Xác định gen dreb3 của cây quýt (citrus clementina) bằng phương pháp in silico

KHCN 2 (31) - 2014 90 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam (Rutaceae), một trong những họ cây ăn quả quan trọng nhất trên thế giới. Quả của họ Cam có giá trị dinh dưỡng cao và rất giàu vitamin. Diện tích trồng các cây thuộc họ này ước đạt 8.785.549 ha trên toàn thế giới, sản lượng ước đạt khoảng trên 131 triệu tấn (FAOSTAT 2012). Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm của các cây thuộc họ Cam, quýt đạt trên dưới 700 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam 2012). Do có giá trị cao về kinh tế cũng như dinh dưỡng, cây quýt được lựa chọn để giải trình tự hệ gen. DREB nhóm A3 của Arabidopsis, còn được biết đến qua tên gọi ABI4 (protein không mẫn cảm với ABA-4, ABI4) thuộc họ các tác nhân điều hòa phiên mã DREB. Các protein thuộc họ này có chứa một vùng gắn ADN tên là AP2 (Apetala 2), vùng này có khả năng tương tác đặc hiệu với yếu tố DRE (yếu tố trả lời sự mất nước) có trình tự A/GCCGAC trong vùng khởi động của các gen thực thi. Qua đó hoạt hóa gen thực thi. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng ABI4 là các tác nhân chính tham gia vào khả năng chịu khô hạn và ánh sáng cường độ mạnh ở thực vật. ABI4 được cảm ứng bởi các tác nhân hữu sinh và vô sinh. Đến lượt mình ABI4 kiểm soát sự biểu hiện các gen liên quan tới sự trả lời với tín hiệu đường, sự nảy mầm của hạt giống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới xác định trình tự của gen DREB3 của cây quýt. Các đặc trưng vật lý và hóa học của các protein, kết quả phân tích cấu trúc và cây phả hệ sẽ được giới thiệu trong công trình này. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Cơ sở dữ liệu Trình tự hệ gen của cây quýt được lấy từ Wu và nnk. Trình tự DREB3 của cây Arabidopsis (AtAIB) được lấy từ Sakuma và nnk. 2.2. Xác định các gen DREB3 ở cây quýt Protein DREB3 của cây Arabidopsis được dùng làm khuôn dò, chương trình TBLASTN XÁC ĐỊNH GEN DREB3 CỦA CÂY QUÝT (Citrus clementina) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SILICO Cao Phi Bằng, Bùi Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ánh Trường Đại học Hùng Vương TÓM TẮT DREB3 thuộc về họ gen DREB (dehydration-responsive element binding), họ tác nhân điều hòa phiên mã có vai trò quan trọng ở thực vật. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên cứu in silico, chúng tôi đã xác định được gen DREB3 của cây quýt. CclDREB3 khá giống với các DREB thuộc phân nhóm A3 của các loài thực vật khác. Gen này có độ dài 1050 pb, mã hóa cho phân tử protein có kích thước 349 amino acid. Protein CclDREB3 có tính kiềm yếu với giá trị pI bằng 7,10. Mô hình cấu trúc 3D cho thấy vùng bảo thủ AP2 của CclDREB3 có cấu trúc bậc hai gồm một xoắn α và ba chuỗi β chạy song song ngược chiều. Từ khóa: cây quýt, DREB3, đặc điểm hóa - lí, in silico, mô hình 3D, xác định gen. KHCN 2 (31) - 2014 91 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG được sử dụng để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu hệ gen của cây quýt với giá trị e-value ở mức e-5. 2.3. Xác định các motif bảo thủ Các protein DREB3 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây lúa và cây quýt được sắp dãy bằng cách sử dụng phần mềm MEME. 2.4. Tạo cây phả hệ Các trình tự protein DREB3 và DREB2 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây lúa và DREB3 của cây quýt được sắp dãy bằng cách dùng phần mềm MAFFT [4]. Cây phả hệ được xây dựng từ các trình tự protein đã sắp dãy nhờ phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp Maximum Likelihood và tuân theo các tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), dữ liệu được xử lý là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại. 2.5. Các đặc điểm hóa - lý và cấu trúc không gian Các đặc điểm vật lí, hóa học của protein nghiên cứu được khảo sát nhờ các phần mềm của ExPASy. Cấu trúc không gian của phân tử protein được xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định gen DREB3 ở cây quýt Bảng 1. DREB3 của cây quýt và đặc điểm. Tên Locus Kích thước gen (pb) Kích thước protein (aa) Khối lượng phân tử (kDa) pI Số lượng Intron CclDREB3 Ciclev10033578m 1050 349 37,51 7,10 0 Chương trình TBLASTN được sử dụng để tìm gen tương đồng trên toàn bộ hệ gen của cây quýt với khuôn dò là protein AtAIB của cây Arabidopsis (AT2G40220). Bước đầu chúng tôi xác định được một gen có thể mã hóa cho DREB thuộc nhóm A3 (DREB3) của cây quýt (bảng 1). Kết quả phân tích motif bảo thủ bằng phần mềm MEME cho thấy, protein suy diễn của gen này có chứa vùng AP2 (hình 1a) đặc trưng cho các protein cùng họ DREB. Bên cạnh đó, motif KG- GPxN (hình 1b) đặc trưng cho các DREB thuộc nhóm A2 và A3 cũng có mặt trên protein DREB3. Trong vùng AP2, amino acid K26 đứng trước motif WLG đặc trưng cho các DREB3. Tương tự, amino acid R1 cũng được tìm thấy đứng phía trước motif KGGPxN. Hình 1: Trình tự vùng bảo thủ AP2 và motif KGGPxN được xây dựng từ các gen DREB3 của các cây Arabidopsis, cây lúa, cây táo, cây nho và cây quýt. Protein này được dùng làm khuôn để tìm các protein tương đồng ở các loài khác (orthologs) có trong cơ sở dữ liệu của NCBI, kết quả được trình bày ở bảng 2. Protein suy diễn có độ tương đồng cao với các DREB thuộc nhóm A3 của nhiều loài thực vật khác, mức độ tương đồng đạt trên 75%. Phép kiểm tra này cho phép khẳng định gen tìm được là DREB3. KHCN 2 (31) - 2014 92 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Bảng 2. Các protein tương đồng khác loài gần nhất với các DREB3 của cây quýt có trong cơ sở dữ liệu của NCBI Miêu tả trên NCBI Chỉ số cực đại Chỉ số tổng Mức độ so sánh Giá trị E-value Mức độ tương đồng Ký hiệu Genbank PREDICTED: ethylene-responsive transcription factor ABI4-like [Setaria italica] 112 112 18% 2E-26 89% XP_004963859.1 hypothetical protein SORBIDRAFT_09g016550 [Sorghum bicolor] 111 111 18% 2E-26 89% XP_002440922.1 abscisic acid insensitive 4-1 [Genlisea aurea] 120 120 20% 2E-29 88% EPS59065.1 Os05g0351200 [Oryza sativa Japonica Group] 113 113 20% 9E-27 84% NP_001174376.1 hypothetical protein OsI_19581 [Oryza sativa Indica Group] 113 113 20% 9E-27 84% EAY97659.1 hypothetical protein [Oryza sativa Japonica Group] 113 113 20% 1E-26 84% AAV44075.1 PREDICTED: ethylene-responsive transcription factor ABI4 [Zea mays] 112 112 22% 8E-27 75% XP_008649551.1 PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like [Glycine max] 113 113 19% 2E-26 75% XP_003535164.2 PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like isoform X2 [Glycine max] 110 110 19% 3E-26 75% XP_006575245.1 PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like isoform X1 [Glycine max] 112 112 19% 3E-26 75% XP_003518110.1 3.2. Đặc điểm của DREB3 của cây quýt Gen DREB3 của cây quýt là gen mã hóa liên tục, với chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn của nó có kích thước 349 amino acid, tương ứng với khối lượng 37,51 kDa. Protein DREB3 của cây quýt có tính kiềm yếu, với giá trị pI bằng 7,10 (bảng 1). Những đặc điểm này giống với đặc điểm của nhiều thành viên thuộc họ DREB của các loài thực vật khác. 3.3. Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của DREB3 của cây quýt Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của CclDREB3 được xây dựng nhờ chương trình Phyre2 (hình 2). Kết quả chỉ ra vùng này có ba chuỗi b và một xoắn a. Cấu trúc xoắn này giống với cấu trúc vùng AP2 của nhiều protein khác trong họ DREB, đảm bảo cho các DREB có khả năng tương tác với yếu tố cis trong promoter của các gen đích. Hình 2: Mô hình 3D cấu trúc bậc hai vùng AP2 của CclDREB3 KHCN 2 (31) - 2014 93 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 3.4. Phân tích cây phả hệ Cây phả hệ được thiết lập từ các protein DREB2 và DREB3 của cây Arabidopsis, cây lúa, cây dương, cây nho và DREB3 của cây quýt. Phù hợp với kết quả về phân tích motif bảo thủ cũng như xếp loại, DREB3 của cây quýt nằm trên cùng nhánh với các DREB3 của các thực vật khác. 4. KẾT LUẬN Trong công trình này chúng tôi đã xác định được một gen DREB3 của cây quýt trong hệ gen của loài cây này. Gen mã hóa DREB3 mã hóa liên tục, có chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn có chiều dài 349 amino acid. Protein này có độ tương đồng cao với các DREB thuộc phân nhóm A3 của các thực vật khác. Hơn nữa, protein này có mang vùng bảo thủ AP2 và motif KGGPxN và nhiều amino acid đặc trưng cho DREB thuộc phân nhóm A3. Riêng vùng AP2 có cấu trúc bậc hai gồm 3 chuỗi b và một xoắn a. Kết quả bước đầu này có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho việc nghiên cứu chức năng của DREB3 ở loài cây này. Lời cảm ơn Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản của Trường Đại học Hùng Vương. Tài liệu tham khảo 1. Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW. 2006. MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs. Nucleic acids research 34:W369-W73 2. Foyer CH, Kerchev PI, Hancock RD. 2012. The ABA-INSENSITIVE-4 (ABI4) transcrip- tion factor links redox, hormone and sugar signaling pathways. Plant Signal Behav 7:276-81 3. Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A. 2003. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-8 4. Katoh K, Standley DM. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol 30:772-80 5. Kelley LA, Sternberg MJ. 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat Protoc 4:363-71 6. Liu Y, Heying E, Tanumihardjo SA. 2012. History, Global Distribution, and Nutritional Importance of Citrus Fruits. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 11:530-45 7. Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2012. AP2/ERF family transcription fac- tors is plant abiotic stress responses. Biochem Biophys Acta 1819:86-96 8. Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2002. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors Hình 3: Cây phả hệ được xây dựng từ các DREB2 và DREB3