Xác định kiểu gen HLA-B*1502 ở bênh nhân mới được chẩn đoán mắc bệnh động kinh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 100 XÁC ĐỊNH KIỂU GEN HLA-B*1502 Ở BÊNH NHÂN MỚI ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN MẮC BỆNH ĐỘNG KINH Lương Bắc An*, Bùi Nguyễn Nhật Minh*, Nguyễn Thị Hà Giang*, Đỗ Thị Thanh Thủy*. TÓM TẮT Mở đầu: Bệnh động kinh là một bệnh lí thần kinh nghiêm trọng thường gặp, các hoạt động điện não bị rối loạn, gây ra các cơn co giật tái diễn, có hành vi bất thường và đôi khi mất ý thức. Hiện nay, trên thế giới ước tính có khoảng 50 triệu người động kinh. Tỉ lệ ước lượng trên dân số chung là 4-10/1000 người. Carbamazepine, một loại thuốc điều trị chống co giật, được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh động kinh. Carbamazepine có thể gây ra các phản ứng quá mẫn nghiêm trọng và đe dọa tính mạng, bao gồm hội chứng Steven Johnson (SJS) và hoại tử da gây độc (TEN). Nhiều nghiên cứu phát hiện những bệnh nhân gốc châu Á có mang kiểu gen HLA-B*1502 thì nguy cơ phát triển hội chứng SIS/TEN khi điều trị với Carbamazepine cao. Xác định kiểu gen HLA-B*1502 trước khi quyết định sử dụng Carbamazepine nhằm giảm thiểu hội chứng SJS/TEN ở bệnh nhân do sử dụng carbamazepine là cần thiết. Mục tiêu: Sử dụng kĩ thuật realtime PCR để phát hiện kiểu gen HLA-B*1502. Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Mẫu máu của bệnh nhân với chẩn đoán mới mắc bệnh động kinh được lấy từ bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM và bệnh viện Ngoại Thần Kinh Quốc Tế. Tiến hành ly trích DNA toàn bộ, phản ứng realtime PCR để phát hiện kiểu gen HLA-B*1502. Kết quả: Trong tổng số 196 mẫu bệnh nhân được nghiên cứu, tần số bệnh nhân mang allele HLA-B*1502 là 24,5 % (48/196) và bệnh nhân không mang allele HLA-B*1502 là 75,5 % (148/196). Kết luận: Việt Nam nằm trong khu vực châu Á có tần suất mang kiểu allele HLA-B*1502 cao, kết quả nghiên cứu cho thấy 24,5% bệnh nhân có mang allele HLA-B*1502. Vì vậy, trước khi sử dụng thuốc carbamazepine điều trị bệnh động kinh, cần yêu cầu thực hiện xét nghiệm HLA-B*1502 giúp bác sĩ lâm sàng có phương thức điều trị nhằm hạn chế hội chứng SJS/TEN. Từ khóa: Realtime PCR, HLA-B*1502, Carbamazepine. ABSTRACTS IDENTIFYING HLA-B*1502 IN PATIENTS WITH NEWLY DIAGNOSED EPILEPSY Luong Bac An*, Bui Nguyen Nhat Minh*, Nguyen Thi Ha Giang*, Do Thi Thanh Thuy* * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 100 - 104 Background: Epilepsy is a common serious neurological disease in which nerve cell activity is disturbed, causing recurrent seizures, periods of unusual behavior and sometimes loss of consciousness. Recently, there are approximately 50 million people with epilepsy in the world. The incidence of general population was about 4- 10/1000 cases. Carbamazepine, an anticonvulsant medication has used to treating epilepsy. Carbamazepine can cause severe hypersensitivity reactions and threatening life, including Steven Johnson Syndrome (SJS) and toxic epidermal necrolysis (TEN). Many researchers found that Asian patients carrying the HLA-B*1502 have high risk of developing the syndrome SIS / TEN when treated with Carbamazepine. Genotyping HLA-B*1502 before using Carbamazepine is necessary to reduce symptoms of SJS / TEN in patients. Objective: Using real-time PCR to identify HLA-B*1502 genotypes. * Trung tâm Y sinh học phân tử Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: CN Lương Bắc An ĐT: 0933908241 Emailluongbacan1991@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Thần kinh 101 Method: A cross-sectional descriptive study. Whole blood samples were obtained from patients with newly diagnosed epilepsy (University Medical Center, Ho Chi Minh City, Vietnam and International Neurosurgery Hospital, Ho Chi Minh City, Vietnam). DNA total was extracted by GE kit, real-time PCR was carried out to detect the HLA-B*1502. Results: In this study with 196 samples, 48 (24.5%) were found to carry the HLA-B*1502 allele. 148 (75.5%) were not found to carry the HLA-B*1502 allele. Conclusion: The prevalence of carrying HLA-B*1502 is high in Asian population, especially in Vietnam. The study show 24.5% patients carry the HLA-B*1502. The identification of patients carrying the HLA-B*1502 allele and the avoidance of carbamazepine therapy in these patients were strongly related with a decrease in the incidence of carbamazepine - induced SJS/TEN. Key words: Real-time PCR, HLA-B*1502, carbamazepine. ĐẶT VẤN ĐỀ Động kinh là một trong những bệnh lý thần kinh nghiêm trọng thường gặp. Bệnhdo các hoạt động điện não bị rối loạn, gây ra các cơn co giật tái diễn, có hành vi bất thường và đôi khi mất ý thức. Bệnh nhân có triệu chứng co giật rất khác nhau. Một số người đôi khi chỉ có biểu hiện nhìn chằm chằm trong vài giây, một số khác thì liên tục co giật tay và chân. Hiện nay, trên thế giới ước tính có 50 triệu người động kinh. Tỉ lệ ước lượng trên dân số chung là 4-10/1.000 người. Ở các nước có thu nhập thấp và trung bình thì tỉ lệ này cao hơn, 7-14/1.000 người. Tổng thể, ước tính có 2,4 triệu nguời được chẩn đoán động kinh mỗi năm. Các nước có thu nhập cao, các trường hợp ghi nhận hằng năm là 30-50/100.000 người, với các nước thu nhập thấp thì tỉ lệ này cao hơn gấp 2 lần(2). Tại Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh động kinh là 0,07%, tỉ lệ phát hiện bệnh mới là 9,6/100.000 dân, tỉ lệ tử vong 1,9/100.000 dân (1). Gần một nửa số trường hợp bệnh động kinh không có nguyên nhân rõ ràng, số còn lại được chẩn đoán do di truyền, u não, chấn thương não do tai nạn, đột quị, bệnh thần kinh hoặc viêm màng não(5).Bệnh động kinh gây nguy hiểm khi người bệnh hoạt động như lái xe, bơi lội. Carbamazepine là loại thuốc điều trị chống co giật, được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh động kinh và dùng làm thuốc giảm đau dây thần kinh sinh ba, rối loạn lưỡng cực. Đặc biệt carbamazepine được lựa chọn trong điều trị các bệnh động kinh cục bộ phức tạp ở trẻ em. Tác dụng của thuốc cũng được ghi nhận là hiệu quả đáp ứng tốt. Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu, các bệnh nhân là người châu Á (Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia) khi điều trị bệnh động kinh với phác đồ Carbamazepine có nguy cơ cao phát triển hội chứng Steven- Johnson (SJS) và hoại tử da gây độc (TEN). Đây là những hội chứng dị ứng trên da nghiêm trọng. Triệu chứng của SJS là sốt cao, loét các hốc tự nhiên, tổn thương da: bọng nước, phồng rộp như phát ban, kèm tổn thương gan thận, thể nặng dễ dẫn đến tử vong. TEN cũng có các triệu chứng tương tự, thậm chí da bong tróc rộng hơn và tỉ lệ tử vong cao(3). Tỉ lệ tử vong SJS ước tính khoảng 5% và TEN nghiêm trọng hơn từ 25%-35% trên tổng số ca mắc phải(7). Tình trạng phát triển hội chứng SJS sau khi sử dụng Carbamazepine hay xuất hiện ở người châu Á và nguyên nhân chủ yếu là các dân tộc châu Á có tần số mang allele HLA-B*1502 cao. Sự liên quan giữa allele HLA-B*1502 và phát triển hội chứng SJS/TEN đã được chứng minh(4).Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á, nơi có tần số dân số mang allele HLA-B*1502 cao, một nghiên cứu cho thấy 13,5% dân số Việt Nam có mang kiểu allele HLA-B*1502(6). Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu xác định kiểu gen HLA-B*1502 trước khi điều trị Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 102 carbamazepine cho các bệnh nhân mới được chẩn đoán động kinh nhằm giúp bác sĩ điều trị cân nhắc việc sử dụng thuốc, hạn chế hội chứng SJS-TEN có thể xảy ra ở các bệnh nhân này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế thí nghiệm Mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu này được tiến hành trên đối tượng là các bệnh nhân mới được chẩn đoán động kinh đến khám tại bệnh viện Đại học Y dược Tp. HCM và bệnh viện Ngoại Thần Kinh Quốc tế từ tháng 1-2015 đến tháng 8/2015. Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA từ mẫu máu toàn phần Mẫu máu toàn phần được thu nhận và chứa trong ống máu chống đông có EDTA. Không sử dụng chất chống đông là heparin Mẫu được tách chiết DNA với bộ Kit GE theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Xác định kiểu gen HLA-B*1502 Kiểu gen HLA-B*1502 được xác định bằng PG 1502 Detection Kit. SYBR Green là chất phát huỳnh quang được sử dụng phát hiện sản phẩm sau phản ứng khuếch đại. Trình tự các cặp mồi được thiết kế bởi nhà sản xuất. Thành phần phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hai phản ứng PCR được tiến hành trên cùng một mẫu bệnh. Phản ứng khuếch đại đặc hiệu cho kiểu gen HLA- B*1502, phản ứng còn lại khuếch đại gen chứng nội G3PDH (internal control – IC). Gen chứng nội giúp xác nhận được khả năng âm tính giả do ức chế trong phản ứng PCR. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Chất lượng mẫu tách chiết DNA mẫu được tách chiết từ mẫu máu toàn phần bằng bộ kit GE (Health Care). Độ tinh sạch của DNA được đo bằng máy đo quang phổ có giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,7 đến 2,0. Giá trị Ct Mỗi mẫu bệnh nhân được đánh giá bằng 2 giá trị Ct, một giá trị Ct từ phản ứng khuếch đại kiểu gen HLA-B 1502 và một giá trị Ct từ phản ứng khuếch đại gen chứng nội (internal control – IC). Sự khác biệt giữa hai giá trị Ct chính là kết quả của thí nghiệm và được tính theo công thức. ΔCt = Ct HLA-B 1502 – Ct IC. Bảng 1: Hướng dẫn đọc kết quả allele HLA-B*1502 IC Ct ≤ 27 Ct HLA-B 1502 ≤ 35 ΔCt ≤ 7 HLA-B*1502 dương tính ΔCt > 7 HLA-B*1502 âm tính Ct HLA-B 1502> 35 HLA-B*1502 âm tính IC Ct > 27 Phản ứng PCR bị ức chế Kiểm tra lại Nồng độ DNA thấp Bảng 2: Kết quả HLA-B*1502 Giới tính HLA-B*1502 dương tính (N=48) HLA - B*1502 âm tính (N=148) Tổng (N=196) Nam 25 (52,1%) 61 (41,2%) 86 (43,9%) Nữ 23 (47,9%) 87 (58,8%) 110 (56,1%) Nếu giá trị Ct IC nhỏ hơn hoặc bằng 27 và giá trị ΔCt nhỏ hơn hoặc bằng 7, kết quả được ghi nhận HLA-B 1502 dương tính. Nếu giá trị Ct IC nhỏ hơn hoặc bằng 27 và giá trịΔCt lớn hơn 7, kết quả được ghi nhận HLA-B 1502 âm tính. Giá trị Ct HLA-B 1502 > 35 cũng được ghi nhận là âm tính. Phản ứng PCR bị ức chế hoặc nồng độ DNA thấp khi giá trị Ct IC lớn hơn 27. Các mẫu này cần kiểm tra lại. Kết quả đối với chứng dương và chứng âm cũng tương tự. Đối với chứng dương, giá trị Ct IC ≤ 27 và ΔCt ≤ 7. Giá trị Ct ở chứng âm không ghi nhận được hoặc lớn hơn 35. Nghiên cứu của chúng tôi thu nhận 196 mẫu bệnh nhân, 48 (24,5%)trường hợp có mang allele HLA-B*1502. Có 148 (75,5%) trường hợp không mang allele HLA-B*1502. Phân tích kết quả nghiên cứu, chúng tôi thấy tần số allele HLA- B*1502 (24,5%) cao so với các nước trong khu vực lân cận như Trung Quốc (5-15%), Malaysia (12- 15%), Thái Lan (8-27%)(4,8). Ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc và Sri Lanka tỉ lệ này rất thấp. Ngược Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Thần kinh 103 lại, dân tộc da trắng và châu Phi hầu nhưng không mang allele HLA-B*1502. Nhiều nghiên cứu cũng phát hiện những bệnh nhân có gốc người Trung Hoa có mang kiểu gen HLA-B*1502 cao, nên tăng nguy cơ phát triển hội chứng SIS/TEN khi điều trị với Carbamazepine (4, 8). Sự biến động tỉ lệ HLA-B 1502 cũng đáng chú ý. Trong khu vực châu Á, tại Hong Kong, Thái Lan, Malaysia và một phần Philipine có hơn 15% dân số mang kiểu allele HLA-B*1502 dương tính, so với 10% dân số Đài Loan. Tuy nhiên, chỉ có 4% dân số ở phía bắc Trung Quốc mang kiểu gen này (3). Tại Nam Á, bao gồm Ấn Độ, tỉ lệ trung bình kiểu allele HLA-B*1502 dao động từ 2-4% dân số, cao hơn ở một số nhóm dân tộc. Tần số allele HLA-B*1502 hiện diện ít hơn 1% dân số tại Nhật Bản và Hàn Quốc. Đặc biệt, phần lớn allele HLA-B*1502 không xuất hiện ở người da trắng, người Mỹ gốc Phi, Tây Ban Nha, người Mỹ bản địa(8). Cơ chế gây hội chứng Steven-Johnson do sử dụng carbamazepine vẫn chưa được nghiên cứu rõ. Theo một số nghiên cứu, Carbamazepine được chuyển hóa thành dạng có hoạt tính sinh học và không gây độc cho tế bào, tuy nhiên một số enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa bị thiếu, dẫn tới tạo ra một số hoạt chất trung gian gây độc. Carbamazepine được chuyển thành dạng có hoạt tính sinh học gồm: Carbamazepine 10,11- epoxide, 3-hydroxy carbamazepine, 2- hydroxy carbamazepine và carbamazepine 2,3- epoxide nhờ enzyme cytochrome P450 ở gan. Hầu hết các phản ứng epoxides đều được khử độc thành dạng dihydrodiol không độc nhờ vi lạp thể epoxide hydrolase 1 (EPHX1) ở gan hoặc tạo thành các liên hợp glutathione bởi glutathione transferase. Dị ứng trên da do thuốc được kích hoạt bởi carbamazepine. Các tế bào gây độc T-CD8 trung gian chính xuất hiện trong hội chứng SJS. Nhiều bằng chứng cho thấy các dị ứng da do thuốc liên quan yếu tố phức hợp tương thích mô chính (MHC) phụ thuộc sự trình diện cơ chế chuyển hóa với tế bào T hoạt hóa. Các allele HLA-B khởi động đáp ứng miễn dịch bằng cách trình diện các kháng nguyên nội bào cho các tế bào T gây độc, kết quả dẫn tới sự tăng sinh các tế bào T gây độc. Nhiều thuốc sử dụng điều trị động kinh co giật (carbamazepine, phenytoin, henobarbital) gây hội chứng SJS/TENđã được ghi nhận. Ngoài ra, allele HLA-B*1502 còn được ghi nhận ở một nhóm nhỏ bệnh nhân sử dụng thuốc lamotrigine và phenytoin gây hội chứng SIS/TEN. Nhiều biến thể allele HLA-B được ghi nhận liên quan hội chứng SJS/TEN. Ví dụ, HLA-B*5701 đối với phản ứng quá mẫn khi dùng abacavir, HLA- B*5801 đối với allopurinol và HLA-B*1513 với phenytoin(8). Tuy nhiên, tỉ lệ tần số allele HLA-B*1502 vẫn còn chưa biết rõ ở nhiều vùng địa lí và các nhóm dân tộc tại Việt Nam. Với một nghiên cứu cho thấy 13,5% dân số Việt Nam có mang kiểu allele HLA-B*1502, nên Việt Nam là nước có nguy cơ cao bị hội chứng SJS/TEN khi điều trị với Carbamazepine(6). Nghiên cứu của chúng tôi thấy được tần suất allele rất cao (24,9%) tương đương với các nước Asian và nghiên cứu tại bệnh viện Bạch Mai (8,9). Vì vậy, bệnh nhân mới mắc bệnh động kinh nên được tầm soát kiểu allele HLA-B*1502 trước khi cân nhắc sử dụng thuốc carbamazepine. Thời gian trung bình biểu hiện hội chứng SJS/TEN do sử dụng carbamazepine là từ 25-90 ngày. Bệnh nhân đã điều trị với carbamazepine hơn 3 tháng mà không có biểu hiện di ứng thì không cần thực hiện các xét nghiệm HLA-B*1502 mà vẫn tiếp tục sử dụng thuốc (8). KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu xác định được 24,5% dân số có mang allele HLA-B*1502. Đây là tỉ lệ khá cao so với các nước trong khu vực châu Á. Để giảm tỉ lệ tử vong và tỉ lệ mắc bệnh liên quan tới sử dụng thuốc Carbamazepine trong điều trị động kinh, bệnh nhân nên được xét nghiệm xác định kiểu HLA-B*1502 trước khi điều trị bệnh. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brent FP, McLeod HL (2008), "Carbamazepine, HLA-B* 1502 and risk of Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: US FDA recommendations". 2. Chen P, et all (2011), "Carbamazepine-induced toxic effects and HLA-B* 1502 screening in Taiwan", New England Journal of Medicine. 364(12), pp. 1126-1133. 3. Chung WH, et all (2004), "Medical genetics: a marker for Stevens–Johnson syndrome", Nature. 428(6982), pp. 486- 486. 4. Hoa B, et all (2008), "HLA-A,-B,-C,-DRB1 and-DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam", Tissue Antigens. 71(2), pp. 127-134. 5. Hung SI, et all (2006), "Genetic susceptibility to carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions", Pharmacogenetics and genomics. 16(4), pp. 297- 306. 6. Lê Dương Hữu, al et (2008), "Tình hình quản lí bệnh động kinh tại huyện Châu Thành tỉnh Tiền Giang", Tạp chí Y Học TP. HCM. 12(1), pp. 315. 7. Lim KS, PatrickK, Tan CT (2008), "Association of HLA-B* 1502 allele and carbamazepine-induced severe adverse cutaneous drug reaction among Asians, a review", Neurology Asia. 13(6), pp. 15-21. 8. NinaBP, et al (2009), "The descriptive epidemiology of epilepsy—a review", Epilepsy research. 85(1), pp. 31-45. 9. Van Nguyen Dinh, et all (2015), "HLA-B* 1502 and carbamazepine-induced severe cutaneous adverse drug reactions in Vietnamese", Asia Pacific Allergy. 5(2), pp. 68. Ngày nhận bài báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016