Xác định sự hiện diện DNA thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 368 XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DÒNG GIẢI TRÌNH TỰ Lương Bắc An*,***, Lê Thị Xuân Thảo*, Nguyễn Khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**, Đỗ Thị Thanh Thủy*. TÓM TẮT Mở đầu: Phân tích DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ không chỉ hữu ích trong sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bộ nhiễm sắc thể như T21, T18, T13 mà còn hữu ích trong tầm soát một số bất thường liên kết giới tính, nhóm máu rhesus D (RhD), -thalassemia, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ.... Tất cả những xét nghiệm này đều tập trung vào phát hiện những trình tự bất thường của thai nhi được di truyền từ bố mẹ. Thai nhi có thừa hưởng những trình tự bất thường hay không được xác định bằng cách phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ. Tuy nhiên, kết quả không phát hiện các trình tự bất thường có thể bị tác động bởi các yếu tố như hàm lượng cffDNA quá thấp hoặc cffDNA bị thoái hoá và thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. Chính vì vậy, cần có một dấu ấn xác định sự hiện diện của cffDNA trong huyết tương thai phụ cho phép kiểm soát các trường hợp âm tính giả. Mục tiêu: Xác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương của thai phụ. Mẫu cfDNA được xử lí bisulfite trước khi thực hiện phản ứng methylation specific PCR (MSP) để phát hiện cffDNA trong máu mẹ. Tạo dòng trình tự DNA của thai và DNA của mẹ vào vector. Giải trình tự xác định các vị trí C-methyl hoá trong DNA thai. Kết quả: Phát hiện được sự hiện diện cffDNA trong máu mẹ thông qua sự methyl hoá promoter gen RASSF1A. Tạo dòng thành công vector chứa trình tự DNA của thai và vector chứa trình tự DNA của mẹ. Kết quả giải trình tự cho thấy toàn bộ 14 vị trí C-methyl hoá trên vùng trình tự DNA của thai đều ở trạng thái methyl hoá. Kết luận: Methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A được xem là một dấu ấn để phát hiện sự tồn tại của cffDNA. Dấu ấn này cho phép phát hiện được những kết quả âm tính giả trong các sàng lọc không xâm lấn sử dụng cffDNA để phân tích. Từ khóa: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, cffDNA. ABTRACTS. IDENTIFICATION THE CIRCULATING FREE FETUS DNA IN MATERNAL BLOOD BY USING MSP COMBINES CLONING AND SEQUENCING TECHINIQUES. Luong Bac An, Le Thi Xuan Thao, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy. Ho Chi Minh City Journal of Medicine *Vol. 22 - No 4- 2018: 367 – 374. Introduction: Circulating fetal DNA analysis in maternal plasma is useful in the non-invasive prenatal screening (NIPS) not only the detection of aneuplodies but also identification of sex-linked disorders, fetal rhesus D (RhD), B-thalassemia and aneuplodies. Many of these applications focus on the detection of paternally inherited disease-causing sequences in maternal plasma. Whether the fetus has inherited such a sequence is inferred by the * Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ Tp. HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Tp.HCM. Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học 369 presence or absence of the target sequence in maternal plasma, but the absence of such a sequence in maternal plasma could alternatively be a result of low cffDNA concentrations or cffDNA loss during samples processing. Thus, the availability of a positive control confirming the presence of fetal DNA in the sample would be avoided false-negative results. Objectives: Identification of cffDNa in maternal blood through differently methylation status of RASSF1A promoter. Methods: A cross-sectional study. CfDNA were extracted, then were treated bisulfate. MSP was carried out to detect cffDNA in maternal plasma. Cloning and sequencing the MSP products to identify the C-methylation bases. Results: we identified the presentation of fetal DNA in maternal blood through methylation of RASSF1A promoter. We have successfully cloned the fetal DNA and maternal DNA into vector. All 14 CpG sites was absolute methylation in fetal DNA sequence. Conclusions: Hypermethylation RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable in maternal plasma. This marker allows the detection of false-negative results when applied to NIPS. Key words: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, NIPS. ĐẶT VẤN ĐỀ. Sự hiện diện của DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ đã mở ra cuộc cách mạng trong sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS). DNA tự do (cfDNA) là những đoạn DNA nhỏ, tồn tại trong máu của thai phụ. CfDNA có nguồn gốc từ các tế bào chết, bị vỡ và giải phóng cfDNA vào hệ tuần hoàn. Các cfDNA này bắt nguồn từ máu thai phụ (tế bào mô mỡ hoặc tế bào máu) và từ thai nhi (tế bào nhau thai). Năm 1997, Lo và cộng sự đã chứng minh cffDNA tồn tại trong suốt thai kỳ(5). Các nghiên cứu chỉ ra rằng cffDNA có thể được tìm thấy vào tuần thứ 7 của thai kỳ và hàm lượng cffDNA tăng dần theo sự phát triển của thai, dao động từ 3-13% trong tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai(8). CffDNA giảm nhanh chóng sau khi sinh và biến mất hoàn toàn khoảng 2 giờ sau sinh(6). Đâặc tính rất hữu ích trong chẩn đoán thai kỳ hiện tại vì tránh được nhầm lẫn với các thai kỳ trước. Năm 1998, Lo và cộng sự công bố đã tách chiết được lượng cffDNA khá cao trong máu thai phụ: 3,4 đến 6,2%, cao hơn khoảng 25 lần so với sử dụng tế bào thai nhi nguyên vẹn trên cùng một lượng huyết tương của mẹ(6). Trong hơn một thập kỷ qua, tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng của cffDNA đã được thể hiện trong các kỹ thuật sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bội nhiễm sắc thể như T21, T18, T1, ngoài ra cffDNA còn được sử dụng để xác định nhóm máu rhesus D (RHD) của thai nhi, bệnh lí liên kết với giới tính, - thalassemia, rối loạn dưỡng cơ, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh,Ngoài ra, hàm lượng cffDNA cũng có thể sử dụng xác định một số bất thường tiền sản khác như tiền sản giật, hay một số bất thường nhau thai(8). Một thách thức lớn nhất khi phát triển các xét nghiệm NIPS đó là hàm lượng cffDNA trong máu mẹ chỉ dao động trong khoảng 3-13% tuỳ thuộc vào tuổi thai(2). Để phân biệt được cffDNA và cfDNA thai phụ, ngưới ta thường dựa trên những đặc điểm di truyền học hoàn toàn khác biệt giữa mẹ và thai, như sự hiện diện của các gen trên nhiễm sắc thể (NST) Y hoặc các điểm đa hình trên cffDNA được thừa hưởng từ người bố có sự khác biệt so với bộ gen của người mẹ(4,9). Rất nhiều phương pháp sàng lọc được phát triển từ rất sớm dựa vào các đặc điểm này của cffDNA, tuy nhiên kèm theo đó là những hạn chế nhất định. Đầu tiên, các xét nghiệm sàng lọc phát triển Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 370 dựa trên sự hiện diện của NST Y chỉ có thể áp dụng trong trường hợp thai nam. Ngoài ra, khi kết quả âm tính cần được kiểm tra lại để loại trừ các khả năng là do mang thai nữ hoặc hàm lượng cffDNA quá thấp dưới ngưỡng phát hiện của thiết bị, thậm chí do sự thất thoát cffDNA trong quá trình thu nhận và xử lí. Thứ hai, phát hiện dựa vào đặc điểm đa hình thừa hưởng từ bố yêu cầu phải có thêm thông tin dữ liệu di truyền từ cha và chỉ có thể áp dụng với số lượng nhỏ đối tượng đã có các điểm đa hình đặc trưng. Vì vậy, điều cần thiết cần phải nghiên cứu những marker có thể phản ánh sự khác biệt giữa DNA thai và DNA mẹ. Các marker này không phụ thuộc vào giới tính thai nhi hay dữ liệu di truyền từ bố. Trong đó, sự khác biệt ngoại di truyền giữa DNA thai và DNA mẹ đang là lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú ý. Trong đó, một số gen được methyl hoá hoàn toàn ở DNA mẹ nhưng không methyl hoá ở tế bào nhau thai như gen PDE9A, SERPINB5(7). Tuy nhiên, cũng có những gen có trạng thái methyl hoá hoàn toàn ngược lại. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng sự methyl hoá vùng promoter của gen RASSF1A để chứng minh sự tồn tại của cffDNA trong huyết tương thai phụ. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Phương pháp nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các thai phụ tại Bệnh viện Từ Dũ trong thời gian từ tháng 10/2017 đến tháng 5/2018. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ sử dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu. Thai phụ được lấy 10ml máu chứa trong ống Streck BCT, lập tức đảo ống 180o khoảng 10 lần để máu trộn đều với các chất bảo quản bên trong ống. Nếu chưa xử lý kịp thời, có thể lưu mẫu ở nhiệt độ phòng (18oC-25oC) trong vòng 14 ngày. Li tâm ống máu với tốc độ 1.600 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó nhẹ nhàng hút lớp huyết tương phía trên, chú ý không chạm phần buffy coat. Li tâm lần 2 huyết tương vừa thu được với tốc độ 13.000 rpm trong 10 phút, ở 4oC, thu dịch nổi. Mẫu huyết tương được trữ trong tủ -80oC. Mẫu huyết tương sau đó được tách chiết bằng bộ kít QIAamp Circulating Nucleic acid (QIAgen). CfDNA thu được trữ -30oC sẵn sàng để tiến hành các bước phân tích tiếp theo. Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP. HCM. Kiểm tra mồi Cặp mồi cho phản ứng MSP tham khảo theo nghiên cứu của Dennis Lo và cộng sự(1). Mồi RASSF1A-qMF/R có đầu 3’ được thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu tại vị trí C-methyl hoá, giúp khuếch đại chính xác những đoạn DNA bị methyl hoá. Mồi RASSF1A-qUF/R có đầu 3’ được thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu tại các vị trí C- không methyl hoá. Các cặp mồi được chúng tôi kiểm tra về khả năng bắt cặp bằng phần mềm CLC MainWorkbench (QIA). Nhiệt độ nóng chảy (Tm) được kiểm tra bằng Tm Tool (https://www.dna.utah.edu/tm/tool.html). Bảng 1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu. Tên primer Trình tự (5’-3’) Tm ( o C) Kích thước PCR (bp) RASSF1A-qMF CGTGTTAACGCGTTGCGTATC 66,36 104 RASSF1A-qMF TACGTAACAAACCCCACGAAGTAAAAACG 68,78 RASSF1A-qUF GGTTGGAGTGTGTTAATGTGTTGTGTATT 67,18 112 RASSF1A-qUR TACATAACAAACCCCACAAACTAAAAACA 65,18 SP6 TAAATCCACTGTGATATCTT 54,79 Tuỳ thuộc đoạn chèn T7 ATTATGCTGAGTGATATCCC 57,97 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học 371 Biến đổi các gốc CpG của cfDNA CfDNA được tiến hành xử lí với sodium bisulfite để biến đổi toàn bộ các vị trí Cytosine (C-) không methyl hoá. Dưới tác dụng của sodium bisulfite tất cả các vị trí C- không methyl hoá sẽ chuyển hoá thành uracil trong khi đó các C-methyl hoá sẽ không bị biến đổi. Kết thúc qui trình, trình tự DNA có sự thay đổi, điều này phụ thuộc vào tình trạng methyl hoá tại các vị trí cystosine. Chúng tôi tiến hành chuyển đổi trình tự các cfDNA thu được bằng bộ kít EZ DNA Methylation-Direct TM kit (Zymo Research). Bộ kít EZ DNA Methylation-Direct TM có chứa sodium bisulfite có tác dụng chuyển đổi gốc cytosine chưa methyl hóa thành gốc uracil, còn các gốc cytosine đã methyl hóa được giữ nguyên. Vì vậy, có thể phân biệt được cffDNA trong huyết tương mẹ. Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng MSP (Methylation Specific PCR) Phản ứng MSP được thiết lập để khuếch đại những đoạn DNA chứa các gốc CpG được methyl hoá (DNA thai) bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R. Tương tự, phản ứng MSP được thiết lập để khuếch đại những đoạn DNA chứa các gốc CpG không methyl hoá (DNA mẹ) bằng cặp mồi RASSF1A-qUF/R. Ngoài ra, để chứng minh độ đặc hiệu của cặp mồi RASSF1A-qMF/R, chúng tôi thực hiện phản ứng MSP với mẫu DNA nam giới. Thành phần của phản ứng MSP (bảng 2). Bảng 2. Thành phần phản ứng MSP Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 10X Maxima Buffer 1,5 1X dNTPs 250nm 1,2 20 nM Primer F (10µM) 0,75 500 nM Primer R (10µM) 0,75 500 nM Mg 2+ 1,5 Maxima Taq 0,12 DNA 4 10-30 ng H2O 5,18 Vừa đủ 15 µl Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức). Chu kì nhiệt: khởi đầu tại 95oC trong 4 phút; tiếp theo với 45 chu kì lặp lại các bước 95oC trong 20 giây, 58 oC trong 20 giây, 72oC trong 20 giây; tiếp theo với bước nhiệt 72oC trong 3 phút. Sản phẩm được giữ ở 4oC sau khi chương trình PCR kết thúc. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed và quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDoc- ItTM (UVP, Mỹ). Tạo dòng sản phẩm PCR Chúng tôi sử dụng hệ thống pGEM®T Easy vector với quy trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vector pGEM®T Easy có chứa vùng trình tự promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai bên vùng gắn chèn DNA đích. Quy trình tóm tắt với các bước: Bước 1: Nối sản phẩm PCR với hệ thống vector Phản ứng nối được thiết lập trong phản ứng gồm: 5µl 2X Rapid ligation buffer; 1µl pGEM T Vector (50ng); 1µl T4 DNA ligase (3 Weiss units/µl) và 2 µl sản phẩm PCR. Phản ứng được ủ 4oC qua đêm. Bước 2: Biến nạp vector vào E. coli. Rã đông tế bào JM109 High Efficiency Competent trên đá trong 5 phút; trộn đều 2µl sản phẩm vector đã được nối với 50 µl tế bào đã rã đông; nhẹ nhàng trộn đều hỗn hợp và đặt trên đá 20 phút; shock nhiệt tế bào trong 45-50 giây tại chính xác 42oC, không lắc; ủ trên đá trong 2 phút; bổ sung 900µl môi trường LB đã chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ phòng; ủ tiếp trong 1,5 giờ tại 37oC có lắc nhẹ (~150rpm); hút 100µl dung dịch được sử dụng trải lên bề mặt thạch LB chuẩn bị sẵn có chứa ampicillin 100µg/ml, 0,5mM IPTG và 80µg/ml X-Gal; trải đều mặt đĩa và nuôi ủ 37oC qua đêm. Bước 3: Chọn lọc khuẩn lạc quan tâm Đĩa cấy sau khi được ủ qua đêm sẽ hình thành các khuẩn lạc có màu xanh và trắng. Sử dụng que cấy cẩn thận thu những khuẩn lạc trắng đơn lẻ cho vào 600µl môi trường LB có chứa ampicillin 100µg/ml. Tiếp tục tăng sinh trong 3 giờ tại 37oC. Ly tâm, thu sinh khối. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 372 Bước 4: PCR kiểm tra vùng chứa đoạn chèn. Sử dụng cặp mồi SP6 và T7 có trình tự nằm trên vùng promotor RNA polymerase của vector. Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 10X Maxima Buffer 1,5 1X dNTPs 250nm 1,2 20 nM Primer RASSF1A-Qmf (10µM) 0,75 500 nM Primer RASSF1A-qMR (10µM) 0,75 500 nM Mg 2+ 1,5 Maxima Taq 0,12 DNA plasmid 1 50-100 ng H2O 8,18 Vừa đủ 15 µl Tiến hành phản ứng PCR bằng các cặp mồi SP6/T7 (bảng 1). Chương trình PCR như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 4 phút, 40 chu kỳ với mỗi chu kỳ gồm 3 bước: 95oC/20 giây, 48oC/20 giây, 72oC/20 giây và 1 chu kỳ 72oC trong 2 phút. Sau đó, điện di trên gel 2% tại 100V trong 30 phút để kiểm tra sản phẩm khuếch đại. Giải trình tự Nếu kết quả điện di cho 1 vạch sáng rõ, đúng kích thước thì sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít ExoSAP IT express PCR product cleanup (AB, USA). Sản phẩm được giải trình tự 2 chiều (xuôi và ngược) lần lượt với mồi SP6 và T7. Sản phẩm giải trình tự được đọc bằng hệ thống điện di mao quản ABI 3500 với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench với trình tự tham chiếu của gen RASSF1A tham khảo (NM_007182.4). Xác định sự tồn tại của các nucleotide C bị methyl hoá không thay đổi trong quá trình chuyển đổi gốc CpG. KẾT QUẢ Đánh giá hiệu quả cặp mồi Các cặp mồi tham khảo được kiểm tra bằng phần mềm CLC MainWorkbench. Trình tự của các cặp mồi được thay đổi nhằm bắt cặp bổ sung được với trình tự DNA đã được xử lí bisulfite. Trình tự mồi RASSF1A-qMF có chứa 5 vị trí CpG được methyl hoá, trong đó vị trí đầu 3’ có chứa 1 nucleotide C-methyl. Trình tự mồi RASF1A-qMR có chứa 3 vị trí CpG-methyl hoá, trong đó vị trí đầu 3’ có chứa 1 nucleotide C-methyl hoá, kích thước sản phẩm khuếch đại 104bp. Các vị trí CpG nằm phân bố đều trong trình tự mồi, giúp mồi bắt đặc hiệu hơn (hình 3). Ngoài ra, trình tự mồi RASSF1A-qUF/R không có chứa các vị trí CpG methyl hoá được xem là chứng nội kiểm soát quá trình xử lí bisulfite và đại diện cho sự hiện diện của cfDNA mẹ với kích thước sản phẩm khuếch đại 112bp. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) giữa mồi xuôi và ngược tương đương nhau (bảng1). Kết quả phản ứng MSP Các phản ứng MSP được thiết lập với từng cặp mồi chuyên biệt. Từ hình 1 cho thấy, các giếng chứng âm (giếng 3 cho cặp mồi RASSF1A- qUF/R và giếng 6 cho cặp mồi RASSF1A-qMF/R) không xuất hiện vạch sản phẩm PCR, chứng tỏ phản ứng PCR không xảy ra nhiễm. Giếng 4 xuất hiện vạch chứa sản phẩm khuếch đại của cặp mồi RASSF1A-qUF/R có kích thước 112bp, chứng minh quá trình bisulfite xảy ra, ngoài ra đây là cặp mồi làm chứng nội để kiểm soát phản ứng MSP. Giếng 5 xuất hiện vạch chứa sản phẩm khuếch đại của cặp mồi RASSF1A-qMF/R đúng kích thước 104bp, chứng tỏ phản ứng MSP đã khuếch đại thành công được các đoạn DNA có chứa gốc C-methyl hoá. Bước đầu phát hiện được sự hiện diện của DNA thai. Để khẳng định đây là DNA thai, chúng tôi tiến hành bước tạo dòng và giải trình tự sản phẩm PCR của giếng 5. Để chứng minh sản phẩm ở giếng 5 xuất phát từ DNA thai, không phải từ mẹ hay nói cách khác là chứng minh tình trạng methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A chỉ xảy ra ở DNA thai. Chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện phản ứng MSP trên mẫu DNA nam giới bình thường. Kết quả cho thấy không xuất hiện vạch sản phẩm khi khuếch đại bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R (giếng 1), do đó không có sự methyl hoá xảy ra. Chứng nội sử dụng cặp mồi RASSF1A-qUF/R cho sản phẩm có kích thước mong muốn 112bp (giếng 2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học 373 Kết quả tạo dòng sản phẩm MSP Do kích thước sản phẩm PCR nhỏ (104bp và 112bp) nên chúng tôi chèn sản phẩm MSP vào vector pGEM®T Easy, sử dụng cặp mồi có trình tự trên vector để đọc được toàn bộ đoạn trình tự được chèn quan tâm. Vector có chứa trình tự mã hoá gen kháng kháng sinh ampicillin cùng trình tự promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã hoá của chuỗi -peptide của enzyme - galactosidase. Khuẩn E. coli được nuôi trong môi trường chứa kháng sinh ampicillin, nếu vi khuẩn có chứa vector biến nạp vào sẽ được chọn lọc lại. Ngoài ra, quá trình chèn vào khiến bất hoạt sự hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme - galactosidase không còn hoạt tính phân cắt X-Gal (tạo màu xanh). Do đó, khuẩn lạc màu trắng (mũi tên đỏ) đại diện cho nhóm có trình tự được gắn chèn vào vector (hình 2). Khuẩn lạc trắng được sử dụng trong phản ứng PCR khuẩn lạc. Kết quả điện di sản phẩm gắn chèn DNA thai (giếng 7) cho kích thước 281bp và sản phẩm gắn chèn DNA mẹ (giếng 8) cho kích thước 289bp (hình 1). Kết quả giải trình tự Sản phẩm chèn vào vector được tiến hành giải trình tự 2 chiều với mồi SP6 và T7 nằm trên trình tự vector. Dựa vào sóng trình tự thu nhận được, chân sóng không nhiễu, sóng chỉ chứa duy nhất một đỉnh duy nhất, chứng tỏ chuyển đổi bisulfite đạt hiệu suất cao. Dựa vào chuỗi trình tự DNA thai (màu xanh) cho thấy tất cả vị trí C- methyl hoá (14 vị trí) đều không bị biến đổi sau quá trình bisulfite. Ngoài ra, tất cả vị trí C-methyl hoá này đều không bị biến đổi, cho thấy có sự methyl hoá hoàn toàn của vùng gen RASSF1A. Tuy nhiên, kết quả giải trình tự mới đại diện cho một vùng nhỏ (104bp) của promoter gen RASSF1A nên chưa khẳng định được chỉ số methyl hoá của vùng promoter gen RASSF1A. Ngược lại, chuỗi trình tự DNA mẹ (màu đỏ) cho thấy tất cả các vị trí này đều bị biến đổi hoàn toàn. Từ đó, chúng tôi kết luận đã phát hiện được thành công sự hiện diện của DNA thai tự do trong máu mẹ (hình 3). Hình 1: - Giếng 1: mồi RASSF1A-qMF/R + DNA nam; - Giếng 2: mồi RASSF1A-qUF/R và DNA nam; - Giếng 3 và 6: chứng âm của cặp mồi RASSF1A-qUF/R và RASSF1A-qMF/R; - Giếng 4: mồi RASSF1A-qUF/R; - Giếng 5: mồi RASSF1A-qMF/R, - Giếng 7 và 8 lần lượt là sản phẩm tạo dòng của DNA thai và DNA mẹ. Hình 2: Kết quả khuẩn lạc chứa vector được chèn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 374 Hình 3: Kết quả giải trình tự BÀN LUẬN Sự hiện diện của DNA thai tự do trong huyết tương thai phụ đặc biệt hữu ích trong sàng lọc tiền sản như một số hội chứng di truyền liên quan tới NST giới tính, nhóm máu RhD và - thalassemia. Hầu hết các ứng dụng này đều tập trung vào phát hiện các trình tự gây bệnh di truyền từ bố mẹ trong huyết tương thai phụ. Liệu thai nhi có thừa hưởng những trình tự gây bệnh hay không sẽ được chứng minh rằng có sự tồn tại của các trình tự bất thường trong huyết tương thai phụ, nhưng sự vắng mặt của các trình tự này đôi lúc có thể bị thay đổi do hàm lượng cffDNA quá thấp hoặc cffDNA bị thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. Do vậy, cần phải có một bước xác định sự hiện diện của DNA tự do của thai trước khi trả kết quả cho bệnh nhân là âm tính với bệnh lý khảo sát. Một số trình tự đặc trưng trên NST Y, như là gen SRY hay DYS14, có thể được sử dụng để xác nhận sự hiện diện của cffDNA. Tuy nhiên, các marker này chỉ áp dụng trong trường hợp thai nam. Một số yếu tố khác có thể áp dụng như sử dụng điểm đa hình được di truyền từ bố và mẹ, nhưng các bất lợi có thế xảy ra như dữ liệu di truyền từ người bố có thể không sẵn có; dữ liệu di truyền của người mẹ cần phải thực hiện thêm những xét nghiệm khác để có được. Những marker DNA thai, với đặc trưng độc lập với giới tính thai và không phụ thuộc vào các đa hình di truyền từ bố mẹ, có thể được sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc hay kiểm tra sự hiện diện và số lượng cffDNA. Những hướng tiếp cận hiện nay tập trung vào các trình tự DNA tự do của thai mang đặc điểm ngoại di truyền khác biệt so với DNA mẹ. Trong đó, sự methyl hoá các gốc CpG tại vùng promoter kiểm soát quá trình sự điều hoá biểu hiện gen đặc biệt đuợc quan tâm. Một số vùng promoter của gen SERPINB5, PDE9A không được methyl hoá trong tế bào nhau thai nhưng lại methyl hoá nhiều trong các tế bào máu mẹ. Sự khác biệt này được xem là đối tượng để xác định sự tồn tại cffDNA. Tuy nhiên, quá trình xử lí bisulfite sẽ khiến cho các DNA không methyl hoá sẽ bị thái hoá tới 96%(3), trong khi đó hàm lượng cffDNA thai trong huyết tương thai phụ chỉ chiếm 8-20% tuỳ tuổi thai(8). Chính vì vậy, sử dụng các marker không methyl hóa của DNA nhau thai trở thành vấn đề nan giải. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn marker RASSF1A để phát hiện sự hiện diện cffDNA. Marker RASSF1A này thể hiện sự methyl hoá hoàn toàn trong tế bào nhau thai, còn trong tế bào máu mẹ thì kết quả nghiên cứu không thấy có sự methyl hoá (hình 3). Sự methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A được cho làm ức chế sự biểu hiện của gen này. Đây là một gen ức chế khối u, trong nghiên cứu ung thư, nhiều nghiên cứu đều cho thấy gen RASSF1A bị methyl hoá, ngăn sự kiểm soát phát Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học 375 triển của khối u(1). Sự xâm lấn thành tử cung của lớp nuôi phôi và lớp hợp bào có nhiều sự tương quan với quá trình xâm lấn mạch và di căn trong ung thư, quá trình chuyển dạng tế bào EMT (epithelial mesenchymal transition). Nghiên cứu xác định được sự hiện diện của DNA thai tự do trong huyết tương máu mẹ thông quá sự methyl hoá của gen RASSF1A bằng phương pháp MSP kết hợp tạo dòng và giải trình tự. Ngoài ra, trong tương lai ứng dụng marker RASSF1A trong sàng lọc nhóm máu RhD và các bất thường di truyền cho phép phát hiện được các kết quả âm tính giả gây ra bởi hàm lượng cffDNA thấp hoặc thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã khuếch đại thành công cffDNA trong máu mẹ, tạo dòng được đoạn DNA thai và DNA mẹ vào trong vector và chứng minh được sự hiện diện của cffDNA trong máu mẹ bằng phương pháp giải trình tự Sanger. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Chiu RW., Chim SS., Wong IH. et al. (2007). Hypermethylation of RASSF1A in human and rhesus placentas. Am J Pathol, 170(3), 941–950. 2. Dar P, Curnow KJ., Gross SJ. et al. (2014). Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphismebased noninvasive prenatal aneuploidy testing. Am J Obstet Gynecol, 211(5):527.e1-527.e17. 3. Grunau C., Clark SJ., and Rosenthal A. (2001). Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res, 29(13), e65–e65. 4. Lo YD., Chan KA., Sun H. et al. (2010). Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci Transl Med, 2(61), 61ra91–61ra91. 5. Lo YD., Corbetta N., Chamberlain PF et al. (1997). Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. The lancet, 350(9076), 485–487. 6. Lo YD., Zhang J., Leung TN et al (1999). Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet, 64(1), 218–224. 7. Poon LL., Leung TN., Lau TK. et al (2002). Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 48(1), 35–41. 8. Suzumori N, Ebara T, Yamada T et al (2016). Fetal cell-free DNA fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy. J Hum Genet, 61(7), 647. 9. Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K. et al. (2005). Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 51(9), 1598–1604. Ngày nhận bài báo: 21/06/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 30/06/2018