Xác định đột biến Exon 3, 9 gen CDH1 trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa – Đinh Thị Thảo

TCNCYH 117 (1) - 2019 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON 3, 9 GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY THỂ LAN TỎA Đinh Thị Thảo1, Nguyễn Thị Ngọc Lan2, Tạ Thành Văn2, Đặng Thị Ngọc Dung2 1Bệnh viện Trung ương Quân đội108; 2Trường Đại học Y Hà Nội Ung thư dạ dày là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo phân loại của Lauren ung thư dạ dày thể lan tỏa là một trong ba thể ung thư dạ dày, chiếm tỉ lệ khoảng 20%, được đặc trưng bởi sự biệt hĩa kém, khả năng xâm lấn và di căn cao. CDH1 là gen mã hĩa cho protein E-cadherin, đĩng vai trị quan trọng trong kết dính tế bào-tế bào và duy trì tính tồn vẹn biểu mơ. Chính vì những chức năng quan trọng này mà đột biến gen CDH1 làm tăng nguy cơ gây ung thư dạ dày. Đột biến soma gen CDH1 đã được chứng minh là một trong những cơ chế phân tử thứ 2 gây ra ung thư dạ dày thể lan tỏa. Phương pháp nghiên cứu: chúng tơi tiến hành giải trình tự 2 exon 3 và 9 gen CDH1 của 50 bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa cĩ tuổi trung bình là 51,42 tuổi, điều trị tại Bệnh viện Trung ương Quân Đội 108 và Bệnh viện K cơ sở Tân Triều từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2017. Phát hiện 2 trong số 50 bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa (chiếm 4%) cĩ đột biến trên exon 9 là đột biến thay thế 1298T > A, làm thay thế acid amin Valin bằng Aspartate; đột biến chưa được cơng bố trước đây. Khơng cĩ bệnh nhân nào cĩ đột biến exon 3 gen CDH1. Từ khĩa: Ung thư dạ dày, gen CDH1 Địa chỉ liên hệ: Đinh Thị Thảo, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Email: thaodinh3883@gmail.com Ngày nhận: 25/9/2018 Ngày được chấp thuận: 18/10/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân thứ 3 gây tử vong trên tồn thế giới do ung thư [3]. Tỷ lệ mắc cao nhất ở khu vực Đơng Nam Á và Việt Nam là nước cĩ tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất trong khu vực [1]. Ung thư dạ dày thể lan tỏa chiếm tỉ lệ khoảng 20% tổng số ung thư dạ dày, được đặc trưng bởi sự biệt hĩa kém, khả năng xâm lấn và di căn cao. Mặc dù đã cĩ nhiều tiến bộ trong chẩn đốn, điều trị nhưng tiên lượng ung thư dạ dày thể lan tỏa hiện nay vẫn cịn xấu, đặc biệt là ung thư dạ dày lan tỏa tiến triển, với tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 31% [2]. Theo các nghiên cứu trên thế giới, tỷ lệ đột biến gen CDH1 chiếm từ 3 đến 50% trong bệnh ung thư dạ dày thể lan tỏa. Trong suốt cuộc đời, người mang đột biến gen CDH1 cĩ nguy cơ mắc ung thư dạ dày lan toả lên đến 67% đối với nam và 83% đối với nữ [4]. Ung thư dạ dày lan tỏa liên quan đến đột biến gen CDH1, là một hội chứng di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể thường, tồn tại ở dạng dị hợp tử. Tuy nhiên, khơng phải tất cả những người thừa hưởng đột biến di truyền gen CDH1 sẽ phát triển ung thư, cần cĩ thêm cơ chế phân tử thứ 2 gọi là “second hit”để bất hoạt hồn tồn chức năng cả 2 alen của gen này. Đột biến soma gen CDH1 được cho là một trong những “second hit” gây lên bệnh ung thư dạ dày thể lan tỏa [7; 10]. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm: “Xác định đột biến exon 3 và 9 gen CDH1 trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa”. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 16 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC - Tiêu chuẩn lựa chọn Chọn 50 bệnh nhân được chẩn đốn ung thư dạ dày thể lan tỏa (dựa vào kết quả giải phẫu bệnh, theo phân loại của Lauren 1965) gồm cả nam và nữ, điều trị tại Bệnh viện Trung ương Quân Đội 108 và Bệnh viện K cơ sở Tân Triều từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2017. - Tiêu chuẩn loại trừ Các bệnh nhân ung thư dạ dày khơng lan tỏa, khơng mắc các bệnh ung thư khác và những người khơng tình nguyện tham gia nghiên cứu. 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu: mơ tả cắt ngang. - Chọn mẫu nghiên cứu theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện. - Nghiên cứu được tiến hành tại phịng Sinh học phân tử, Trung tâm Kiểm chuẩn Chất lượng Xét nghiệm Y khoa - Trường Đại học Y Hà Nội, từ tháng 08/2017 đến tháng 9/2018. 2.2. Phương pháp phân tích * Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số Các mẫu DNA được tách chiết từ mơ đúc paraffin theo phương pháp tách cột QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất. Nồng độ và độ tinh sạch DNA được kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280). * Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để khuếch đại exon 3 và exon 9 của gen CDH1 với 2 cặp mồi tự thiết kế. Bảng 1. Trình tự mồi khuếch đại exon 3, 9 của gen CDH1 Exon Mồi Trình tự Kích thước (bp) 3 Mồi xuơi 5’-CGCTCTTTGGAGAAGGAATG-3’ 370 Mồi ngược 5’-GTACCAAGGCTGAGAAACCTG-3’ 9 Mồi xuơi 5’-AATCCTTTAGCCCCCTGAGA-3’ 320 Mồi ngược 5’-AGGGGACAAGGGTATGAACA-3’ - Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25 μl) gồm: Gotaq G2 Hotstar Master mix 12,5 μl; mồi xuơi 0,5 μl; mồi ngược 0,5 μl; DNA 1,0 μl; nước khơng cĩ nuclease 10,5 μl. - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với exon 3 và 9: 95oC/5 phút, 40 chu kỳ [95oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/30 giây], 75oC/5 phút. Bảo quản mẫu ở 4oC. * Kỹ thuật giải trình tự gen - Giải trình tự trên máy ABI sequencer 3100. - So sánh kết quả với GeneBank để phát hiện đột biến. 3. Đạo đức nghiên cứu Các đối tượng tham gia hồn tồn tự nguyện và cĩ quyền rút khỏi nghiên cứu khi khơng muốn tham gia nghiên cứu. Các thơng tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật. Nghiên cứu này đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y Sinh học cấp cơ sở của Trường Đại học Y Hà Nội thơng qua, giấy chứng nhận số 198/HĐĐĐĐHYHN cấp ngày 21 tháng 09 năm 2016. TCNCYH 117 (1) - 2019 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III. KẾT QUẢ 1. Đặc điểm nhĩm nghiên cứu Bảng 2. Đặc điểm chung của nhĩm nghiên cứu Đặc điểm n % Giới Nam 25 50 Nữ 25 50 Tuổi trung bình 51,42 ± 15,23 Khoảng tuổi 23 - 80 Trong số 50 bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa, tỷ lệ nam chiếm 50%, tuổi trung bình là 51,42 ± 15,23 (khoảng tuổi từ 23 đến 80). 2. Kết quả phân tích gen * Kết quả tách chiết DNA từ mơ Tất cả các mẫu DNA đều cĩ độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. DNA thu được sau tách chiết đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho các phản ứng tiếp theo. * Kết quả khuếch đại exon 3 và exon 9 của gen CDH1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 3 và exon 9 gen CDH1 để khuếch đại DNA sau tách chiết từ mẫu mơ của bệnh nhân. Hình 1 là hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 9 của gen CDH1. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 9, gen CDH1 (+) mẫu đối chứng; (1 - 15) mẫu bệnh nhân; (M) Marker 100 bp Kết quả hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR thu được chỉ cĩ 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 320 bp, khơng cĩ sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo để phát hiện đột biến. (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 320 bp 18 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC * Kết quả xác định đột biến gen Bảng 3. Kết quả xác định đột biến gen CDH1 Bệnh nhân Tuổi Giới Exon Nucleotide thay đổi Protein thay đổi n % S17 80 nữ 9 1298T > A Valin → Aspartate 1 2 S21 59 nam 9 1298T > A Valin → Aspartate 1 2 Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để phát hiện đột biến. Kết quả giải trình tự cho thấy khơng cĩ bệnh nhân nào cĩ đột biến trên exon 3, cĩ 2 bệnh nhân cĩ cùng đột biến trên thay thế 1298T > A trên exon 9 (thay thế acid amin Valin bằng Aspartate), chiếm tỷ lệ 4%. Người bình thường Bệnh nhân S17 Bệnh nhân S25 Hình 2. Hình ảnh giải trình tự exon 9 gen CDH1 của bệnh nhân S17, S25 Kết quả giải trình tự cho thấy 2 bệnh nhân S17 và S25 cĩ đột biến thay thế g.1298T > A, đột biến này chưa được cơng bố trước đây. TCNCYH 117 (1) - 2019 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV. BÀN LUẬN Chúng tơi đã lựa chọn 50 bệnh nhân được chẩn đốn là ung thư dạ dày lan tỏa theo phân loại của Lauren 1956. Tuổi trung bình của nhĩm nghiên cứu là 51,42 tuổi, độ tuổi dao động lớn từ 23 đến 80 tuổi. Tác giả Choi năm 2018 nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa cĩ tuổi trung bình là 52,55 tuổi [8]. Như vậy nhĩm bệnh nhân nghiên cứu của chúng tơi cĩ độ tuổi tương tự nghiên cứu của các tác giả Choi. Trong nghiên cứu của chúng tơi, tỷ lệ nam và nữ đều là 50%. Nhĩm nghiên cứu của tác giả Choi (2018) gồm 23 bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa cĩ tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 60,87% [8]. Theo tác giả Lee JY (2017) thấy tỷ lệ nữ trong nhĩm nghiên cứu là 48,1% [4]. Tuy vậy, trong nghiên cứu của Đỗ Đình Cơng và cộng sự (2011) thì bệnh nhân nữ chiếm đa số (63%) [18]. Như vậy nhĩm nghiên cứu của chúng tơi cĩ tỷ lệ nam:nữ tương tự với nghiên cứu của tác giả Lee JY. Đến nay cĩ khoảng hơn 100 loại đột biến gen CDH1 đã được phát hiện trên tồn thế giới [7; 16]. Tỷ lệ các loại đột biến: chèn hoặc xĩa đoạn nhỏ 35%, thay thế 28%, vơ nghĩa 16%, xĩa đoạn lớn 5% [10]. Nhiều tài liệu cơng bố cho thấy đột biến trên gen CDH1 khơng cĩ vùng hotspot, đột biến xảy ra trên dọc chiều dài của gen CDH1 [16]. Một số tác giả thấy rằng vùng exon 7 đến exon 10 cĩ tỷ lệ đột biến xảy ra cao hơn những vùng khác [6; 10; 12]. Nghiên cứu trên quần thể người Đức thấy rằng tỷ lệ đột biến exon 10 cao nhất 5,97%, exon 9 là 4,5%, tiếp theo là các exon 3, 5, 7; các loại đột biến hay gặp là thay thế, dịch khung, xĩa trong khung [9]. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy tần số đột biến soma gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa cĩ tỷ lệ từ 3% đến trên 50% [10; 12]. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tơi lựa chọn xác định đột biến trên exon 3 và exon 9 của gen CDH1. Kết quả trong 50 bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa cĩ 2 bệnh nhân cĩ đột biến ở exon 9. Hai bệnh nhân cĩ đột biến ở exon 9 đều là đột biến thay thế Thyamin bởi Adenin, đều là thể dị hợp tử, kết quả làm thay thế acid amin Valin thành Aspartate trên phân tử pro- tein, thuộc loại đột biến sai nghĩa nhưng khơng thay đổi kích thước phân tử protein. Đột biến trong nghiên cứu của chúng tơi chưa được cơng bố và sự liên quan đến ung thư dạ dày lan tỏa chưa rõ. Tuy nhiên, exon 9 được cho là chứa các miền được bảo tồn cao, cần thiết cho chức năng liên kết canxi và chất kết dính của E-cadherin; ngồi ra, cĩ nhiều bằng chứng cho rằng đột biến sai nghĩa ảnh hưởng đến hình thái và sự vận động của tế bào, sự sắp xếp lại khung xương tế bào, từ đĩ ảnh hưởng đến sự phát triển và di căn của tế bào ung thư [15]. Loại đột biến thay thế T > A trên exon 10 được Becker báo cáo trên tạp chí Cancer Reseach năm 1994, kết quả làm thay thế acid amin Valin thành Aspartic, acid amin này nằm cạnh vị trí gắn kết với canxi. Becker cũng báo cáo dạng đột biến thay thế T > A ở exon 4 trên tạp chí Human Genetics năm 1995 làm thay thế acid amin arginin bằng serin [5; 6]. Tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu của chúng tơi là 4%. Một số nghiên cứu thấy rằng tỷ lệ đột biến soma gen CDH1 thấp như: tác giả Corso (2013) xác định đột biến từ exon 7 đến exon 10 là 4,5%; nghiên cứu của Kim (2013) trên 30 khối u dạ dày lan tỏa tìm đột biến trên 16 exon thì tỷ lệ đột biến là 3,33%; nghiên cứu của Chen năm 2015 xác định đột biến trên 16 exon từ 152 khối u dạ dày lan tỏa thì tỷ lệ đột biến là 7,1% [12; 14; 17]. Như vậy tỉ lệ đột 20 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến của chúng tơi tương tự với các nghiên cứu của Corso, Kim, và Chen. Tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu này thấp hơn nhiều báo cáo của các tác giả trên thế giới như: Liu (2006) là 23,2%; Lee (2014) là 35,7%; Choi (2018) là 23% [11; 13; 8]. Cĩ sự khác biệt như trên là do cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tơi, chỉ xác định đột biến xảy ra trên 2 trong số 16 exon, sử dụng phương pháp nghiên cứu khác nhau và cĩ thể là do nghiên cứu được tiến hành trên nhiều quốc gia khác nhau. Vì vậy, chúng tơi cần cĩ những nghiên cứu sâu hơn, cỡ mẫu lớn hơn, chứng minh ý nghĩa của đột biến sai nghĩa này trên invitro kết hợp với nhuộm hĩa mơ miễn dịch để xác định sự cĩ mặt của pro- tein E-Cadherin. V. KẾT LUẬN Đã phát hiện được 2/50 bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa cĩ đột biến trên exon 9, là đột biến thay thế 1298T > A, kết quả làm thay thế acid amin Valin bằng Aspartate, chiếm tỷ lệ 4%. Đột biến này chưa được báo cáo trước đây. Khơng cĩ bênh nhân nào cĩ đột biến trên exon 3 gen CDH1. Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và cơng nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-YS.02- 2015.37 và sự giúp đỡ của các cán bộ Trung tâm Kiểm chuẩn Chất lượng Xét nghiệm, Trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Organization, W.H (2015). Cancer. Fact Sheet No 297. 2. Cancer.net, < cancer-types/hereditary-diffuse-gastric-cancer >, truy cập lần cuối 27/08/2017. 3. Globocan (2012). Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. 4. Lee JY (2017). The Characteristics and Prognosis of Diffuse-Type Early Gastric Can- cer Diagnosed during Health Check-Ups. Gut Liver, 11(6), 807 - 812. 5. Becker KF, Atkinson MJ, Reich U, Becker I et al (1994). E-cadherin gene muta- tions provide clues to diffuse type gastric car- cinomas. Cancer Res, 54, 3845 - 3852. 6. Becker KF, Reich U, Schott C, Hưfler H (1995). Single nucleotide polymorphisms in the human E-cadherin gene. Hum Genet, 96, 739 - 740. 7. Pardeep Kaurah (2002). Last Update: March 22, 2018). Hereditary Diffuse Gastric Cancer. Genereviews, NCBI, truy cập lần cuối 15 tháng 8 năm 2018. 8. Ji-Hye Choi (2018). Identification of ge- nomic aberrations associated with lymph node metastasis in diffuse-type gastric cancer. Ex- perimental & Molecular Medicine, 50, 6. 9. Geert Berx (1998). Mutations of the Hu- man E-Cadherin (CDH1 ) Gen. Human muta- tion, 12, 226 - 223. 10. Carla Oliveira (2009). Qualification of epigenetic and genetic 2nd hits in CDH1 dur- ing Hereditary Diffuse Gastric Cancer syn- drome progression. Gastroenterology, 136, 2137 - 2148. 11. Yao-Chi Liu (2006). Mechanisms inac- tivating the gene for E-cadherin in sporadic gastric carcinomas. World J Gastroenterology, 12(14), 2168 - 2173. 12. Giovanni Corso (2013). Somatic Mu- tations and Deletions of the E-Cadherin Gene Predict Poor Survival of Patients With Gastric Cancer. Journal of Clinical Oncology, 31(7). 13. Yeon-Su Lee (2014). Genomic profile analysis of diffuse-type gastric cancer. Ge- nome Biology, 15, R55. TCNCYH 117 (1) - 2019 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 14. Jeong Goo Kim (2013). Comprehen- sive DNA methylation and extensive mutation analyses reveal an association between the CpG island methylator phenotype and onco- genic mutations in cancers. Cancer letters, 330, 30 - 40. 15. Suriano G (2003). E-cadherin germline missense mutations and cell phenotype: evi- dence for the independence of cell invasion on the motile capabilities of the cells. Hum Mol Genet, 15; 12(22), 3007 - 3016. 16. Camargo MC (2012). Sex hormones, hormonal interventions and gastric cancer risk: a meta-analysis. Cancer Epidemiol Biomark Prev, 21(1), 20 - 38. 17. Kexin Chen (2015). Mutational land- scape of gastric adenocarcinoma in Chinese: Implications for prognosis and therapy. Pnas, 112(4), 1107 – 1112. 18. Cong,D D, Long, V D (2011). Kết quả điều trị carcinom dạ dày tế bào nhẫn. Y học thành phố Hồ chí Minh, 15(1). Summary DETERMINATION OF GENETIC MUTATE EXON 3, 9 OF CDH1 GENE IN PATIENTS WITH DIFFUSE GASTRIC CANCER Gastric cancer is one of five most common types of cancer worldwide. According to the Lauren classification, diffuse gastric cancer accounted for about 20% of all three types of gastric cancer. It is characterized by poor differentiation with highly invasive and metastatic probability. The CDH1 gene encodes for the E-cadherin protein and plays an important role in cell-cell adhesion and maintenance of epithelial integrity. Because of these important functions, a CDH1 gene muta- tion increases the risk of gastric cancer. CDH1 somatic gene mutations have been shown to be one of two molecular mechanisms responsible for diffuse gastric cancer. We performed genetic sequencing on exon 3 and 9 of the CDH1 gene of 50 patients with a mean age of 42 - 51 years old diagnosed with diffuse gastric cancer and treated at 108 Military Hospital and K Hospital (Tan Trieu branch) from January 2016 to December 2017. The results show that 2 of 50 patients with diffuse gastric cancer (4%) had a substitution mutation in exon 9 site 1298 T > A, with amino acid Valine replaced by Aspartate. This mutation has not been published yet. We did not find patients with mutations in exon 3 on gene CDH1. Keywords: Diffuse gastric cancer, CDH1 gene