Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 369 XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE TRONG MẪU THỦY HẢI SẢN Nguyễn Đỗ Phúc* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vibrio Cholerae là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua đường nước và thực phẩm. Việc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, là cần thiết nhằm đáp ứng nhanh cho công tác phát hiện sớm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời bệnh tiêu chảy do Vibrio cholerae gây ra thông qua thực phẩm. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR phát hiện Vibrio choleare trong thủy hải sản. Phương pháp: Khảo sát độ chọn lọc và độ đặc hiệu của phương pháp PCR. Đánh giá các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009). Kết quả: Giới hạn phát hiện 50% (LOD50) của phương pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu: 1-3 CFU/25g, sò: 0-1 CFU/25g và hến: 4- 6 CFU/25g). Riêng mẫu hàu chưa đạt yêu cầu (>9 CFU/25g). Các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: Độ chính xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chọn lọc (SE) trên 3 nền mẫu nghêu, sò và hến với tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN) đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009). Kết luận: Phương pháp PCR có thể ứng dụng để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản với nền mẫu nghêu, sò và hến. Từ khóa: PCR, Vibrio cholerae, thủy hải sản ABSTRACT VALIDATION OF PCR METHOD FOR DETECTION OF VIBRIO CHOLERAE IN SEAFOOD Nguyen Do Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 369 - 373 Background: Vibrio cholerae is one of the dangerous diarrheal pathogen transmitted through water and food. Applying a molecular method, polymerase chain reaction (PCR), is necessary for early detection of Vibrio cholerae infection through foods. Objectives: To assess validation of PCR method for detection of Vibrio cholera in seafood. Methods: Identify selectivity and validation of PCR method for detection of Vibrio cholerae in seafood with parameters: Limit detection 50 (LOD50), Sensitivity (SE), Specificity (SP), Accuracy (AC) False Positive (FP) and False Negative (FN) according to ISO/TS 16140 (2003) and NordVal (2009). Results: Limit of detection 50 (LOD50) were for clam (1-3 CFU/25 g), mussel (0-1 CFU/25g), baby clam (4- 6 CFU/25g), but oyster did not meet the requirement (>9 CFU/25g). Technical parameters: Accuracy (AC); Specificity (SP); Sensitivity (SE) False Positive (FP) and False Negative (FN) of PCR method on the three samples met the standard requirements. Conclusion: PCR is an applicable method for detection of Vibrio cholerae in seafood, especially in clam, mussel and baby clam. * Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907669008 Email: nguyendophucihph@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 370 Key words: PCR, Vibrio cholerae, seafood. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính đường tiêu hoá do phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây nên. Bệnh thường biểu hiện với những triệu chứng lâm sàng đột ngột, nhanh và nặng. Nếu không được điều trị kịp thời sẽ dẫn tới tử vong trong vài giờ và được xếp vào loại bệnh “cực kỳ nguy hiểm”. Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay vẫn còn khoảng hơn 30 nước có bệnh tả đang lưu hành, chủ yếu là ở Châu Á và Châu Phi. Mỗi năm ước tính trung bình có một triệu trường hợp mắc bệnh tả, số tử vong khoảng 200.000 ở Châu Phi và 100.000 ở Châu Á, trong đó 1/3 là trẻ em dưới 5 tuổi và 1/4 là trẻ em từ 5-14 tuổi, số còn lại là người lớn (2). Ở Việt Nam, bệnh tả do V. cholerae O1 ElTor xuất hiện năm 1964, ước tính có hàng trăm ngàn người mắc bệnh. Dịch tả lưu hành chủ yếu ở miền Nam, miền Trung, còn miền Bắc thì lẻ tẻ do du nhập từ miền Nam ra. Từ những năm sau đó, vẫn có các ca lẻ tẻ xảy ra nhưng không bùng phát thành dịch lớn. Cuối năm 2007 và đầu năm 2008, dịch tả đã quay trở lại nước ta và xuất hiện ở nhiều tỉnh thành trong cả nước. Những năm sau đó cho đến nay, hàng năm nước ta vẫn phải đối mặt với các vụ dịch tả lẻ tẻ xuất hiện trên cả nước và xảy ra ở nhiều tỉnh thành. Việc phòng và chống bệnh tả trong nước luôn được tuyên truyền rộng rãi trên các phương tiện thông tin đại chúng. Gần đây các vụ dịch tả đã xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới. Việt Nam cũng là một quốc gia chịu ảnh hưởng lớn bởi dịch tả với nhiều vụ dịch đã xảy ra đặc biệt là ở các vùng nông thôn và vùng sông nước. Do vậy việc giám sát dịch tễ học vi khuẩn V. cholerae là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết nhằm phát hiện và xử lý dịch kịp thời. Việc áp dụng phương pháp nhanh và dễ áp dụng để phát hiện V.cholerae, đặc biệt là trong nước và thực phẩm là hết sức cần thiết. Phương pháp nuôi cấy truyền thống hiện nay đang được áp dụng tại nhiều phòng thí nghiệm như AOAC 988-20:2010, FDA (chương 9), TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007(E)]. Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy đòi hỏi nhiều ngày, chưa đáp ứng nhanh cho công tác tìm nguyên nhân tiêu chảy do tả. PCR là phương pháp được lựa chọn để phát hiện nhanh V. cholerae trên cơ sở phát hiện đoạn gen ctxAB gây ra bệnh tả với thời gian nhanh trong vòng 24 giờ. Để có cơ sở chứng minh được năng lực của phòng thí nghiệm có thể áp dụng phương pháp PCR phát hiện V. cholerae hay không, việc xác nhận giá trị sử dụng phương pháp là yêu cầu bắt buộc hiện nay theo ISO 17025. Do đó đề tài tiến hành với các mục tiêu sau (1,3). Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng chủng chuẩn Vibrio cholerae để kiểm chứng qui trình nuôi cấy theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007(E)] (4). Đánh giá các thông số của phương pháp PCR phát hiện V. cholerae và nuôi cấy phát hiện V. cholerae theo BAM-FDA, chương 28 so với phương pháp nuôi cấy truyền thống theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007 (E)], gồm các thông số sau: LOD50, Độ chọn lọc, Độ nhạy, Độ đặc hiệu, Tỷ lệ dương tính giả, Tỷ lệ âm tính giả và Độ chính xác. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Chủng chứng dương (chủng đích): Vibrio choleraee - Ogawa ATCC 17803; Inaba ATCC 17804 Chủng chứng âm (chủng không đích): Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, E. coli ATCC 25923, Salmonella paratyphi ATCC 9150, Shigella sonnei ATCC 9290, Proteus ATCC 17258, Klebsiella ATCC 27489. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 371 Thực phẩm Nghêu, sò, hến và hàu. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp PCR Theo FDA, chương 18 (5) Quy trình PCR: ly trích DNA bằng nhiệt 1000C/10 phút, làm lạnh ngay sau khi đun trong một khay có đá trong 10 phút. Ly tâm 15.000 vòng/5 phút, hút 1µl dịch chiết DNA cho vào 24µl master mix PCR và khuếch đại DNA theo chu kỳ nhiệt. Chu kỳ nhiệt: biến tính ban đầu 95oC/15 phút và lặp lại 35 chu kỳ: 95oC/1 phút, 55 oC/1 phút, và kết thúc kéo dài 72oC/10 phút. Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2,5% có bổ sung Gelred. Điện di trong 30 phút. Sau đó quan sát kết quả trên máy chụp hình điện di bằng tia UV có bước sóng 312nm. Kết quả kích thước sản phẩm PCR là 777bp. Phương pháp khảo sát giá trị sử dụng phương pháp Theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009) (1,3). Khảo sát độ chọn lọc của phương pháp PCR dùng cho phát hiện các gene ctx của Vibrio cholerae bằng các chủng vi khuẩn không đích Chủng Vibrio cholerae được tăng sinh trên peptone kiềm và các chủng không đích khác tăng sinh trên BHI ở 37oC/20 giờ sau đó tách chiết DNA để thực hiện PCR. Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình PCR Giới hạn phát hiện (LOD50), mức chấp nhận ≤ 9 CFU/25g thực phẩm: Chủng Vibrio cholerae được tăng sinh trên peptone kiềm ở 37oC/20 giờ, pha loãng chủng về các nồng độ để đạt yêu cầu ≤9 CFU/25 g mẫu thực phẩm và gây nhiễm vào các nền mẫu và tăng sinh trên peptone kiềm (khoảng 3 nồng độ, các nồng độ pha loãng được xác nhận số vi khuẩn thực tế được kiểm tra trên TSA 1% muối). Ủ ở 37oC/20 giờ, tách chiết DNA và chạy PCR. Khảo sát độ nhạy tương đối (Se), độ đặc hiệu tương đối (Sp), độ chính xác tương đối (AC), tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN). Trên các nền mẫu: nghêu, sò và hến, mỗi nền mẫu chọn 60 mẫu, trong đó 30 mẫu nhiễm chủng Vibrio cholerae với mật độ vi khuẩn bằng 10xLOD50 và 30 mẫu không nhiễm chủng. Các mẫu được đánh số theo thứ tự, mù mẫu và cho các kiểm nghiệm viên thực hiện trên một mẫu với cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy. Kết quả được tổng hợp và xử lý số liệu theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009). Phương pháp nuôi cấy Theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872- 1:2007(E)] (4) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp multiplex- PCR Các chủng đích Vibrio cholera Ogawa và Inaba tăng sinh trên peptone kiềm và các chủng không đích (Vibrio parahaemolyticus, E. coli, Salmonella paratyphi, Shigella sonnei, Proteus, Klebsiella) được tăng sinh trên canh thang BHI, ủ 37oC/24h. Chủng đích được trộn chung để sử dụng làm chứng dương. Từ canh khuẩn này, tách chiết DNA và tiến hành thực hiện phản ứng PCR với chủng chứng dương, chứng âm là Nuclease – free H2O và DNA của các chủng không đích, sau đó tiến hành điện di. Kết quả điện di được trình bày trong hình 1, cho thấy duy nhất ở giếng với các chủng chứng dương mới xuất hiện các vạch tương ứng với kích thước của các gene ctx gây bệnh của Vibrio cholerae, còn tất cả các giếng còn lại (các vi khuẩn không đích) đều không xuất hiện vạch đặc trưng với chứng dương. Điều đó thể hiện khả năng đặc hiệu của phương pháp PCR đối với các gene ctx cho Vibrio choleare. Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 372 đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003). Hình 1: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương pháp PCR Chú thích: Giếng 10. MK: Thang DNA chuẩn 100bp; 9, (-): chứng âm; 8. (+): Chứng dương V. cholerae Inaba (777bp); 7. (+): Chứng dương V. cholerae Ogawa; 6: Salmonella; 5: Shigella; 4: Klebsiella, 3: E. coli; 2: Proteus, 1: Vibrio paraheamolyticus Giới hạn phát hiện (LOD50) Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp PCR bằng việc sử dụng các chủng đích với 5 mức gây nhiễm khác nhau: Lo- Không gây nhiễm; La1, La2, La3- có mức nhiễm dưới 10 CFU/25g và mức nhiễm L50 với khoảng 10-50 CFU/25g. Các mức gây nhiễm này được nhiễm vào các nền mẫu thực phẩm (nghêu, sò, hến và hàu) được tăng sinh trong canh thang peptone kiềm, ủ 37oC/20h. Tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR, với mức nhiễm Lo và L50 được thử nghiệm 1 lần; còn 3 mức nhiễm khác La1, La2, La3 được thực hiện 6 lần. Kết quả PCR được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: Giới hạn phát hiện của phương pháp PCR trên các nền mẫu Nền mẫu Vibrio cholerae Ogawa Vibrio cholerae Inaba Nghêu 1-3 CFU/25g 1-3 CFU/25g Sò 0-1 CFU/25g 0-1 CFU/25g Hến 4-6 CFU/25g 4-6 CFU/25g Hàu > 9 CFU/25g > 9 CFU/25g Các mẫu nghêu, sò và hến đạt yêu cầu về giới hạn phát hiện. Riêng mẫu hàu LOD50 là: > 9 CFU/25g vẫn chưa đáp ứng được về giới hạn phát hiện theo ISO/TS 16140 (2003). Do đó mẫu hàu không tiếp tục khảo sát các thông số tiếp theo. Xác định độ đúng (accuracy-AC), độ đặc hiệu (specificity-SP), độ nhạy (sensitivity- SE) theo ISO/TS 16140 (2003) Tiến hành thử nghiệm với 60 mẫu đối với mỗi nền mẫu (nghêu, sò và hến), trong đó 30 mẫu được gây nhiễm với nồng độ 10xLOD50 và 30 mẫu không gây nhiễm. Sau khi gây nhiễm, tăng sinh trong pepton kiềm, tiến hành thực hiện phản ứng multiplex-PCR, và thu được kết quả theo bảng 2. Từ kết quả ở bảng 2, tiến hành tính toán và thu được các giá trị thông số của phương pháp PCR (bảng 3). Bảng 2: Kết quả xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Kết quả của phương pháp PCR(FDA-Chương 18) Kết quả phương pháp nuôi cấy (TCVN 7905-1:2008) Nghêu Sò Hến Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) 28/29 1/30 28/30 0/30 27/29 2/30 Âm tính (-) 1/29 29/30 2/30 30/30 2/29 28/30 Bảng 3: Kết quả xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3 nền mẫu khảo sát Nền mẫu Tỷ lệ âm tính giả ND (%) Tỷ lệ dương tính giả PD (%) Độ chính xác tương đối AC (%) Độ nhạy tương đối SE (%) Độ đặc hiệu tương đối SP (%) Nghêu 3,45 3,33 96,6 96,55 96,67 Sò 6,67 0 96,67 93,33 100 Hến 6,9 6,67 93,22 93,1 93,33 Tiêu chí ≤ 10 ≤ 10 ≥ 90% ≥ 90% ≥ 90% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 373 Giá trị sử dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio cholerae với các thông số: độ chính xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chính xác (SE), tỷ lệ dương tính giả (FP) và tỷ lệ âm tính giả (FN) đều đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003) trên 3 nền mẫu nghêu, sò và hến. KẾT LUẬN Tính chọn lọc của phương pháp PCR bằng các chủng không đích: Phương pháp PCR đặc hiệu đối với gene ctx của Vibrio choleare. Giới hạn phát hiện (LOD50) của phương pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu, sò và hến): Nghêu: vào khoảng 0-3 CFU/25g. Sò: vào khoảng 0-1 CFU/25g. Hến: vào khoảng 4-6 CFU/25g. Mẫu hàu không đạt được LOD50 theo quy định: tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng của nền mẫu hàu lên phản ứng PCR. Giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên các nền mẫu nghêu, sò và hến đều đạt các tiêu chí về độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả.Kết quả của các giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3 nền mẫu (nghêu, sò và hến) đều đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003). Áp dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio cholerae để khảo sát tiếp tục trên các nền mẫu hải sản để có số liệu thực tế. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. International Standard (2003). ISO/TS 16140- Microbiology of food and animal feeding stuffs –Protocol for the validation of alternative methods, pp. 1-64. 2. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention (2004) - Detection of Cholera Toxin, pp. 64-88. 3. NordVal (2009). Protocol for validation of alternative microbiological methods, pp 1-16. 4. TCVN 7905-1(2008) [ISO 21872-1:2007(E)]. Phương pháp phát hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus, trang 1-13. 5. Walter HK, William LP, Thomas AC (2001). Chapter 28: Detection of Enterotoxigenic Vibrio cholerae in Foods by the Polymerase Chain Reaction. Bacteriological Analytical Manual, FDA, pp 1-6. Ngày nhận bài báo: 22/4/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19/7/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016