glyma16g04200); AT1G76180 tìm được 4 gen (Glyma12g36430, Glyma13g27120, Glyma08g05361 và Glyma07g10030); các protein còn lại không tìm được gen tương ứng. Phân tích cấu trúc bậc một suy diễn các protein DHN của cây đậu tương, cho thấy các protein này đều mang các vùng bảo thủ đặc hiệu (Hình 1) cho các DHN đã được báo cáo ở nhiều loài khác là phân mảnh K. Các gen DHN của cây đậu tương có độ dài từ 276 tới 3231 nucleotide, kích thước của trình tự mã hóa của các gen là từ 255 đến 762 nucleotide. Trình tự các protein suy diễn có kích thước từ 84 tới 253 amino acid, tương ứng với khối lượng phân tử từ 9,44 KD tới 26,63 50 KD. Hầu hết các dehydrin của cây đậu tương đều có tính axit yếu, pI của các protein này nằm trong khoảng 5,22 tới 6,92. Riêng GmDHN2 có tính bazơ, pI bằng 9,22 (Bảng 1). Các DHN cây đậu tương có tính ưa nước tương đối cao, chỉ số ưa nước từ -0,971 đến -1,942 trong đó cao nhất là GmDHN10. Tính ưa nước của các DHN ở cây đậu tương cũng tương đương với tính ưa nước của các DHN của cây quýt đường (Citrus clementina) đã được báo cáo [2]. Các gen này có chỉ số béo khác nhau dao động từ 31,34 đến 62,15 cao hơn so với các DHN ở cây quýt đường (Citrus clementina) [2]. Hình 1. Kết quả sắp dãy các protein DHN của cây đậu tƣơng Ghi chú: Dấu  đánh dấu các amino acid bảo thủ, các kí tự được đóng khung thể hiện vùng bảo thủ. 51 3.2. Phân tích cây phả hệ Cây phả hệ được xây dựng từ các DHN của cây đậu tương và các loài cây khác (Arabidopsis, dương, quýt) được thể hiện ở Hình 2. Hình 2. Cây phả hệ đƣợc xây dựng từ các DHN của các loài A.thaliana (At), đậu tƣơng (Gm), dƣơng (Ptr) và quýt (Ccl) Các DHN của cây đậu tương nằm trên ba nhánh khác nhau. Nhánh thứ nhất gồm GmDHN2, GmDHN7 và GmDHN8. Ba trình tự này nằm trên cùng nhánh với PtrDHN2 và PtrDHN8 của cây dương. Hai trình tự này của cây dương được xếp vào nhóm YnSKn hay 52 nhóm II. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích trình tự các DHN của cây đậu tương bằng cách xếp dòng. Trong ba protein GmDHN2, GmDHN7 và GmDHN8 có mang hai motif Y, một motif S và hai motif K. Ba trình tự GmDHN4, GmDHN5 và GmDHN6 là các protein tương đồng của các DHN kiểu YnSKn. Nhánh thứ hai chỉ có hai gen GmDHN1 và GmDHN3. Trong cấu trúc protein suy diễn của hai gen này có tồn tại một motif S và nhiều motif K. Ba gen còn lại nằm trên nhánh có nhiều DHN kiểu KnS. Cây phả hệ cho thể thấy ở cây đậu tương có một số hiện tượng nhân gen xảy ra sau quá trình biệt hóa loài. 3.3. Khảo sát sự biểu hiện gen Bảng 2. Sự biểu hiện của các gen dehydrin ở cây đậu tƣơng (đơn vị tính RPKM = số bản mã phiên (ARN)/1000 nucleotide của mã phiên/một triệu bản mã phiên) Chú thích: (DAF = Day after fertilization = ngày sau thụ tinh) Phân tích kết quả RNAseq cho thấy có 7 trong 11 gen DHN biểu hiện ở ít nhất một loại mô của cây đậu tương. Trong đó, hai gen GmDHN1 và GMDHN9 biểu hiện ở tất cả các loại mô nghiên cứu với mức độ mạnh hơn các gen khác (Bảng 2). Hai gen GmDHN1 và GmDHN9 biểu hiện mạnh ở mô hoa, mô vỏ quả, rễ và biểu hiện yếu hơn ở mô hạt, lá non và nốt sần. Gen GmDHN6 và GmDHN8, biểu hiện mạnh hơn so với các gen còn lại ở hạt trong giai đoạn phát triển muộn. Các gen còn lại (GmDHN4, GmDHN7, GmDHN10) biểu hiện rất yếu ở một số mô, một số mô thì không biểu hiện. Bốn gen GmDHN2, GmDHN3, GmDHN5 và GmDHN11 hoàn toàn không được biểu hiện ở các loại mô trong giai đoạn nghiên cứu. 53 4. Kết luận Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp in silico để xác định được 11 gen mã hóa cho Dehydrin trong cây đậu tương. Kết quả phân tích in silico các protein này cho thấy, các protein này đều mang các vùng bảo thủ đặc hiệu quan trọng. Các DHN của cây đậu tương có có độ dài từ 276 tới 3231 nucleotit, kích thước của trình tự mã hóa của các gen từ 255 đến 825 nucleotide. Các dehydrin của cây đậu tương phần lớn đều có tính axit yếu, riêng GmDHN2 có tính bazơ. Các DHN cây đậu tương có tính ưa nước cao, chỉ số ưa nước dao động từ -0,971 đến -1,942. Các gen này cũng có chỉ số béo khác nhau dao động từ 31,34 đến 62,15. Các gen DHN của cây đậu tương xếp trên ba nhánh khác nhau thể hiện đã có sự nhân gen mạnh xảy ra sau quá trình biệt hóa loài. Trong số các DHN được tìm thấy, có 7 trong số 11 gen có biểu hiện ít nhất ở một loại mô. Tuy nhiên các gen này cũng có cường độ biểu hiện khác nhau ở các loại mô khác nhau. Các kết quả nghiên cứu này cung cấp những thông tin quan trọng về đặc điểm, sự biểu hiện của họ gen liên quan đến các protein chống mất nước, có vai trò quan trọng trong khả năng đáp ứng của cây đậu tương với điều kiện bất lợi. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cao Phi Bằng, Trần Thị Thanh Huyền (2015). Phân tích họ gen -amylase ở cây đậu tương (Glycine max), Tạp chí Sinh học, 37(1se): 165-176. [2] Cao Phi Bằng (2014). Đặc trưng hóa và khảo sát sự biểu hiện của họ gen dehydrin ở cây quýt đường (Citrus clementina). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(7): 1134-1139. [3] Friedman M., Brandon D. L. (2001). Nutritional and health benefits of soy proteins. J. Agric Food Chem., 49(3): 1069-1086. [4] Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Wilkins M. R., Appel R. D., Bairoch A. (2005). Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. The proteomics protocols handbook, Springer: 571-607. [5] Hanin M., Brini F., Ebel C., Toda Y., Takeda S. and Masmoudi K. (2011). Plant dehydrins and stress tolerance: versatile proteins for complex mechanisms, Plant Signaling & Behavior, 6(10): 1503-1509. [6] Hundertmark M. and Hincha D. K. (2008). LEA (late embryogenesis abundant) proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana, BMC genomics, 9(1): p. 118. [7] Liu K. (2005), Soybeans as functional foods and ingredients, AOCS Publishing, p. 311. [8] Trần Thị Phương Liên, Vũ Hoài Thu, Bùi Mạnh Cường (2007). Sự đa dạng của gen Dehydrin của một số giống ngô Việt Nam, Tạp chí Công nghệ sinh học, 5(4): 485-491. [9] Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2008). Dehydrin - protein chống mất nước ở thực vật, Tạp chí công nghệ sinh học, 6 (2): 133-143. [10] Trần Thị Phương Liên (2010). Protein và tính chống chịu của thực vật. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr. 180-188. [11] Liu C. C., Li C. M., Liu B. G., et al. (2012). Genome-wide identification and characterization of a Dehydrin gene family in Poplar (Populus trichocarpa), Plant. Mol. Biol. Rep., 30(4): 848-859. 54 [12] Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thu Hiền (2007). Đánh giá khả năng chịu hạn và tách dòng gen mã hóa protein dehydrin (LEA-D11) của một số giống đậu tương (Glycine max L. Merrill) địa phương miền núi, Tạp chí Sinh học, 29(4): 31-41. [13] Morse W. J. (1950). History of soybean production, In: Markley, K.s, soybean and soybean products, Vol. Đ. Interscience Publishrs, Inc, New York London, pp. 5-50. [14] Ricke, P.L & Morse, M.J. (1948). The correct botanical name for the soybean, Jour. Amer. Soc. Agron., (40): 190-191. [15] Schmutz J., Cannon S. B., Schlueter J., Ma J., Mitros T., Nelson W., Hyten D. L., Song Q., Thelen J. J., Cheng J., Xu D., Hellsten U., May G. D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T, Bhattacharyya MK, Sandhu D, Valliyodan B, Lindquist E, Peto M, Grant D, Shu S, Goodstein D., Barry K., Libault M., Sethuraman A., Zhang X. C., Shinozaki K., Nguyen H. T., Wing R. A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R. C., Jackson S. A., (2010). Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature, 463(7278): 178-183. [16] Severin A. J., Woody J. L., Bolon Y. T., Joseph B., Diers B. W., Farmer A. D., Muehlbauer G. J., Nelson R. T., Grant D., Specht J. E., Graham M. A., Cannon S. B., May G. D., Vance C. P., Shoemaker R. C. (2010). RNA-Seq Atlas of Glycine max: a guide to the soybean transcriptome, BMC Plant Biol. 10: p. 160. [17] Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods, Mol. Biol. Evol., 28(10): 2731-2739. [18] Phạm Văn Thiều (2006). Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 5-35. IDENTIFICATION, CLASSIFICATION AND EXPRESSION SURVEY OF DEHYDRIN GENES IN SOYBEAN (Glycine max (L.) Merr.) BY IN SILICO METHODS Vu Thi Nu, Nguyen Thi Son, Ha Manh Linh Tay Bac University Abstract: By using in silico methods, the article has identified 11 genes coding for proteins DHN in the whole genome of soybean. These proteins contained the conserved sequences specific to DHN were fragmented K, which were reported in many species. Analysis of the phylogenetic tree showed that the DHNs of soybean were positioned on three different branches, and some duplication events occurred after the speciation. The results of RNAseq analysis showed that seven of eleven DHN genes were expressed in at least one type of tissue. Only two genes GmDHN1 and GmDHN9 were expressed in all studied tissues, and they also were expressed stronger than the others in almost tissues. The expression of two genes GmDHN1 and GmDHN9 were strong in flower tissue, pod, root and weaker expression in seed, young leaf and nodule. While the expression of GmDHN6 and GmDHN8 were stronger than the other genes in seed at late stage development, gens GmDHN2, GmDHN3, GmDHN5 and GmDHN11 were not expressed in the tissues in this study. Keywords: Dehydrin (DHN), soybean, gene expression, phylogenetic tree.