Xác định Riemerella anatipestifer và Escherichia coli nghi ngờ gây hội chứng co giật và tiêu chảy trên vịt ở các cơ sở chăn nuôi ở Long An

Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 53 Determination of Riemerella anatipestifer and Escherichia coli suspected to cause a syndrome including shaking head and trembling, greenish diarrhea on duck farms in Long An Hien T. Le1∗, Quan N. Kha1, Khuong M. Chu1, Cuong V. Nguyen2, Ngoc H. Le1, & Hoa T. K. Ho1 1Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, Vietnam 2Long An Provincial Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Long An, Vietnam ARTICLE INFO Research Paper Received: August 16, 2017 Revised: October 24, 2017 Accepted: November 10, 2017 Keywords Diarrhea Riemerella anatipestifer Shaking head Trembling ∗Corresponding author Le Thanh Hien Email: hien.lethanh@hcmuaf.edu.vn ABSTRACT In Long An province and other places, ducks at 3-8 weeks of age often experience a syndrome including greenish diarrhea, eye and nose discharge, shaking head and trembling which is considered to be related to Riemerella anatipestifer and Escherichia coli. There is not any research to prove this hypothesis. For that reason, this study was as the first step to explore the causes of this syndrome. In to- tal, 70 swab samples from disease and nondisease ducks and 27 pool water from 27 duck farms were collected to identify R. anatipestifer and E. coli using PCR. There were 2 PCR (16S rDNA-PCR and gyrB-PCR) used to detect R. anatipestifer while one PCR for gene phoA was used to detect E. coli The result showed that R. anatipes- tifer was found on both disease and non-disease ducks. However, the 2 PCRs to detect R. anatipestifer did not agree well. The fact that these bacteria were found on 22% farms (disease and non-disease ones) means it is complicated to confirm them in causing the men- tioned disease. In addition, E. coli was also found in both types of duck and from all pool water. These isolates were kept for further studies to identify their virulence. The result reveals that there may be the cooperation between many factors in causing this disease. Cited as: Le, H. T., Kha, Q. N., Chu, K. M., Nguyen, C. V., Le, N. H., & Ho, H. T. K. (2018). Determination of Riemerella anatipestifer and Escherichia coli suspected to cause a syndrome including shaking head and trembling, greenish diarrhea on duck farms in Long An. The Journal of Agriculture and Development 17(5), 53-59. www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) 54 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Xác định Riemerella anatipestifer và Escherichia coli nghi ngờ gây hội chứng co giật và tiêu chảy trên vịt ở các cơ sở chăn nuôi ở Long An Lê Thanh Hiền1∗, Kha Ngọc Quân1, Chu Minh Khương1, Nguyễn Văn Cường2, Lê Hữu Ngọc1 & Hồ Thị Kim Hoa1 1Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh 2Chi Cục Chăn Nuôi Thú Y Long An, Long An THÔNG TIN BÀI BÁO Bài báo khoa học Ngày nhận: 16/08/2017 Ngày chỉnh sửa: 24/10/2017 Ngày chấp nhận: 10/11/2017 Từ khóa Co giật Riemerella anatipestifer Tiêu chảy Vịt ∗Tác giả liên hệ Lê Thanh Hiền Email: hien.lethanh@hcmuaf.edu.vn TÓM TẮT Tại Long An và nhiều địa phương, vịt khoảng 3 đến 8 tuần tuổi thường mắc bệnh có biểu hiện tiêu chảy có hoặc không có màu xanh lá, chảy nước mắt và nước mũi, run đầu và cổ được cho là liên quan đến Riemerella anatipestifer và Escherichia coli. Nghiên cứu này được thực hiện như bước đầu tiên để tìm hiểu về nguyên nhân vi khuẩn có thể liên quan các triệu chứng bệnh kể trên. Các mẫu ngoáy hầu họng vịt khỏe và vịt có biểu hiện bệnh (70 mẫu) và 27 mẫu nước ao từ 27 trại vịt được thu thập để tìm vi khuẩn R. anatipestifer và E. coli bằng PCR. Hai quy trình PCR, 16S rDNA-PCR và gyrB-PCR, được dùng tìm R. anatipestifer, và PCR gene phoA dùng cho E. coli. Kết quả là R. anatipestifer đã được phát hiện trên cả vịt có và không có biểu hiện bệnh, và trong một số mẫu nước ao. Tuy nhiên, hai phản ứng PCR xác định R. anatipestifer cho kết quả khác nhau. Bên cạnh đó E.coli cũng phát hiện trên mẫu bệnh lẫn không bệnh và tất cả các nước ao. Các chủng này được lưu lại cho các bước tiếp theo trong việc xác định độc lực. Kết quả cho thấy tình trạng nhiễm trùng trên đàn vịt phức tạp, có vẻ còn có sự bội nhiễm nhiều vi khuẩn khác trên vịt, và chưa xác định được nguyên nhân nguyên phát. 1. Đặt Vấn Đề Tại đồng bằng sông Cửu Long, nuôi vịt trên trên cạn kết hợp ao là phương thức chăn nuôi phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh. Trong nhiều năm gần đây, đàn vịt ở các trại tại Long An và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long thường bị bệnh với các biểu hiện tiêu chảy có hoặc không có màu xanh lá, chảy nước mắt và nước mũi, run đầu và cổ. Trong nhiều trường hợp, vịt bệnh có biểu hiện triệu chứng thần kinh, dễ lật ngửa, 2 chân đạp mái chèo. Một số đặc điểm về bệnh có thể kể đến gồm: bệnh thể hiện trên cả vả vịt thịt và vịt đẻ; thời điểm biểu hiện khoảng 35-50 ngày (5-8 tuần) tuổi và hậu bị (qua thời điểm này, rất ít biểu hiện bệnh); gần như 100% đàn vịt có bệnh; khoảng 20% số vịt trong đàn có các triệu chứng kể trên; tỉ lệ chết trong số có biểu hiện rõ là 80 – 100%; vịt không chết bị di chứng (còi, giảm năng suất thịt/trứng); phòng/ trị kháng sinh không hiệu quả. Cho đến nay, nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh này tại Long An vẫn còn hạn chế. Với các triệu chứng hay biểu hiện nói trên, nhiễm trùng do Duck cir- covirus, R. anatipestifer và E. coli được nghi vấn trước tiên (Bui & ctv., 2016). Tuy nhiên, với đặc tính chăn nuôi vịt ở ao hồ như ở đồng bằng sông Cửu Long, không loại trừ có sự nhiễm trùng ghép của các vi sinh vật gây bệnh trên các hệ cơ quan khác nhau. Mục tiêu của nghiên cứu là kiểm tra sự hiện diện của R. anatipestifer và E. coli trong mẫu ngoáy hầu họng và nước ao ở các trại vịt có hay không có bệnh ở Long An bằng kỹ thuật PCR để xem chúng có thể hiện diện trên các trường hợp biểu hiện hội chứng co giật và tiêu chảy (trong đó co giật bao gồm đầu – cổ, chân, hay có thể lật ngửa chân đạp mái chèo; tiêu chảy có thể có phân Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 55 xanh) ở các cơ sở chăn nuôi vịt tại Long An. 2. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu 2.1. Mẫu và phương pháp thu thập mẫu Các mẫu được thu thập từ 27 trại nuôi vịt gia đình ở ba huyện: Cần Đước, Cần Giuộc, Tân Trụ - tại tỉnh Long An (Tân Trụ - 6 trại; Cần Giuộc – 11 trại; Cần Đước - 10 trại). Tại thời điểm lấy mẫu, vịt ở những trại đó có độ tuổi từ khoảng 3 đến 8 tuần tuổi. Đàn vịt lúc đó có thể có hoặc không có biểu hiện lâm sàng của bệnh. Tại mỗi trại, 2 hay 3 mẫu tăm-bông ngoáy dịch hầu họng được lấy từ các vịt có hay không có biểu hiện bệnh. Mẫu tăm bông được bảo quản trong ống nghiệm chứa 2 mL Tryptone soya broth (TSB; Himedia, M011-500G). Một mẫu nước ao vịt ở mỗi trại cũng được thu thập. Mẫu nước được chứa trong bình 500 mL sạch. Tất cả các mẫu được bảo quản trong thùng đá duy trì nhiệt độ 2-80C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để xét nghiệm trong vòng < 5 giờ. Tổng cộng có 70 mẫu dịch ngoáy hầu họng (54 mẫu từ vịt khỏe mạnh và 16 mẫu từ vịt có các dấu hiệu bệnh), và 27 mẫu nước ao được thu thập. Ngay khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm, 1 mL mẫu nước ao được cho vào ống nghiệm chứa 5 mL canh TSB. Các ống canh chứa tăm bông ngoáy hầu họng và nước ao được ủ trong vòng 48 giờ ở 370C trong bình đèn cầy (candle jar). Mẫu đã tăng sinh được ly trích DNA để dùng cho các phản ứng PCR. 2.2. Kiểm tra sự lưu hành R. anatipestifer và E.coli trong trại bằng các quy trình PCR Việc phân lập và định danh vi khuẩn R. anatipestifer theo các phương pháp truyền thống được nhận định là khá khó khăn (Kardos & ctv., 2007), đồng thời hiện nay chưa có một quy trình PCR chẩn đoán R. anatipestifer được công bố nào có tính đặc hiệu cao (Christensen, 2013). Với mong muốn xác định sự hiện diện của vi khuẩn này trong các đàn vịt nuôi ở Long An, ngoài cố gắng phân lập vi khuẩn từ vịt bệnh, hai quy trình PCR khác nhau được sử dụng để phát hiện R. anatipestifer trong các mẫu canh tăng sinh của các mẫu ngoáy hầu họng và nước ao tại các trại vịt. Một quy trình PCR có mục tiêu là gene gyrB (Wang & ctv., 2012), và một quy trình PCR gene 16S rDNA do Qu & ctv. thiết kế và được sử dụng bởi Wei & ctv. (2013). Ngoài ra, để khảo sát khả năng hiện diện E. coli ở các trại, một quy trình PCR trên gene alkaline phosphate (phoA) đặc hiệu cho E. coli được thực hiện đối với các các mẫu canh tăng sinh của các mẫu ngoáy hầu họng và nước ao. Trình tự nucleotide của các mồi PCR được trình bày trong Bảng 1. GoTaq@Green Master Mix (Promega, M1123) được sử dụng cho tất cả các phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của ba PCR như sau: tiền biến tính 940C/5 phút; 35 chu kỳ gồm biến tính ở 940C/1 phút, bắt cặp ở 550C/1phút, và kéo dài ở 720C/60 giây; và kéo dài cuối cùng ở 720C/10 phút. Điện di các sản phẩm PCR bằng gel agarose 0,8% có chứa ethid- ium bromide, và kiểm tra DNA trên gel dưới đèn UV. 2.3. Xử lý số liệu Kết quả tỉ lệ dương tính trên các nhóm mẫu cho từng vi khuẩn được tính. Chỉ số chênh OR được đánh giá mối liên hệ giữa bệnh và sự hiện diện của vi khuẩn. Đối với hai phương pháp PCR dùng để xác định R. anatipestifer, chỉ số kappa được dùng để đánh giá mức tương đồng của hai xét nghiệm về mặt thống kê (Trần Thị Dân và Lê Thanh Hiền, 2007) bằng phần mềm MS Excel 2013. 3. Kết Quả và Thảo Luận 3.1. Sự thống nhất kết quả phát hiện R. anatipestifer của hai quy trình PCR Trong 27 trại khảo sát, 8 trại có 20% vịt có các biểu hiện bệnh và 19 trại vịt bình thường. Tổng cộng mẫu bao gồm: 27 mẫu nước hồ được thu thập (mỗi trại một mẫu); 70 mẫu ngoáy hầu họng, trong đó 16 mẫu được lấy từ vịt có các biểu hiện của bệnh và 54 mẫu được lấy từ vịt khỏe mạnh. Kết quả xét nghiệm các mẫu này bằng hai quy trình PCR phát hiện R. anatipestifer không giống nhau (Bảng 2). Phương pháp gyrB -PCR cho kết quả dương tính với 24 mẫu ngoáy hầu họng (8 mẫu từ vịt bệnh và 16 mẫu từ vịt khỏe), và một mẫu nước ao. Trong khi đó, 16S rDNA- PCR cho kết quả 18 mẫu dương tính (5 mẫu từ vịt bệnh, 10 mẫu từ vịt khỏe) và 3 mẫu nước ao. Chỉ có 9 mẫu ngoáy hầu họng cùng dương tính với cả hai PCR. Chỉ số kappa = 0,275 (95% độ tin cậy từ 0,055 đến 0,494), mức tương đồng dạng “vừa”. Chẩn đoán R. anatipestifer khá khó khăn vì dựa vào triệu chứng lâm sàng có thể nhầm lẫn www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) 56 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh B ả n g 1 . P C R và cá c đ o ạ n m ồ i d ù n g x á c đ ịn h sự h iện d iện củ a R . a n a tipestifer và E . co li tro n g n g h iên cứ u n ày 1 P C R và gene m ục tiêu M ồi T rình tự của m ồi (5 ′ - 3 ′) K ích thước sản phẩm (bp) R . anatipestifer, gene gyrB gyrB P 1 A G A G C G A G A A G A A A A A A C C T 194 gyrB P 2 C T C C C A T A A G C A T A G A G A A G A R . anatipestifer, gene 16S rD N A 190F G T A T T G A A A G C T C T G G C G G 654 843R T C G C T T A G T C T C T G A A C C C E . coli gene phoA P ho-F G T G A C A A A A G C C C G G A C A C C A G A A A T G C C T 903 P ho-R T A C A C T G T C A T T A C G T T G C G G A T T T G G C G T 1 M = C :A , Y = C :T ; a ll 1 :1 B ả n g 2 . S o sá n h k ết q u ả h a i p h ả n ứ n g P C R đ ể p h á t h iện R . a n a tipestifer M ẫu M ẫu ngoáy hầu họng T ổng M ẫu nước hồ của trại V ịt có dấu hiệu lâm sàng V ịt không có dấu hiệu lâm sàng T rại có dấu hiệu lâm sàng T rại không có dấu hiệu lâm sàng T ổng 16 54 70 8 19 D ương tính (G yrB -P C R ) 8 (50,0% ) 16 (29,6% ) 24 (34,3% ) 0 (0% ) 1 (5,2% ) D ương tính (16S rD N A -P C R ) 5 (31,3% ) 10 (18,5% ) 15 (21,4% ) 3 (37,5% ) 0 (0% ) Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 57 với các bệnh khác có các bệnh tích tương tự, ví dụ như colibacillosis, salmonellosis, và chlamydio- sis (Christensen, 2013; Glisson & ctv., 2013). Sự phát triển chậm của R. anatipestifer và/hoặc sự đồng nhiễm với các vi khuẩn khác ở thủy cầm có thể là nguyên nhân làm phân lập R. anatipestifer bị thất bại. Bên cạnh đó, xác định các đặc điểm kiểu hình của R. anatipestifer thường cho kết quả trái nhau (Christensen & Bisgaard, 2010), do đó phương pháp phân lập, định danh không được ưu tiên. Vì vậy, nhiều nhà khoa học đã phát triển các quy trình PCR trên những gene mục tiêu khác nhau nhằm phát hiện vi khuẩn này. Tuy nhiên, các kết quả dương tính giả của nhiều quy trình đã được đề cập (Christensen & Bisgaard, 2010; Wang & ctv., 2012; Rubbenstroth & ctv., 2013). Hơn thế nữa, PCR đi kèm với enzyme cắt giới hạn để xác định tính đặc hiệu hơn cho vi khuẩn cũng dường như không khả quan (Rubbenstroth & ctv., 2013). Do đó, với mong muốn có được kết quả có mức tin cậy cao trong việc xác định hiện diện của R. anatipestifer trong các trại, 2 quy trình PCR với các gene mục tiêu được sử dụng. Kết quả cho thấy tỉ lệ phát hiện R. anatipestifer của gyrB - PCR cao hơn 16S rDNA-PCR. Tuy nhiên, ở giai đoạn nghiên cứu, chưa thể so sánh mức độ tin cậy của mỗi phản ứng về sự hiện diện của R. anatipestifer trong các trại vịt. Mặc dù vậy, có 9 mẫu ngoáy hầu họng cho kết quả dương tính với cả hai PCR, điều này xác nhận có sự lưu hành của vi khuẩn trong các trại vịt. Để tiện hơn cho việc đánh giá và thảo luận, kết quả của các trại dương tính với R. anatipestifer được trình bày trong Bảng 3 theo hai cách: trại được xem là dương tính với R. anatipestifer khi có ít nhất một mẫu (mẫu ngoáy hầu họng hoặc mẫu nước) dương tính với một trong hai PCR, hoặc dương tính với cả hai PCR. Trại nhiễm R. anatipestifer được phát hiện bằng gyrB -PCR (51,9%) cao hơn 16S rDNA- PCR (37%) (Bảng 3). Kết quả này tương tự với kết quả trình bày trong Bảng 2, tỉ lệ gyrB -PCR phát hiện vi khuẩn từ mẫu ngoáy họng là 34,3% (24 trong 70 mẫu) trong khi của 16S rDNA-PCR phát hiện vi khuẩn từ 21,4% mẫu (15 trong 70 mẫu). Nếu kết hợp kết quả của hai PCR, vi khuẩn được tìm thấy ở 6 trong số 27 trại (22,2%), trong đó có 2 (trong số 8) trại có vịt biểu hiện các triệu chứng bệnh và 4 trong số 19 trại không có biểu hiện bệnh. Kết quả xác định có sự lưu hành của vi khuẩn trong đàn vịt không thấy biểu hiện bệnh. Nếu coi như một trong hai PCR dương tính một mẫu thì trại có sự hiện diện của R. anatipestifer thì chỉ số OR = 2,18 (0,28 - 26,89), điều này cho thấy hiện diện vi khuẩn R. anatipestifer có liên quan đến bệnh nhưng không có ý nghĩa thống kê (P = 0,349). Vi khuẩn R. anatipestifer cũng được tìm thấy trong mẫu nước ao. Vi khuẩn được phát hiện trong một mẫu nước với gyrB -PCR và trong 3 mẫu với 16S rDNA-PCR. Điều này cho thấy rằng nước hồ là môi trường quan trọng trong việc lây lan R. anatipestifer và các mầm bệnh khác giữa các thủy cầm trong đàn và các đàn khác trong khu vực xung quanh. Tỉ lệ phát hiện R. anatipestifer ở vịt tại ba huyện khảo sát được trình bày trong Bảng 4. Tại 6 trại ở Tân Trụ, không phát hiện vi khuẩn từ các mẫu ngoáy họng, nhưng có một mẫu nước dương tính với gyrB -PCR. Ở hai huyện Cần Giuộc và Cần Đước, vi khuẩn được tìm thấy từ vịt và nước ao. Ba huyện này đều nằm ở vùng thấp và tập trung nhiều vịt. Năm 2015, số lượng trại nuôi vịt ở Tân Trụ, Cần Giuộc, Cần Đước theo thứ tự là 259, 128 và 217 trại, với số lượng vịt là 473.128; 119.222 và 11.4871 vịt (Chi cục thú y tỉnh Long An, 2015, số liệu thu thập qua giao tiếp cá nhân). 3.2. Phát hiện E. coli trong mẫu ngoáy hầu họng và nước ao Colibacillosis gây ra bởi E. coli là bệnh được báo cáo phổ biến nhất gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong sản xuất gia cầm (Nolan & ctv., 2013). Để kiểm tra sự hiện diện của E. coli, canh tăng sinh của các mẫu ngoáy họng vịt và nước ao được phân tích bằng quy trình PCR trên gene mã hóa cho alkaline phosphate ở E. coli (Wei & ctv., 2013). Một sản phẩm PCR được giải trình tự nucleotide và xác nhận tính đặc hiệu bằng BLAST. E. coli được phát hiện từ 64 trong số 70 mẫu ngoáy hầu họng (91,4%). Vi khuẩn được phát hiện từ tất cả 27 mẫu nước ao. Do kinh phí giới hạn, nghiên cứu dừng lại ở giai đoạn tìm hiểu sự hiện diện của E. coli trên niêm mạc hầu họng và trong nước ao. Tuy nhiên, các mẫu canh tăng sinh và gốc vi khuẩn phân lập trên EMB được giữ lại (trong glycerin, ở -200C) để sau này có thể nghiên cứu các dạng độc lực và xác định chủng. www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) 58 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh B ả n g 3 . P h á t h iện R . a n a tipestifer tạ i 2 7 trạ i v ịt ở L o n g A n b ằ n g cá c q u y trìn h P C R Số trại N ước ao của trại T ổng C ó vịt biểu hiện bệnh K hông có vịt biểu hiện bệnh C ó vịt biểu hiện bệnh K hông có vịt biểu hiện bệnh Số trại 8 19 8 19 27 C ó m ẫu dương tính với gyrB -P C R 4 (50% ) 10 (52,6% ) 0 1 (5,3% ) 14 (51,9% ) C ó m ẫu dương tính với 16S rD N A -P C R 4 (50% ) 6 (31.6% ) 3 (37.5% ) 0 10 (37,0% ) C ó m ẫu dương tính với m ột P C R 6 (75% ) 11 (57,9% ) 3 (37,5% ) 1 (5,3% ) 17 (63,0% ) C ó ít nhất m ột m ẫu dương tính với cả hai R A P C R s 2 (25% ) 4 (21,1% ) 0 0 6 (22,2% ) B ả n g 4 . T ỉ lệ p h á t h iện R . a n a tipestifer tạ i 3 h u y ện b ằ n g cá c q u y trìn h P C R H uyện (số trại) M ẫu ngoáy hầu họng (70) Số trại (27) M ẫu nước ao của trại (27) Số m ẫu D ương tính với m ột P C R D ương tính với cả hai P C R Số trại D ương tính với m ột P C R D ương tính với cả hai P C R Số m ẫu dương tính T ân T rụ (6) 12 0 0 6 1 (16,6% ) 0 1 (gyrB -P C R ) (16,7% ) C ần G iuộc (11) 26 15 (57,7% ) 2 (7.7% ) 11 9 (81,8% ) 2 (18.2% ) 0 C ần Đ ước (10) 32 14 (43,8% ) 7 (21.8% ) 10 7 (70,0% ) 4 (40% ) 3 (16S rD N A -P C R ) (30,0% ) Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5) www.jad.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 59 4. Kết Luận Nghiên cứu này là bước đầu trong nổ lực tìm ra nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên vịt ở các trại với đặc điểm co giật kết hợp tiêu chảy. Vi khuẩn R. anatipestifer được phát hiện đang lưu hành trong các đàn vịt bệnh nhiều hơn. Có thể do khó khăn trong chẩn đoán, cũng như số lượng mẫu hạn chế, chưa thấy rõ mối liên quan của vi khuẩn này với bệnh. Ngoài ra, với cách nuôi vịt hiện nay ở các trại, việc kiểm soát vệ sinh và an toàn sinh học trong môi trường chăn nuôi đặc biệt là ao nuôi là rất khó khăn. Từ đó, khả năng bội nhiễm các mầm bệnh khác nhau trong đàn vịt là điều khó tránh khỏi, làm khó khăn trong việc xác định nguyên nhân nhiễm trùng là nguyên phát hay thứ phát. Tài Liệu Tham Khảo (References) Bui, D. H., Do, D. T., Nguyen, T. T., Nguyen, N. T. T., Le, H. T., & Nguyen, N. T. P. (2016). Determination of duck circovirus (DuCV) and Riemerella anatipes- tifer (RA) in several cases of septicemia disease from duck flocks by PCR technique. Journal of Veterinary Science and Technology 6, 14-21. Christensen, H., & Bisgaard, M. (2010). Phylogenetic re- lationships of Riemerella anatipestifer serovars and re- lated taxa and an evaluation of specific PCR tests re- ported for R. anatipestifer. Journal of Applied Micro- biology 108(5), 1612-1089. Christensen, J. P. (2013). Overview of Riemerella anatipestifer infection in poultry. Veteri- nary manual. Retrieved July 12, 2013, from https://www.msdvetmanual.com/poultry/riemerella- anatipestifer-infection/overview-of-riemerella- anatipestifer-infection-in-poultry. Glisson, J. R., Charles, L. H., & Jens, P. C. (2013). Fowl Cholera. In Swayne, D. E., Glisson, J. R., McDougald, L. R., Nolan, L. K., Suarez, D. L., & Nair, V. L. (Eds). Diseases of Poultry (13rd ed., 807-823). New Jersey, USA: Wiley-Blackwell. Kardos, G., Nagy, J., Antal, M., Bistyák, A., Tenk, M., & Kiss, I. (2007). Development of a novel PCR assay specific for Riemerella anatipestifer. Letters in Applied Microbiology 44(2), 145-148. Nolan, L. K., John, H. B., Jean-Pierre, V., Tahseen, A., & Catherine, M. L. (2013). Colibacillosis. In Swayne, D. E., Glisson, J. R., McDougald, L. R., Nolan, L. K., Suarez, D. L., & Nair, V. L. (Eds). Diseases of Poultry (13nd ed., 751-805). New Jersey, USA: Wiley- Blackwell. Rubbenstroth, D., Ryll, M., Knobloch, J. K. M., Kohler, B., & Rautenschlein, S. (2013). Evaluation of different diagnostic tools for the detection and identification of Riemerella anatipestifer. Avian Pathology 42(1), 17- 26. Wang, X. P., Zhu, D. K., Wang, M. S., Cheng, A. C., Jia, R. Y., Chen, S., Chen, X. Y., & Tang, T. (2012). Development and application of specific polymerase chain reaction assay targeting the gyrB gene for rapid detection of Riemerella anatipestifer. Poultry Science 91(10), 2450-2453. Wei, B., Cha, S. Y., Kang, M., Park, I. J., Moon, O. K., Park, C. K., & Jang, H. K. (2013). Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detec- tion of 4 major bacterial pathogens in ducks. Poultry Science 92(5), 1164-1170. www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 17(5)