Xác định epitop tiềm năng trên protein flic và ompn3 của edwardsiella ictaluri in silico để hướng đến ứng dụng làm vaccin phòng bệnh gan thận mủ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 32 XÁC ĐỊNH EPITOP TIỀM NĂNG TRÊN PROTEIN FLIC VÀ OMPN3 CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO ĐỂ HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM VACCIN PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ Nguyễn Thị Linh Giang*, Nguyễn Anh Minh*, Huỳnh Xuân Yến*, Trần Cát Đông*, Vũ Thanh Thảo* TÓM TẮT Mở đầu: Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn. Một số protein kháng nguyên tiềm năng của E. ictaluri đã được nghiên cứu như OmpN3 và fliC nhằm ứng dụng trong việc tạo vaccin tái tổ hợp để phòng bệnh. Để các vaccin này có thể chủng ngừa qua đường niêm mạc, kháng nguyên cần được cố định lên giá mang như Bacillus subtilis để tăng hiệu quả tác động. Mục tiêu: Xác định vùng mang tính kháng nguyên của trình tự fliC và OmpN3, đồng thời trình tự nucleotide mã hóa cho các vùng này cũng được tối ưu hóa để biểu hiện trong Bacillus subtilis. Phương pháp: 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh gan thận mủ được định danh bằng phản ứng sinh hóa và giải trình tự 16S rDNA. Các gen fliC và OmpN3 được khuếch đại và giải trình tự để so sánh độ tương đồng. Vùng mang tính kháng nguyên của fliC và OmpN3 được xác định bằng chương trình Imed, EpiC và Swiss-Model. Quá trình tối ưu hóa vùng có tính kháng nguyên để biểu hiện trên Bacillus subitlis được thực hiện với chương trình ATGme. Kết quả: 30 chủng E. ictaluri MS-17-156 đã được phân lập và định danh thành công. Nghiên cứu đã xác định và tối ưu hóa thành công đoạn gen mã hóa cho vùng kháng nguyên gồm 60 acid amin của protein fliC và OMPN3 với chỉ số CAI của trình tự sau tối ưu hóa lần lượt đạt 0,825 và 0,811. Kết luận: Trình tự đoạn nucleotide mã hóa cho vùng kháng nguyên của gen fliC và OmpN3 đã tối ưu hóa in silico dự đoán có khả năng gây miễn dịch đặc hiệu đối với bệnh gan thận mủ, làm tiền đề cho các nghiên cứu phát triển vaccin tái tổ hợp. Từ khóa: fliC, OmpN3, epitope, E. ictaluri ABSTRACT IDENTIFICATION OF POTENTIAL EPITOPES ON OMPN3 AND FLIC PROTEIN FROM EDWARDSIELLA ICTALURI IN SILICO TO SERVE AS VACCINE CANDIDATES AGAINST SEPTICEMIA Nguyen Thi Linh Giang, Nguyen Anh Minh, Huynh Xuan Yen, Tran Cat Dong, Vu Thanh Thao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 32 – 39 Introduction: Edwardsiella ictaluri is the causative agent of Enteric septicemia in catfish (ESC). OmpN3 and fliC protein from this bacteria have been proved to be potential vaccine candidates against ESC. Therefore, in an attempt to develop recombinant mucosal vaccine, epitopes on these proteins are identified and presented on the flagella of Bacillus subtilis to induce effective immune responses. Method: 30 bacterial strains were isolated from catfish with ESC and identified based on their biochemical profiles and 16S rDNA sequences. fliC and OmpN3 genes of these strains were amplified, sequenced and aligned. Their immunogenic regions were then identified and analyzed by bioinformatics software such as Imed, EpiC and Swiss-Model. Besides, the coding sequence of the chosen immunogenic region for expression in Bacillus subtilis was optimized by using ATGme program. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 02838295641 – 127 Email: vuthanhthao@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 33 Result: Collected strains are identified to be E. ictaluri MS-17-156. The study has successfully determined and optimized the nucleotide sequence encoding for 60 amino acids which has highest immunogenicity for fliC and OMPN3 candidate protein. The CAI values of the optimized fliC and OmpN3 coding sequences are 0.825 and 0.811, respectively. Conclusion: The chosen antigenic regions of fliC and OMPN3 prove to be potential epitopes for development of recombinant vaccines against ESC. Key words: fliC, OmpN3, epitope, E. ictaluri MỞ ĐẦU Edwardsiella ictaluri là trực khuẩn Gram (-) thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh gan thận mủ ở cá da trơn, đặc biệt là cá tra. Bệnh ảnh hưởng lên cá ở mọi giai đoạn, phát triển nhanh chóng, lây lan mạnh và gây tỷ lệ chết cao(1). Điều trị với kháng sinh chỉ hiệu quả trong giai đoạn đầu khi cá mới nhiễm bệnh. Do đó, biện pháp thích hợp nhất để dự phòng bệnh cho cá là sử dụng vaccin. Các nghiên cứu trong giai đoạn đầu chủ yếu sử dụng vaccin vi khuẩn bất hoạt. Tuy nhiên, khả năng gây miễn dịch ở cá không được kéo dài(8). Sau đó, các nghiên cứu hướng đến việc sử dụng vaccin giảm độc lực để chủng ngừa cho cá. Các vaccin dạng này thường dùng dưới dạng tiêm phúc mô vì vậy không thể áp dụng với số lượng cá thể lớn. Do đó, việc phát triển vaccin tái tổ hợp có thể chủng ngừa qua đường niêm mạc sẽ giúp khắc phục các nhược điểm này. Đối với các vaccin tái tổ hợp, việc lựa chọn kháng nguyên có tính chất quyết định hiệu quả chủng ngừa của vaccin. Trong số các kháng nguyên của E. ictaluri, protein màng ngoài (Outer membrane protein - Omp), và protein tiêm mao được chứng minh có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, đây là các ứng viên tiềm năng trong việc tạo vaccin tái tổ hợp. Omp là protein màng ngoài được nhận diện cao bởi kháng thể trong huyết thanh của cá nhiễm E. ictalurid(7). Trong ba loại OmpN đã được xác định ở E. ictaluri, OmpN3 có khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở cá tốt nhất(11). Đối với protein tiêm mao, gen mã hóa cho protein fliC của E. tarda tái tổ hợp vào E. coli được sử dụng để tạo vaccin DNA phòng bệnh cho cá(3). Gần đây, Panangala và cs. đã xác định trên E. ictaluri có hai flagellin 35 và 37 kDa được mã hóa bởi 4 gen fliC1, fliC2, fliC3 và fliC4(6) có tính kháng nguyên và thể ứng dụng làm vaccin gan thận mủ. Sự phát triển của tin sinh học kết hợp với những tiến bộ trong công nghệ DNA tái tổ hợp, kiến thức về đáp ứng miễn dịch của vật chủ và vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh đã mở ra một hướng đi mới cho sản xuất vaccin. Các phần mềm dự đoán vùng mang tính kháng nguyên in silico từ trình tự amino acid được phát triển dựa trên nhiều yếu tố, bao gồm cấu trúc biểu hiện trên bề mặt dự đoán, tính linh động của cấu trúc và các nhân tố trong trình tự gen có liên quan đến tính gây miễn dịch như epitope của tế bào T và tế bào B(9). Hiện nay, phương pháp thông dụng nhất để dự đoán cấu trúc protein là mô phỏng tương đồng. Trong đó, trình tự protein đích được so sánh với cơ sở dữ liệu Protein Data Bank, từ đó tìm ra trình tự nào đã được xác định cấu trúc bằng thực nghiệm tương đồng với trình tự mục tiêu. Dựa trên trình tự này, các phần mềm sẽ xây dựng cấu trúc dự đoán của protein mục tiêu. Bên cạnh đó, gen mục tiêu cần được tối ưu hóa cho sự biểu hiện bởi chủng tái tổ hợp dự kiến nhằm tránh hiện tượng dị biệt codon. Tần suất sử dụng các codon đồng nghĩa thường có sự khác biệt giữa các loài, và đây thường được xem như một trong những nguyên nhân chính tác động đến Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 34 mức độ biểu hiện protein(10). Chỉ số tương thích codon (Codon Adaption Index - CAI) và số lượng codon hoạt động hiệu quả (Effective number of codon - ENc) là hai chỉ số thường được quan tâm khi tiến hành tối ưu hóa. Nghiên cứu tiến hành xác định và tối ưu hóa đoạn nucleotide mã hóa vùng mang tính kháng nguyên của protein OmpN3 và fliC của E. ictaluri. Các trình tự mang tính kháng nguyên này sẽ được chèn vào vùng biến động (acid amin 144-217) ở giữa cấu trúc tiêm mao hag của B. subtilis nhằm hướng đến ứng dụng làm vaccin niêm mạc phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vi khuẩn 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra bị gan thận mủ ở Đồng bằng sông Cửu Long được cung cấp bởi công ty Vemedim. E. ictaluri medium (EIM) là môi trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn. Kit API 20E (BioMerieux) dùng để khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn. Định danh các chủng vi khuẩn Vi khuẩn thu nhận được cấy trên môi trường EIM, quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc. Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu Gen mục tiêu Tên Trình tự 5’-3’ Kích thước 16S rDNA 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492 bp 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT fliC4 fliC4_F TTTTCACTATGGGTGCCGATAG 1227 bp fliC4_R GCCAATCGGCCATATACACTGG OmpN3 OmpN3_F AAAAAGCAACGCCGTTGCTC 1269 bp OmpN3_R AGCATAGGGTATCAGAGGGTATC Các chủng vi khuẩn được định danh dựa trên đặc điểm sinh hóa thông qua kit API 20E. Đồng thời, các chủng vi khuẩn được định danh ở cấp độ phân tử bằng giải trình tự gen 16S rDNA (Bảng 1). Mỗi mẫu được giải trình tự với 2 phản ứng sử dụng mồi 27F và 1492R, thực hiện bởi công ty Base I (Malaysia). Trình tự thu được từ các phản ứng này được lắp ráp lại dựa trên vùng gối đầu của các trình tự bằng chương trình SeqMan (Lasergene 7.0). Trình tự được đưa lên NCBI nBLAST để so sánh với dữ liệu DNA của GenBank. Các loài có giá trị E thấp nhất và vùng Query Coverage cao nhất là tương đối gần nhất với các chủng giải trình tự. Xác định trình tự mang tính kháng nguyên của fliC và OmpN3 Nghiên cứu của Panangala và cs. đã xác định và giải trình tự được 4 gen fliC1, fliC2, fliC3 và fliC4 cùng quy định cho tiêm mao fliC của E. ictaluri, có trình tự acid amin trên cơ sở dữ liệu NCBI tương ứng lần lượt là AVZ83421.1, AVZ83422.1, AVZ83423.1 và AVZ83424.1(6). Các trình tự acid amin này được gióng hàng cho thấy vùng bảo tồn thuộc acid amin 1-160 ở đầu tận N và 74 acid amin cuối ở đầu tận C, tương ứng với domain D0/D1 của cấu trúc flagella vi khuẩn Gram âm. Domain D0/D1 sẽ gấp cuộn và tương tác với Toll-like Receptor 5 gây đáp ứng miễn dịch. Vì vậy, lựa chọn trình tự mang tính kháng nguyên trên vùng biến động của gen để tạo được miễn dịch đặc hiệu đối với E. ictaluri. Khi so sánh vùng biến động của các trình tự fliC1-fliC4, nhận thấy vùng biến động trong của trình tự acid amin quy định bởi gen fliC4 biểu hiện trên bề mặt của phân tử protein (theo kết quả mô phỏng cấu trúc của protein từ chương trình Swiss-Model), do đó sẽ có khả Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 35 năng tạo miễn dịch tốt hơn(2). Cụ thể, một trình tự biểu hiện lên bề mặt sẽ tương tác được với kháng thể hiệu quả hơn (hoạt động như B-cell epitope). Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn gen fliC4 là gen đích để xác định vùng mang tính kháng nguyên đặc hiệu đối với E. ictaluri. Neema và cs. đã ứng dụng tin sinh học xác định cấu trúc và chức năng của OmpN. Kết quả, ở E. ictaluri có 3 OmpN (OmpN1, OmpN2 và OmpN3)(5). Yang và cs. đã tạo dòng và biểu hiện thành công rOmpN để thử nghiệm khả năng bảo vệ chống lại E. ictaluri. Kết quả cho thấy chủng ngừa bằng protein rOmpN3 có phần trăm sống sót tương đối là 67,5%, cao hơn so với rOmpN1 và rOmpN2(11). Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn gen OmpN3 là gen đích để xác định vùng mang tính kháng nguyên. Trình tự fliC4 và OmpN3 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với DNA nhiễm sắc thể của 30 chủng E. ictaluri phân lập được sau đó được tinh chế và giải trình tự với cặp mồi tương ứng (Bảng 1), đưa lên NCBI BLASTx để so sánh với dữ liệu của GenBank và so sánh độ tương đồng bằng phần mềm MegAlign (Lasergene 7.0). Trình tự mang tính kháng nguyên được dự đoán bằng chương trình Imed (imed.med.ucm.es) và EpiC (bioware.ucd.ie/epic) với tiêu chí: có tính kích thích miễn dịch mạnh, quy định cho chuỗi 60 acid amin và nằm trên bề mặt của protein fliC hoặc OmpN3 của E. ictaluri (kiểm tra với chương trình Swiss-Model). Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp hag mang các kháng nguyên khảm Các trình tự mang tính kháng nguyên của fliC và OmpN3 sau khi lựa chọn thành công được tiến hành tái tổ hợp giả định bởi chương trình SnapGene để thu nhận protein hag.NFC và hag.NOC. Các protein tái tổ hợp được kiểm tra lại tính kháng nguyên và sự biểu hiện lên bề mặt tiêm mao của đoạn kháng nguyên chèn bằng chương trình Imed và Swiss-Model. Tối ưu hóa các gen cho sự biểu hiện bởi Bacillus subtilis Quá trình tối ưu hóa được thực hiện bằng cách thay thế các codon hiếm và rất hiếm của trình tự mang tính kháng nguyên thành các codon tối ưu cho B. subtilis (dựa trên bảng mã tần suất sử dụng codon của B. subtilis subsp. subtilis str. 168), tuy nhiên, nếu codon hiếm hoặc rất hiếm đó có xuất hiện trong gen hag nguyên thủy thì không thay thế. Mục tiêu đạt được chỉ số CAI tương đương với CAI của vùng biến động gen hag là 0,812. Sau khi đạt được trình tự tối ưu cho B. subtilis, tiến hành kiểm tra sự tối ưu của trình tự này trên E. coli B ( giúp biểu hiện các protein có tính kháng nguyên ở dạng vaccin tiểu đơn vị để so sánh với các vaccin tái tổ hợp trên Bacillus subtilis trong các nghiên cứu tiếp theo) và thay đổi codon rất hiếm hoặc không sử dụng (nếu có), chỉ số CAI cần đạt được khoảng 0,5-0,6. Trình tự sau tối ưu hóa được tổng hợp tại công ty Genscript® dưới dạng plasmid pUC57.FNG. KẾT QUẢ Định danh các chủng vi khuẩn Trên môi trường EIM, E. ictaluri là những khuẩn lạc tròn, trơn, lồi, có màu xanh lá, đường kính từ 1-2 mm sau 48 giờ ở 28 oC (Hình 1A). Thử nghiệm trên kit API 20E (Hình 1B) cho kết quả mã của tất cả 30 chủng 4004000, là E. ictaluri. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 36 (A) (B) Hình 1: Hình thái khóm và các phản ứng sinh hóa trên kit API 20E. Gen 16S rDNA được khuếch đại thành công với cặp mồi 27F/1492R (giếng 1-30, Hình 2). Kết quả giải trình tự cho thấy độ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu (CPCP028813.1) từ GenBank. Từ các kết quả về hình thái, sinh hóa và trình tự 16S rDNA, có thể kết luận các chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh là các chủng E. ictaluri MS-17-156. 1500 bp M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hình 2: Sản phẩm PCR trình tự 16S rDNA của 30 chủng vi khuẩn. Xác định và tối ưu hóa trình tự mang tính kháng nguyên của fliC Gen fliC4 (1.227 bp) được thu nhận thành công từ DNA nhiễm sắc thể của E. ictaluri bằng phản ứng PCR. Kết quả giải trình tự fliC4 so sánh với dữ liệu DNA trong GenBank thông qua BLASTx nhận thấy sự tương đồng 99-100% với trình tự quy định flagellin C của chủng E. ictaluri MS-17-156, Accession ID AVZ83424.1. 30 trình tự fliC4 này cũng giống nhau khi so sánh bằng công cụ Clustal W của phần mềm MegAlign. (A) (B) (C) Hình 3: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên trên trình tự fliC AVZ83424.1. (A). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng Imed; (B). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C). Mô phỏng tương đồng fliC bằng Swiss-Model Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC được xác định dựa trên trình tự acid amin flagellin C, GenBank Accession ID AVZ83424.1 bằng chương trình Imed và EpiC, thu nhận được trình tự nằm từ acid amin 201 đến 259 (Hình 3A và 3B). Khi tiến hành mô phỏng tương đồng cấu trúc protein fliC của E. ictaluri dựa trên khuôn mẫu protein 3K8V Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 37 bằng chương trình Swiss-Model nhận thấy vùng acid amin 201 đến 259 biểu hiện trên bề mặt của protein fliC (vùng màu đỏ, Hình 3C). Xác định trình tự mang tính kháng nguyên của OmpN3. Gen OmpN3 (1.269 bp) được thu nhận thành công từ DNA NST của E. ictaluri. Kết quả so sánh các trình tự này với nhau nhờ công cụ Clustal W của phần mềm MegAlign cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa protein OMPN3 được bảo tồn ở các chủng và không ghi nhận vùng biến động trên các trình tự. Kết quả BLASTx cho thấy trình tự OmpN3 quy định cho porin của E. ictaluri MS- 17-156, Accession ID WP_081167023.1. Vùng mang tính kháng nguyên trên OmpN3 được xác định bằng chương trình Imed và EpiC dựa trên trình tự WP_081167023.1, kết quả cho thấy đoạn acid amin có giá trị dự đoán cao nhất trong toàn bộ phân tử protein là đoạn 50 acid amin từ vị trí 258 đến 308 (Hình 4A và 4B). Kết quả mô phỏng tương đồng OMPN3 của E. ictaluri bằng chương trình Swiss-Model cho thấy cấu trúc vùng acid amin 258-308 khá rộng, dễ tương tác không gian với các phân từ khác (Hình 4C). (A) (B) (C) Hình 4: Kết quả dự đoán vùng mang tính kháng nguyên của OMPN3. (A). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng Imed; (B). Vùng mang tính kháng nguyên xác định bằng EpiC; (C). Mô phỏng tương đồng OMPN3 bằng Swiss-Model Mô phỏng cấu trúc protein tái tổ hợp mang kháng nguyên khảm Trình tự DNA quy định cho vùng mang tính kháng nguyên dự đoán của fliC và OMPN3 được sử dụng để tái tổ hợp giả định với fragment N-terminal và C-terminal của gen hag để thu nhận protein hag.NFC và hag.NOC. 5WJZ 5WJT (A) (C) (B) hag.NFC hag.NOC Hình 5: Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên trên protein hag.NFC và hag.NOC (A). Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên của protein hag.NFC bằng Imed; (B). Kiểm tra vùng mang tính kháng nguyên của protein hag.NOC bằng Imed; (C). Bề mặt protein hag.NFC và hag.NOC mô phỏng tương đồng bằng Swiss-Model Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 38 Trình tự acid amin của các protein khảm này được kiểm tra với phần mềm Imed, nhận thấy tính kháng nguyên của đoạn chèn vào vùng biến động của gen hag vẫn được bảo tồn (Hình 5A và 5B), vùng mang tính kháng nguyên này cũng biểu hiện lên bề mặt protein hag.NFC và hag.NOC khi mô phỏng tương đồng bằng Swiss-Model dựa trên khuôn mẫu subunit flagella filament 5WJT và 5WJZ của B. subtilis (vùng màu đỏ, Hình 5C). Tối ưu hóa các trình tự mang tính kháng nguyên của OmpN3 và fliC Các codon hiếm và rất hiếm xuất hiện trong trình tự mã hóa vùng mang tính kháng nguyên fliC và ompN3 được xác định bằng chương trình ATGme như ACT, TCC, GTC, ACC, GCT, TAC và các codon có mức độ biểu hiện trung bình GAG, GGT, CAG, GCA, GAT, AAG, AGC được thay thế bằng các codon có mức độ biểu hiện cao nhằm đạt được chỉ số CAI tương dương với gen hag trong B. subtilis. Trình tự DNA mã hóa vùng mang tính kháng nguyên của fliC và ompN3 sau khi tối ưu hóa được trình bày dưới đây với các codon tối ưu được in đậm. Trình tự mang tính kháng nguyên của fliC sau khi tối ưu hóa có CDS 180 bp: GCT ACA GGC TCT TTG GAA CTG ACA AAA GGA CAA ACA CTG GTT TCA GGA ACA GAT GCT ACA GGA GCT GCG ACA TAT TAT CTG AAG GGT GTT GAC GCA GCA ACA GGT AAA GTA ACA TAT TCA TCT GTT AAA TTT ACT GTT GAT GCA AAA GAT GCA ACA AAA GTT ACT GTT GCG GCA GAT AAA Trình tự mang tính kháng nguyên của OmpN3 sau khi tối ưu hóa có CDS 174 bp: CTT GCA CGC TAT GAT AAC CAC AAT GTA TAT CTT GCA GCA ATC TAT GGT GAA GTA AAG AAT ATG CAC TAT ATT GGT AAA CAG GAT GGA TTC GCA CCT AAG GCA CGT GGA TAT GAG CTT CTT GCA CAG TAT CAG TTC GAC TGC GGT CTT AAA CCT TCA CTT GCA TAT CTT AAC GGA Các giá trị tham số của quá trình tối ưu hóa được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Các giá trị tham số của quá trình tối ưu hóa Trình tự Bacillus subtilis Escherichia coli B CAI ENc CAI Vùng biến động gen hag 0,812 41 fliC sau tối ưu hóa 0,825 34 0,569 OmpN3 sau tối ưu hóa 0,811 32 0,583 Giá trị CAI của trình tự mã hóa kháng nguyên fliC và OmpN3 đã đạt mục tiêu đề ra, xấp xỉ 0,812 của vùng biến động gen hag, dựa trên tần suất sử dụng codon của B. subtilis. Hệ số CAI của cả 2 trình tự mã hóa vùng mang tính kháng nguyên trên E. coli là khoảng 0,55. BÀN LUẬN Trong số các kháng nguyên, fliC và OMPN3 là các ứng viên tiềm năng cho vai trò tác nhân trị liệu. FliC là một protein tiêm mao của vi khuẩn Gram âm đã được chứng minh có liên quan đến độc lực của nhiều tác nhân gây bệnh ở cá như Vibrio anguillarum, V. fischeri, Aeromonas hydrophila, E. tarda. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng flagellin C như một tá dược miễn dịch(3) nhưng chưa có nghiên cứu ứng dụng fliC làm tác nhân gây miễn dịch đặc hiệu như trong nghiên cứu này. Việc nhóm nghiên cứu lựa chọn vùng biến động của gen fliC4 của E. ictaluri thể hiện nhiều đặc tính của một kháng nguyên hiệu quả: thân nước, đặc hiệu đối với E. ictaluri và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh. Protein màng ngoài đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu sản xuất vaccin chống lại các bệnh nhiễm ở cá(4). Nghiên cứu đã thực hiện mô phỏng cấu trúc 3D của protein OMPN3 và dự đoán vùng mang tính kháng nguyên mạnh trên phân tử. Từ đó, lựa chọn vùng 51 acid amin (258-308) của OMPN3, nhằm mục đích tăng đáp ứng miễn dịch vì vùng này dễ dàng được nhận diện bởi hệ thống miễn dịch của cá. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 39 KẾT LUẬN Nghiên cứu đã định danh được 30 chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ở vùng đồng bằng sông Cửu Long là E. ictaluri bằng giải trình tự 16S rDNA và phản ứng sinh hóa. Trình tự của vùng mang tính kháng nguyên của các ứng viên tiềm năng fliC và OmpN3 được xác định và tối ưu hóa in silico cho sự biểu hiện bởi B. subtilis. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài số 240/2017/HĐ-SKHCN do Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ Chí Minh cấp cho Vũ Thanh Thảo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Crumlish M, Dung TT, Turnbull JF, et al. (2002), "Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam", Journal of Fish Diseases. 25(12), pp.733-736. 2. Hopp TP, Woods KR (1981), "Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences", Proc Natl Acad Sci U S A. 78(6), pp.3824-3828. 3. Jiao XD, Zhang M, Hu YH, et al. (2009), "Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens", Vaccine. 27(38), pp.5195-5202. 4. Luo Z, Fu J, Li N, et al. (2016), "Immunogenic proteins and their vaccine development potential evaluation in outer membrane proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare", Aquaculture and Fisheries. 1, pp.1-8. 5. Neema NM, Karunasagar I, et al. (2011), Structural and functional characterization of outer membrane protein N in Edwardsiella ictaluri: A bioinformatic approach. Vol. 2. 6. Panangala VS, Russo R, Santen VLV, et al. (2009), "Organization and sequence of four flagellin‐encoding genes of Edwardsiella ictaluri", Aquaculture Research. 40(10), pp.1135-1147. 7. Park SB, Jang HB, Nho SW, et al. (2011), "Outer Membrane Vesicles as a Candidate Vaccine against Edwardsiellosis", Plos One. 6(3), e17629. 8. Shoemaker CA, Klesius P H (1997), "Protective immunity against enteric septicaemia in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), following controlled exposure to Edwardsiella ictaluri", Journal of Fish Diseases. 20(5), pp.361-368. 9. Soria-Guerra RE, Nieto-Gomez R, Govea-Alonso DO, et al. (2015), "An overview of bioinformatics tools for epitope prediction: Implications on vaccine development", Journal of Biomedical Informatics. 53, pp.405-414. 10. Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, et al. (2006), "Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments", BMC Bioinformatics. 7, pp.285. 11. Yang Q, Pan YL, Wang KY, et al. (2016), "OmpN, outer membrane proteins of Edwardsiella ictaluri are potential vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus punctatus)", Molecular Immunology. 78, pp.1-8. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019