Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu (nilarpavata lugens stal) ở một số giống lúa (oryza sativa l.) - Phạm Thị Thanh Mai

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, (2012), 83-90 83 XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN KHÁNG RẦY NÂU (NILARPAVATA LUGENS STAL) Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA (ORYZA SATIVA L.) Phạm Thị Thanh Mai2, Nguyễn Thị Như Ý1, Hoàng Thi Kim Hồng1 1Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 2Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Lương thực thực phẩm Đà Nẵng Tóm tắt. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử STS BpE18-3 liên kết với gen bph1, chỉ thị KAM4 liên kết với gen bph2 và chỉ thị RG457 liên kết với gen bph10 để xác định sự hiện diện của 3 gen bph1, bph2 và bph10 trong các giống lúa IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước. Đây là những giống lúa có khả năng kháng rầy nâu, đã được Trung tâm Tài nguyên Thực vật, viện Khoa học Nông Nghiệp, Hà Nội, đánh giá và xếp loại về khả năng kháng rầy. Các giống lúa này được đưa về trồng ở Thừa Thiên Huế vào vụ Hè Thu năm 2010, thông qua việc theo dõi khả năng sinh trưởng, phát triển và đánh giá một số chỉ tiêu liên quan đến năng suất và phẩm chất, chúng tôi tiến hành thăm dò sự hiện diện của các gen kháng rầy. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các giống IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước đều có sự diện diện của gen bph1. Ba giống IRRI 352, BG 367-2, Lốc Nước có sự hiện diện của gen bph2. Giống BG 367-2 có sự hiện diện của gen bph 10. Bốn giống lúa này là nguồn vật liệu quan trọng trong việc phát triển và lai tạo các giống lúa kháng rầy nâu, có năng suất cao ở Thừa Thiên Huế. Từ khóa: chỉ thị phân tử, gen kháng rầy nâu, lúa kháng rầy, quần thể rầy nâu. 1. Mở đầu Trong số các loại côn trùng hại lúa thì rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) là loại sâu hại nguy hiểm nhất (Murai và cộng sự, 2003), (Jena và cộng sự, 2010). Miền Trung Việt Nam nói chung, Thừa Thiên Huế nói riêng trong những năm gần đây, diện tích trồng lúa đã bị thu hẹp lại, trong khi đó dịch bệnh hại lúa, nhất là dịch rầy bùng phát làm giảm đáng kể năng suất lúa thu hoạch, gây thiệt hại nhiều cho người nông dân. Do vậy, việc chọn tạo được các giống lúa mang gen kháng rầy và có khả năng kháng bền vững với quần thể rầy nâu là một trong những hướng nghiên cứu hiện nay rất được quan tâm. Phương pháp chọn giống lúa kháng rầy nâu thông qua chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng rầy là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi, vô cùng thuận lợi cho các nhà chọn giống (Nguyễn Thị Lang, 2005) . Chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các gen sẽ được sử dụng để chọn lọc cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không phải phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Chọn giống dưới sự hỗ trợ của MAS (chọn giống nhờ marker phân tử) rất có hiệu quả trong tạo 84 Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu giống lúa kháng bệnh bạc lá và kháng rầy nâu, cà chua chịu bệnh nấm sương, đậu tương kháng được sâu đục quả Kỹ thuật chỉ thị phân tử đảm bảo cho các nhà chọn tạo giống nhận diện chính xác các gen liên quan ở bất cứ bộ phận nào của cây ở giai đoạn sớm mà không bị chi phối bởi điều kiện môi trường và thời gian tạo giống rút ngắn xuống 2-3 năm (Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng, 2004). Hiện nay, có nhiều giống cây trồng mới có mang gen kháng sâu bệnh đã được nhận diện bằng phương pháp chỉ thị phân tử (Huang và cộng sự, 1997), (Zheng và cộng sự, 1995) Ishii và đồng tác giả (1994) đã thiết lập bản đồ RFLP và xác định gen bph10 kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể 12 liên kết với RG457. Cặp primer được thiết kế từ RG457 (chỉ thị STS) đã phát hiện được gen kháng rầy nâu bph10 với khoảng cách di truyền 1,7cM trên quần thể lúa hoang Oryza australiensis và các dòng con lai (Lang và cộng sự, 1999). Nhóm nghiên cứu Kim và đồng tác giả (2005) đã sử dụng các dòng lúa kháng rầy nâu để xác định chỉ thị phân tử đối với gen kháng rầy nâu biotype 1. Dựa trên 520 primer RAPD, các tác giả đã thiết kế được chỉ thị STS BpE 18-3 liên kết với gen kháng rầy nâu bph1, khoảng cách di truyền là 3.9 cM (Kim và cộng sự, 2005). Dựa trên các chỉ thị AFLP, Murai và đồng tác giả (2001) đã thiết kế marker STS KAM4 liên kết chặt với gen bph2. Kết quả nghiên cứu này hứa hẹn khả năng ứng dụng của chỉ thị STS trong phương thức chọn giống nhờ marker phân tử. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bốn giống lúa được đánh giá khả năng kháng rầy dựa vào kiểu hình, bao gồm: IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước. Đây là những giống lúa lai tạo từ các nguồn khác nhau do Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Khoa học Nông Nghiệp, Hà Nội cung cấp. Điểm kháng rầy ở bảng 1 đã được đánh giá và phân cấp dựa trên tiêu chuẩn IRRI (IRRI, 1996). Bảng 1. Các giống lúa dùng làm nguyên liệu nghiên cứu Kí hiệu Tên giống Nguồn nhập Điểm kháng rầy L1 IRRI 352 Nghĩa Hưng, Nam Định 1 L3 BG 367-2 IRRI 1 L25 Sài Đường Kiến An IRRI 3 L27 Lốc Nước IRRI 3 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của lúa Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp Kang và cs (2003). PHẠM THỊ THANH MAI, NGUYỄN THỊ NHƯ Ý, HOÀNG THI KIM HỒNG 85 Lá mạ non (0,5-1 g) của cây lúa sau khi gieo 20 ngày, được nghiền thành bột mịn trong dung dịch nitơ lỏng, sau đó cho vào ống eppendorf (khoảng 2/3 thể tích ống). Bổ sung 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA) và 20% SDS; pH 7,5 vào mỗi ống eppendorf ở trên và ủ ở 65oC trong 30 phút. Mẫu được chiết 2 lần với một thể tích tương đương của phenol và chloroform. Sau khi chiết DNA được kết tủa bằng 2 thể tích 100% ethanol lạnh. Rửa kết tủa DNA bằng 70% ethanol lạnh và làm khô mẫu bằng máy cô chân không (Modul 3180C, BioTron). Tiểu thể DNA được hòa tan trong 20 L nước cất vô trùng, sau đó xử lý bằng enzyme RNase để sử dụng cho các thí nghiệm về sau. Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ (SmartSpec3000, BioRad) ở bước sóng λ260/280 nm. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% ở 100V. Đệm điện di được sử dụng là 1 TAE (0,04 M Tris-acetate và 0,001 M EDTA). Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) (0,5 g/L) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad). 2.2.2. Phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi BpE18-3 (F:5′-CGCTGCGAGAGTGTGACACT-3′; R:5′- TTGGGTTACACGGGTTTGAC-3′) để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph1 ở các giống lúa nghiên cứu (Kim và cộng sự, 2005). Sử dụng cặp mồi KAM4 (F:5′-TAACTGGTGTTAGTGCGAATGC-3′, R:5′- AATTCACGGCATGTGAAGCCCTAG-3′), để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph2 ở các giống lúa nghiên cứu (Murai và cộng sự, 2001). Sử dụng cặp mồi RG 457FL/RL (F: 5'-GCAGTGGCAGATGGGATCGT-3’, R: 5'-GCTCCGAAATCCCAAGCGAT- 3'), để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph10 ở các giống lúa nghiên cứu (Lang và cộng sự, 1999). PCR được thực hiện trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm 250 ng - 300 ng DNA tổng số, 10 pmol mỗi loại mồi (mồi xuôi, mồi ngược), 2  Master mix (GoTaq® Green Master Mix 2, Promega). Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 95oC-5 phút; 30 chu kỳ: 95oC-1 phút, 55oC đến 60oC-1 phút và 72oC-1 phút; 72oC-10 phút Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1TAE. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch Ethidium bromide (EtBr; 0,5 µg/mL) và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad). 2.2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme HinfI Thành phần phản ứng cắt bao gồm: 3,2 µl nước cất; 1,5 µl buffer (10X); 0,3 µl enzyme HinfI (10U/µl); 10 µl sản phẩm PCR. 86 Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu Hỗn hợp trên được ủ ở 37oC trong 1,5h; sau đó ủ 4oC qua đêm. Điện di sản phẩm cắt trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1TAE. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa DNA tổng số được tách chiết từ 0,5-1 g lá mạ non được hòa tan trong 20 μL nước cất vô trùng. Nồng độ DNA tổng số được xác định bằng máy quang phổ (SmartSpec3000, BioRad) đạt từ 4 μg/μL đến 6 μg/μL. Độ tinh sạch của DNA được xác định ở bước sóng λ260/280 nm cho kết quả từ 1,80 đến 1,90. Chất lượng DNA tổng số còn được kiểm tra bằng điện di agarose gel 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 1. Hình 1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của bốn giống lúa L1: IRRI 352; L3: BG 367-2; L25: Sài Đường Kiến An; L27: Lốc Nước Kết quả trên cho thấy DNA tổng số không bị đứt gãy thành các đoạn nhỏ, sạch và đảm bảo chất lượng cho việc phân tích PCR trong các mẫu lúa cần nghiên cứu. 3.2. Xác định sự hiện diện của gen bph1 Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi BpE18-3 SM: Chuẩn kích thước DNA (1kb DNA Ladder), L1: IRRI 352, L3: BG 367-2, L25: Sài Đường Kiến An, L27: Lốc Nước L1 L3 L25 L27 SM L1 L3 L25 L27 500 bp PHẠM THỊ THANH MAI, NGUYỄN THỊ NHƯ Ý, HOÀNG THI KIM HỒNG 87 Kết quả PCR với cặp mồi BpE18-3 được trình bày ở hình 2, từ kết quả này cho thấy tất cả các giống lúa nghiên cứu đều có băng DNA khuếch đại với kích thước khoảng 523 bp. Các băng DNA khá rõ chứng tỏ tính đặc hiệu cao của mồi. Theo báo cáo của Kim và cộng sự (2005), giống Samgangbyeo là giống lúa kháng rầy có mang gen kháng rầy nâu biotype 1, sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu BpE18-3 cho băng ở kích thước 523bp. Nagdongbyeo giống nhiễm rầy nâu, không có băng ở vị trí đó. Bước đầu chúng tôi có thể kết luận ở 4 giống lúa nghiên cứu là IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước đều có sự hiện diện của gen bph1. 3.3. Xác định sự hiện diện của gen bph2 Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi KAM4 SM: Chuẩn kích thước DNA (1kb DNA Ladder), L1: IRRI 352, L3: BG 367-2, L25: Sài Đường Kiến An, L27: Lốc Nước Kết quả PCR với cặp mồi KAM4 trình bày ở hình 3 cho thấy giống Sài Đường Kiến An không có đoạn DNA được khuếch đại. Ba giống lúa còn lại xuất hiện băng DNA ở kích thước khoảng 300bp, theo nghiên cứu của Murai và cộng sự (2001) thì chỉ thị KAM4 liên kết chặt chẽ với gen bph2, băng đa hình được khuếch đại bởi cặp primer KAM4 sẽ cho kích thước 300bp, một số tác giả khác cũng đã sử dụng chỉ thị này trong việc xác định các giống lúa mang gen kháng rầy nâu (Sharma và cộng sự, 2004). Do vậy có thể kết luận ở 3 giống lúa nghiên cứu là IRRI 352, BG 367-2, Lốc Nước đều có sự hiện diện của gen bph2. 3.4. Xác định sự hiện diện của gen bph10 Cặp mồi RG457L/L được thiết kế từ chỉ thị RFLP RG457, được chúng tôi sử dụng để khuếch đại đoạn chỉ thị liên kết với gen bph10 trong các giống lúa nghiên cứu. Sau khi điện di kết quả PCR với cặp mồi RG457FL/RL và kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HinfI, chúng tôi thu được kết quả như hình 4 và hình 5. Ở hình 4, bốn giống lúa đều có sản phẩm PCR với kích thước xấp xỉ nhau khoảng gần 750bp. Tuy SM L1 L3 L25 L27 250 bp 88 Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu nhiên, ở hình 5 sản phẩm PCR của ba giống lúa IRRI 352, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước sau khi cắt bằng HinfI có 2 đoạn DNA. Trong khi đó, giống BG 367-2 có xuất hiện băng đa hình so với các giống còn lại, cụ thể là enzyme HinfI đã cắt sản phẩm PCR thành 3 đoạn với kích thước khoảng 300, 250 và 200 bp. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lang và cộng sự (1999), giống IR31917-45-3-2 nhiễm rầy nâu bioype 1, 2 và 3 sản phẩm PCR sau khi cắt với HinfI sẽ có 2 băng (200 và 500bp), còn giống IR54742 (dòng du nhập gen từ O. autraliensis là giống hoang dại kháng được cả 3 biotype rầy nâu trên) thì sản phẩm cắt có 3 băng (300, 250 và 200 bp). Do vậy có thể kết luận BG 367-2 là giống lúa có mang gen bph10. Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RG457FL/RL được cắt bằng enzyme HinfI SM: Chuẩn kích thước DNA (1kb DNA Ladder), L1: IRRI 352, L3: BG 367-2, L25: Sài Đường Kiến An, L27: Lốc Nước 4. Kết luận Việc sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các gen kháng rầy nâu dựa vào phản ứng PCR, nhằm gián tiếp xác định các giống lúa mang gen kháng rầy là phương pháp nhanh chóng và hiệu quả. Dựa vào 3 cặp mồi đặc hiệu cho các chỉ thị STS là BpE18-3, KAM4, RG457L/L chúng tôi đã xác định được giống lúa mang gen kháng rầy nâu. Kết quả nghiên cứu cho thấy các giống IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước đều có sự diện diện của gen bph1. Ba giống IRRI 352, BG 367-2, Lốc Nước có sự hiện diện của gen bph2. Giống BG 367-2 có sự hiện diện của gen bph 10. Các giống lúa trên có thể được sử dụng làm nguồn giống kháng rầy nâu. SM L1 L3 L25 L27 750 bp SM L1 L3 L25 L27 500 bp PHẠM THỊ THANH MAI, NGUYỄN THỊ NHƯ Ý, HOÀNG THI KIM HỒNG 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Thị Lang, Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào và kỹ thuật chỉ thị phân tử phục vụ chọn tạo giống cây trồng, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, 2005. [2]. Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng, Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào và kỹ thuật chỉ thị phân tử phục vụ chọn tạo giống cây trồng, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2004. [3]. Huang N, Angeles ER, Domigo J, Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: Marker assisted selection using RFLP and PCR, Theor Appl Genet, 95(3), (1997), 313-320. [4]. [Inger – IRRI, Standard evaluation system for rice, Genetic Resources Centre, Manila, Philippine, 1996. [5]. Jena KK, Kim SM, Current satus of brown planthopper (BPH) resistance and genetics, Rice, 3, (2010), 161-171. [6]. Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE, Yang MS, Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization, Transgenic Research, 12, (2003), 683-691. [7]. Kim SM, Sohn JK, Identification of a Rice Gene (Bph1) Conferring Resistance to Brown Planthopper (Nilaparvata lugens Stal) Using STS Markers, Molecules Cells, 20(1), (2005), 30-34. [8]. Lang NT, Brar DS, Khush GS, Huang N, Buu BC, Development of STS markers to indentify brown plant hopper resistance in a segregating population, Omonrice, 7, (1999), 26-34. [9]. Murai H, Hashimoto Z, Shama PN, Shimuzu T, Murata K, Takumi S, Mori N, Kawasaki S, Nakamaura C, Construction of a high-resolution linkage map of a rice brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) resistance gene bph2, Theor Appl Genet, 103,(2001), 526-532. [10]. Murai H, Shama PN, Murata K, Hashimoto Z, Ketipearachi Y, Shimuzu T, Takumi S, Mori N, Kawasaki S, Nakamaura C, Construsting linkage maps of brown planthopper resistance genes Bph 1, Bph 2 and Bph 9 on rice chromosome 12, Advances in Rice Genetics 2003, IRRI, Philippins, (2003), 263-265. [11]. Sharma PN, Torii A, Takumi S, Mori N, Nakamura C, Marker-assisted pyramiding of brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance genes Bph1 and Bph2 on rice chromosome 12, Hereditas, 140(1), (2004), 61-69. [12]. Zheng K, Hoang N, Bennett J, Khush GS, PCR-Based marker assisted selection in rice breeding, IRRR, 1995. 90 Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu DETERMINING THE PRESENCE OF BROWN PLANTHOPPER (NILARPAVATA LUGENS STAL) RESISTANCE GENES IN RICE (ORYZA SATIVA L.) Pham Thi Thanh Mai2, Nguyen Thi Nhu Y1, Hoang Thi Kim Hong1 1Biology Department, College of Sciences, Hue University 2Biotechnology Department, College of Food Industry, Da Nang City, Vietnam Abstract. In this study, we used the STS markers BpE18-3 (linked to bph1), KAM4 (linked to bph2) and RG457 (linked to bph10) to determine the presence of bph1, bph2 and bph3 genes in four rice varieties namely IRRI 352, BG 367-2, Sai Duong Kien An and Loc Nuoc. These rice varieties were the Brown planthopper (BPH) resistant rice varieties and their BPH resistant capacity were tested and supplied by the Plant Resources Center, Science Institute of Agronomy, Hanoi. These rice varieties were cultivated and studied in Thua Thien Hue in the 2010 summer-auturm season. Results showed that bph1 gene was detected in all four rice varieties of IRRI 352, BG 367-2, Sai Duong Kien An and Loc Nuoc. The bph2 gene was detected in three rice varieties of IRRI 352, BG 367-2, and Loc Nuoc but it was not detected in Sai Duong Kien An. Among the tested varieties, two restriction sites for HinfI enzyme were only present in the PCR product of BG 367-2, giving rise to three bands (300, 250 and 200bp), so the bph10 gene was detected in BG 367-2. These four rice varieties are the important materials for growing and regenerating of the BPH resistant rice varieties with high yield in Thua Thien Hue. Keywords: brown planthopper (BPH), BPH resistance gene, BPH resistance rice, molecular marker.