Xác định đột biến EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 104 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ Lê Kiều Minh*, Trần Văn Ngọc**, Russell Ronald Braeuer*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất sớm và có tỷ lệ cao trong ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN). Liệu pháp điều trị trúng đích mang lại nhiều hiệu quả tốt trong việc điều trị cho các bệnh nhân UTPKTBN. Xác định đột biến gen có ý nghĩa quan trọng giúp bác sĩ trong việc lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp để nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu này nhằm mô tả phổ đột biến của gen EGFR trên bệnh nhân Việt Nam, giúp tiên đoán đáp ứng lâm sàng với nhóm thuốc phân tử nhỏ TKIs. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 06/2015 đến tháng 12/2015, 64 bệnh nhân UTPKTBN được khảo sát đột biến gen EGFR. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng để khuếch đại vùng chứa các exon 18 – 21 của EGFR từ bệnh phẩm là mô vùi nến. Sau đó đột biến của EGFR được xác định bằng kỹ thuật pyrosequencing. Kết quả: 43/64 (67,2%) bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR, trong đó có 1 trường hợp đột biến G719S exon 18 (2.3%), 25 đột biến mất đoạn tại exon 19 (58,1%), 8 đột biến T790M exon 20 (18,6%), 13 đột biến L858R (30,2%) và 1 đột biến L861Q (2,3%) tại exon 21. Có 5 trường hợp tồn tại 2 đột biến. Kết luận: Bệnh nhân Việt Nam bị UTPKTBN có tần suất đột biến EGFR cao với tỷ lệ 67,2% (43/64). Kỹ thuật pyrosequencing là một kỹ thuật bổ trợ tốt trong việc xác định đột biến gen EGFR từ mẫu mô UTPKTBN. Từ khóa: Ung thư phổi tế bào không nhỏ; đột biến gen EGFR; liệu pháp điều trị trúng đích; pyrosequencing. ABSTRACT DETECTION OF EGFR MUTATIONS IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER Le Kieu Minh, Tran Van Ngoc, Russell Ronald Braeuer * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 1 - 2016: 104 - 111 Background: EGFR gene mutations occur in the early stage and have high frequency in non-small cell lung cancer (NSCLC). Targeted therapy has emerged to be an important strategy in the treatment of NSCLC. Detection of genetic mutation has great significance to help physicians choose the appropriate regimens to improve the effectiveness of treatment for patients. Objectives: This study was performed to determine the EGFR mutation rate in Vietnamese NSCLC patients, predicting clinical response to small-molecule tyrosine kinase inhibitors for the treatment of lung cancer. * Đại học Quốc tế - Đại học Quốc Gia TP.HCM ** Bộ môn Nội Tổng Quát, Khoa Y, Đại học Y Dược TP.HCM *** Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc tế - Đại học Quốc Gia TP.HCM Tác giả liên lạc: BS. Lê Kiều Minh ĐT: 01223992345 Email: minhle90@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Hô Hấp 105 Methods: From June to December 2015, 64 patients were detected for EGFR gene mutations. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the region containing exons 18-21 of EGFR from formalin-fixed, paraffin-embedded lung carcinoma tissues. Then EGFR mutations were analyzed by using pyrosequencing. Results: 43/64 (67.2%) patients with EGFR mutations, including 1 case with G719S mutations exon 18 (2.3%), 25 deletions in exon 19 (58.1%), 8 cases with T790M mutation in exon 20 (18.6%), 13 cases with L858R mutation (30.2%) and 1 with L861Q mutation (2.3%) in exon 21. There were 5 cases occurred 2 mutations. Conclusion: High EGFR mutation rate occurs Vietnamese NSCLC patients with 67,2% (43/64). Pyrosequencing is a good complementary technique in determining EGFR mutations in NSCLC patients. Keywords: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; Targeted therapy; Pyrosequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất ở cả nam và nữ giới trên thế giới trong đó có Việt Nam(16). Tỷ lệ sống của bệnh nhân ung thư phổi khá thấp, khoảng 15,7% ở Mỹ và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm trên thế giới (16, 19). Theo dự báo, con số này còn có xu hướng tăng trong những năm tiếp theo tạo nên mối đe dọa không nhỏ cho sức khỏe cộng đồng, tăng áp lực lên nền kinh tế do chi phí đắt đỏ để điều trị ung thư, cũng như ảnh hưởng đến năng suất lao động. Tại Mỹ, số bệnh nhân tử vong do ung thư phổi hằng năm là khoảng 160.000 người, và con số này tại Việt Nam là 8.100 người (5, 11). Ở Việt Nam, ung thư phổi là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất bên cạnh ung thư gan, dạ dày, đại trực tràng và vòm họng ở nam giới và ung thư cổ tử cung, vú, dạ dày, và đại trực tràng ở nữ giới (11). Ung thư phổi nguyên phát có xuất độ cao, đặc biệt ở nam giới với tỷ lệ 29,6 bệnh nhân/ 100.000 dân, và ở nữ giới là 7,2 bệnh nhân/ 100.000 dân(11). Khoảng 80 - 90% các trường hợp ung thư phổi là thể không tế bào nhỏ, còn lại là thể tế bào nhỏ (17). Hiện nay, ung thư phổi thường được chẩn đoán ở giai đoạn rất muộn vì căn bệnh này không cho thấy triệu chứng cụ thể, hầu hết các trường hợp khi phát hiện đều rơi vào giai đoạn tiến triển hoặc di căn. Nhiều nghiên cứu gần đây về di truyền học phân tử đã phát hiện ra sự tồn tại của gen kích hoạt ung thư trong các tế bào ung thư và đó cũng là mục tiêu của những nghiên cứu trong tương lai cũng như khuyến cáo điều trị phòng ngừa bệnh ung thư phổi. Một vài nghiên cứu cũng đã cho thấy việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong tầm soát, chẩn đoán và điều trị đã mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân ung thư. Những nghiên cứu về sự biến đổi gen làm thay đổi sự cân bằng của hoạt động sống tế bào cũng như làm cho các tế bào trở nên nhạy cảm hơn hoặc tăng khả năng kháng các tác nhân ngoại bào là cơ sở khoa học để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Mặc dù có nhiều nghiên cứu chuyên sâu đã được thực hiện nhưng tiên lượng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) vẫn còn nhiều hạn chế, trong đó đặc biệt là các bệnh nhân có di căn xa. Tuy nhiên, liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ), chẳng hạn như chất ức chế hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR – epidermal growth factor receptor) gồm gefitinib và erlotinib, đã có những hiệu quả nổi bật đối với bệnh nhân UTPKTBN và được xác định có đột biến EGFR. Các đột biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN thường thấy có liên quan với đột biến ở bốn exon 18, 19, 20, 21 mã hóa vùng tyrosine kinase, và nhiều nghiên cứu đã cho Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 106 thấy những bệnh nhân này thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích (15). Việc xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN cung cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ lâm sàng để chỉ định LPĐTTĐ. Hiện nay có nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát hiện đột biến gen EGFR và độ nhạy của mỗi kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tế bào ung thư trong mẫu mô. Giải trình tự DNA là một trong những kỹ thuật đang được sử dụng phổ biến tại Việt Nam. Tuy nhiên, kỹ thuật giải trình tự DNA đòi hỏi phải có ít nhất 25% số tế bào ung thư trong mẫu ly trích DNA thì mới có thể phát hiện được đột biến(21,22). Kỹ thuật chẩn đoán đột biến gen bằng pyrosequencing cũng cho phép đọc tất cả các kiểu đột biến trong vùng khảo sát và có độ nhạy cao hơn kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Phương pháp này được phát triển đầu tiên tại Thụy Điển và có thể phát hiện các đột biến trong các mẫu có chứa ≤ 10% số tế bào ung thư trong mẫu ly trích, phù hợp cho việc phân tích các đoạn DNA ngắn hơn so với kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(1). Với mục đích áp dụng kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR để định hướng điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam, đề tài nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu mô tả phổ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân UTPKTBN bằng kỹ thuật pyrosequencing giúp tiên đoán đáp ứng lâm sàng với nhóm thuốc phân tử nhỏ TKIs. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 64 mẫu mô sinh thiết của bệnh nhân UTPKTBN được thu thập tại Bệnh viện 115, Bệnh viện Thống Nhất, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện quốc tế City. Các mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ khối u qua phương pháp phẫu thuật, sinh thiết phế quản (nội soi phế quản ống mềm, sinh thiết mù xuyên phế quản, sinh thiết xuyên phế quản dưới hướng dẫn màu huỳnh quang) hoặc sinh thiết phổi từ ngoài. Mẫu bệnh phẩm được tiến hành xét nghiệm chẩn đoán giải phẫu bệnh qua mô bệnh học hoặc xét nghiệm hóa mô miễn dịch. Các mẫu mô ung thư phổi được đúc trong paraffin (sáp nến) và được tìm đột biến gen EGFR tại Phòng xét nghiệm Nam Khoa-Biotek, Thành phố Hồ Chí Minh. Phương pháp nghiên cứu - Kỹ thuật tách chiết DNA Mẫu mô vùng tế bào ung thư được đúc thành mô vùi nến dùng để chẩn đoán giải phẫu bệnh. Xylene (Merck, Đức) được sử dụng để khử nến, sau đó được rửa lại bằng ethanol tuyệt đối và để khô trước khi ủ với proteinase K (Qiagen, Đức) trong dung dịch đệm ở 56oC trong 1 giờ và 90oC trong 1 giờ kế tiếp. DNA sau khi tách chiết được tinh sạch sử dụng bộ QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Đức). DNA được kết tủa bằng ethanol tuyệt đối trong dung dịch đệm AL (Qiagen, Đức). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được xác định bằng máy Nano-Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 260/OD280 ≥ 1.7 được sử dụng để phân tích. - Kỹ thuật PCR khuếch đại các exon 18, 19, 20 và exon 21 trên gen EGFR Các đoạn mồi đặc hiệu khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 trên gene EGFR được thiết kế bằng phần mềm Primer Premier 5 dựa trên trình tự chuẩn của EGFR có số accession NC_000007 GPC_000000031 trong GenBank (National center for biotechnology information, NCBI). Những mồi được chọn thỏa những yêu cầu sau: phải chứa các vị trí codon đột biến đang khảo sát: 719 ở exon 18, deletions ở exon 19, 768 và 790 ở exon 20, 858 và 861 ở exon 21 trên gene EGFR; khuếch đại sản phẩm có kích thước không vượt quá 250 bp; nhiệt độ bắt cặp 53oC; không tạo cấu trúc thứ cấp “hairpin”, “primerdimer” hay “crossdimer” bền vững với chính nó hay các mồi khác; và nhiệt độ mồi xuôi và mồi ngược không lệch nhau quá 4oC. Mồi đạt được các yêu cầu trên sẽ được kiểm tra tính đặc hiệu trên trang NCBI với công cụ Primer BLAST. Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, các thành phần gồm có PCR buffer, 3mM MgCl2, dNTP (250 μM cho mỗi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Hô Hấp 107 loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 μM cho mỗi loại), 1,25 unit HotStart Taq Polymerase (Qiagen, Đức) và 50 ng genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy ³Prime Thermal Cycler (Techne, Anh) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95oC trong 15 phút, theo sau bằng 42 chu kỳ gồm biến tính ở 95oC trong 20 giây, gắn mồi ở 53oC trong 30 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72oC trong 20 giây và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel. Kết quả đạt yêu cầu khi kết quả điện di tại mỗi exon cho 1 band DNA được khuếch đại dương, kích thước sản phẩm tại mỗi exon là: exon 18 (171 bp), exon 19 (163bp), exon 20 (291 bp) và exon 21 (97 bp). - Kỹ thuật pyrosequencing Phản ứng pyrosequencing được thực hiện trên máy PyroMark Q24 (Qiagen, Đức) sử dụng bộ kit therascreen EGFR Pyro (Qiagen, Đức). Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Giải trình tự bằng việc tổng hợp dựa trên nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide. Kết quả được phân tích bằng phần mềm PyroMark Q24 trên máy tính. Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0. KẾT QUẢ Đặc điểm lâm sàng - giải phẫu bệnh Trong thời gian từ tháng 06/2015 – 12/2015, chúng tôi đã tiến hành phân tích đột biến gen EGFR cho 64 trường hợp UTPKTBN, bao gồm 38 bệnh nhân nam và 26 nữ, tỷ lệ nam/nữ là 1,5/1. Tuổi trung bình của bệnh nhân là 63 tuổi (khoảng tuổi 38 - 85). Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm tuyến, với các giai đoạn xâm lấn và di căn. Tiền căn hút thuốc lá được ghi nhận đầy đủ trong hồ sơ bệnh án. Đột biến gen EGFR Bảng 1: Tỷ lệ các dạng đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN Dạng đột biến Số mẫu Tỷ lệ Tổng số mẫu Không đột biến EGFR 21 32.8% 64 Đột biến EGFR 43 67.2% G719S tại exon 18 1 2.3% 43 Deletions tại exon 19 25 58.1% T790M tại exon 20 8 18.6% L858R tại exon 21 13 30.2% L861Q tại exon 21 1 2.3% 2 đột biến trở lên 5 11.6% Bảng 2: Tương quan đột biến gen với đặc điểm lâm sàng - giải phẫu bệnh Số mẫu (n = 64) Đột biến EGFR (n = 43) Tỷ lệ % p Giới tính Nam 38 24 63,2% 0,41 Nữ 26 19 73,1% Độ tuổi ≤ 65 40 26 65% 0,73 > 65 24 17 70,8% Tiền căn hút thuốc Không hút thuốc a 22 18 81.8% 0,09 Đã từng hút thuốc b 17 12 70.5% Đang hút thuốc c 25 13 52% a Hút ít hơn 100 điếu thuốc đến thời điểm chẩn đoán. b Bỏ hút thuốc lá trên 1 năm trước khi chẩn đoán. c Còn hút thuốc hoặc bỏ hút thuốc lá dưới 1 năm trước khi chẩn đoán. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 108 Hình 1. Kết quả giải trình tự gen EGFR bằng pyrosequencing. (A) Hình ảnh đột biến xóa đoạn ELREA tại exon 19 (bệnh nhân MS39); (B) Hình ảnh đột biến L858R tại exon 21 (bệnh nhân MS41); (C) Hình ảnh đột biến T790M tại exon 20 (bệnh nhân MS33). Nhận xét: Bệnh nhân MS39 xuất hiện hiện tượng xóa đoạn 15 nucleotid trên exon 19 làm cho các acid amin acid glutamic (E) - leucine (L) – arginine (R) – glutamic (E) –alanine (A) tại các codon 746 đến 750 bị mất, do đó đột biến này có tên là đột biến ΔE746-A750 hay ELREA (Hình 1A). So sánh với trình tự DNA lành tính, tại vị trí nucleotid 2537 trên exon 21 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Hô Hấp 109 xuất hiện thêm một đỉnh T bị biến đổi thành G, làm cho acid amin Leucine (L) tại codon 858 biến đổi thành Arginine (R), gây nên đột biến L858R ở bệnh nhân MS41 (Hình 1B). Tại vị trí nucleotid 2369 trên exon 20 xuất hiện thêm một đỉnh C bị biến đổi thành T, làm cho acid amin Threonine (T) tại codon 790 bị biến đổi thành Methionine (M), gây nên đột biến T790M ở bệnh nhân MS33 (Hình 1C). BÀN LUẬN Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy khoảng 5% - 60% bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến EGFR xuất hiện trên 4 exon của gen, từ exons 18 đến 21 (12, 2, 23). Tỷ lệ đột biến EGFR dao động trong khoảng 5% - 15% ở người da trắng (2, 4) và khoảng 38% - 58% ở bệnh nhân Đông Á (8, 23). Trong nghiên cứu này, kỹ thuật pyrosequencing được sử dụng để khảo sát 4 exon này cho 64 bệnh nhân, phát hiện 43 trường hợp có đột biến EGFR (67,2%) (Bảng 1). Kết quả này tương đồng với ghi nhận của PIONEER năm 2012 về tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi carcinôm tuyến tại Việt Nam. Nghiên cứu PIONEER tiến hành trên 1450 mẫu ung thư phổi carcinôm tuyến tại 7 nước Châu Á: Việt Nam, Đài Loan, Thái Lan, Philippin, Trung Quốc, Hồng Kong, Ấn Độ bằng phương pháp Scorpion ARMS (Therascreen EGFR RGQ kit). Kết quả từ nghiên cứu cho thấy Việt Nam là nước có tỷ lệ đột biến EGFR cao nhất trong 7 nước với 64,2% (77/120 ca) vì tỷ lệ đột biến EGFR trung bình chỉ là 51,4% (746/1450 ca)(21). Tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN trong nghiên cứu này cũng được phát hiện cao hơn so với các ghi nhận của Hoàng Anh Vũ (2011) là 42% và Nguyễn Minh Hà (2013) là 35.71% (7, 13). Sở dĩ có sự khác biệt này là vì các tác giả đã dùng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA và kỹ thuật Scorpions- Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS) để xác định đột biến EGFR. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA chỉ phát hiện đột biến có tỷ lệ tế bào ung thư cao hơn 30% và kỹ thuật Scorpions ARMS tuy cho phép phát hiện đột biến gen trong các mô phân tích có tỷ lệ tế bào ung thư thấp hơn 30% nhưng vẫn có thể dẫn đến bỏ sót một số mẫu có đột biến ở tỷ lệ thấp (7, 13). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật pyrosequencing xác định đột biến EGFR. Với kỹ thuật này thì 5% tỷ lệ tế bào ung thư đã có thể phát hiện được, vì vậy các mẫu có tỷ lệ đột biến EGFR thấp cũng được xác định đột biến (14). Điều này có ý nghĩa đặc biệt đối với bệnh nhân UTPKTBN, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thể nhanh chóng được áp dụng một phác đồ điều trị hiệu quả. Chúng tôi không thấy có mối liên quan giữa đột biến EGFR với giới tính (p = 0,41), độ tuổi (p = 0,73) và tiền sử hút thuốc (p = 0,09) (Bảng 2). Theo nghiên cứu của Sun PL và cộng sự ghi nhận năm 2012 thì tỷ lệ đột biến ở nữ và nam lần lượt là 65.7% và 34.3%. Các tác giả cũng ghi nhận đột biến EGFR ở nhóm không hút thuốc cao hơn nhóm hút thuốc (lần lượt là 63,4% và 32%)(24). Mối liên quan giữa đột biến EGFR và tiền sử hút thuốc cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của tác giả Phạm Duy Khánh và cộng sự vào năm 2006. Nghiên cứu của tác giả Phạm Duy Khánh được thực hiện trên 265 bệnh nhân ung thư phổi tại Mỹ với tỷ lệ đột biến gen EGFR là 25%. Trong đó, đột biến EGFR được xác định ở người không hút thuốc là 51%, người từng hút thuốc là 19% và người đang hút thuốc là 4%(18). Tác giả Yoon Hee Choi và cộng sự cũng ghi nhận trong nghiên cứu chỉ có 39% bệnh nhân trẻ hơn 57 có đột biến EGFR, trong khi con số này ở bệnh nhân trên 65 tuổi 69%, vì vậy tuổi càng cao thì tỷ lệ đột biến gen EGFR cũng tăng theo(3). Trong những đột biến được phát hiện, đột biến mất đoạn ở exon 19 chiếm tỷ lệ cao nhất (25/43 trường hợp, 58,1%) (Bảng 1). Đây là đột biến xóa đoạn điển hình xảy ra tại chuỗi ELREA ở exon 19 của gen EGFR (Hình 1A). Kế đến là đột biến L858R trên exon 21 (13/43 trường hợp, 30,2%) (Bảng 1). Đây là đột biến thay thế một nucleotid xảy ra ở codon 858 thuộc exon 21 của gen EGFR (Hình 1B). Điều này cho thấy nhóm đột biến xóa đoạn ở exon 19 và đột biến L858R Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa I 110 trên exon 21 chiếm tỷ lệ lớn trong các loại đột biến gen EGFR trên nhóm bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam. Hai kiểu đột biến này được tác giả Hoàng Anh Vũ (2011) ghi nhận là cho đáp ứng tốt với gefitinib và elortinib và Hoàng Anh Vũ kết luận rằng chẩn đoán đột biến EGFR bằng giải trình tự chuỗi DNA có thể giúp ích cho việc lựa chọn bệnh nhân UTPKTBN trong chỉ định điều trị thuốc nhắm trúng đích phân tử(7). Bên cạnh đó, chúng tôi cũng xác định được trong nghiên cứu này có 8/43 bệnh nhân dương tính với đột biến T790M chiếm tỷ lệ 18,6% (Bảng 1). Đây là đột biến thay thế một nucleotid xảy ra ở codon 790 thuộc exon 20 (Hình 1C). Loại đột biến này được cho là kháng lại các thuốc TKIs thế hệ đầu (gefitinib và erlotinib)(25). Đột biến T790M làm giảm ái lực của thuốc TKIs thế hệ đầu với vùng kinase trên EGFR, từ đó đối kháng lại cơ chế ức chế kinase và giảm tính cạnh tranh của thuốc với ATP (25). Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc sử dụng các thuốc EGFR TKIs thế hệ thứ 3 (như AZD9291 hoặc CO1686) cho ra kết quả khá khả quan trong việc làm giảm tính kháng thuốc của đột biến T790M (10, 20). Thêm vào đó, sự phối hợp thuốc afatinib (một EGFR-TKI thế hệ 2) và cetuximab (kháng thể kháng EGFR) cũng cho thấy những tín hiệu tốt trong việc ức chế thể EGFR có đột biến T790M (6, 9). Tuy nhiên, phương pháp kiểm soát bệnh cụ thể cho các trường hợp kháng TKIs của bệnh nhân UTPKTBN có đột biến EGFR vẫn chưa được khuyến cáo chính thức vì chưa có kết quả đầy đủ và chuyên sâu từ các nghiên cứu lâm sàng đang tiến hành. Trong những đột biến được phát hiện, hai dạng đột biến G719S tại exon 18 và L861Q tại exon 21 chiếm tỷ lệ rất nhỏ 2,3% (1/43 ca cho mỗi loại) (Bảng 1). Tại vị trí nucleotid 2155 trên exon 21, G bị biến đổi thành A, làm cho acid amin Glycine (G) tại codon 718 biến đổi thành Serine (S), gây nên đột biến G719S. Ở đột biến L861Q, T bị biến đổi thành A tại vị trí nucleotid 2582 trên exon 21, làm cho acid amin Leucine (L) tại codon 861 biến đổi thành Glutamine (Q). Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận có 5 ca tồn tại 2 đột biến cùng lúc, bao gồm 1 ca chứa đột biến T790M - L858R, 1 ca chứa đột biến T790M - Deletions, 2 ca đột biến Deletions - L858R và 1 ca đột biến Deletions - T790M (Bảng 1). KẾT LUẬN Đột biến EGFR được phát hiện với tỷ lệ cao (67,2%) trên bệnh nhân Việt Nam bị UTPKTBN. Trong những đột biến được phát hiện, đột biến mất đoạn ở exon 19 chiếm tỷ lệ cao nhất với 58,1% (25/43 ca), đột biến L858R trên exon 21 với 30,2% (13/43 ca), đột biến T790M tại exon 20 chiếm tỷ lệ 18,6% (8/43 ca), đột biến G719S tại exon 18 và L861Q tại exon 21 chiếm tỷ lệ rất nhỏ 2,3% (1/43 ca cho mỗi loại) và có 5 trường hợp tồn tại 2 đột biến cùng lúc. Kết quả nghiên cứu cho thấy pyrosequencing là một kỹ thuật bổ trợ tốt trong việc xác định đột biến gen EGFR từ mẫu mô UTPKTBN giúp phát hiện được các đột biến có tỷ lệ tế bào ung thư thấp và cần được phát triển ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmadian A, Ehn M and Hober S (2006). Pyrosequencing: history, biochemistry and future. Clinica Chimica Acta. 363(1- 2):83-94. 2. Boch C, Kollmeier J, Roth A et al (2013). The frequency of EGFR and KRAS mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC): routine screening data for central Europe from a cohort study. BMJ Open. 3:e002560. 3. Choi YH et al (2010). Association between age at diagnosis and the presence of EGFR mutations in female patients with resected non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 5(12):1949- 1952. 4. Ebert W, Dienemann H, Fatech-Moghadam A et al (1994). Cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 compared with carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma antigen and neuro specific enolase in lung cancer. Results of an international multicenter study. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 32(3):189-99. 5. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM (2010). Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer. 127(12):2893-917. 6. Gomes JR, Cruz MR (2015). Combination of afatinib with cetuximab in patients with EGFR-mutant non-small-cell lung cancer resistant to EGFR inhibitors. Onco Targets Ther. 8: 1137– 1142 7. Hoàng Anh Vũ, et al. (2011). Đột biến gen EGFR và KRAS trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Y học TP. Hồ Chí Minh Chuyên đề Điều dưỡng Kỹ thuật Y học, PB Tập 17(4):165-171. 8. Huang SF, Liu HP, Li LH et al (2004). High frequency of epidermal growth factor receptor mutations with complex Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Hô Hấp 111 patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan. Clin Cancer Res. 10(24):8195-203. 9. Janjigian YY, Smit EF, Groen HJ (2014). Dual inhibition of EGFR with afatinib and cetuximab in kinase inhibitor- resistant EGFR-mutant lung cancer with and without T790M mutations. Cancer Discov. 4(9):1036-45. 10. Janne PA, Yang JC, Kim DW et al. (2015). AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372(18):1689-99. 11. McDonald M, Hertz RP, Lowenthal SWP (2008). The burden of cancer in Asia. Pfixer Inc. 12. Mok TS, Wu YL, Thongprasert S et al (2009). Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Eng J Med. 361(10), 947-958. 13. Nguyễn Minh Hà (2013). Xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 17, Số 1, pp 34-37. 14. Ogino S, Kawasaki T, Brahmandam M, et al. (2005). Sensitive sequencing method for KRAS mutation detection by pyrosequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 7(3):413- 421 15. Pao W, Miller VA (2005). Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small- cell lung cancer: current knowledge and future directions. J Clin Oncol. 23(11),.2556-2568. 16. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2005). Global cancer statistic. CA Cancer J Clin. 55(2): 74-108. 17. Peto R, Doll R (1978). Cigarette smoking and bronchial carcinoma: dose and time relationships among regular smokers and lifelong non-smoker. J Epidemiol Community Health. 32(4):303-13. 18. Pham DK, Kris MG, Riely GJ et al (2006). Use of cigarette- smoking history to estimate the likelihood of mutations in epidermal growth factor receptor gene exons 19 and 21 in lung adenocarcinomas. J Clin Oncol. 24:1700-1704. 19. Reis LAG, Eisner M, Kosary C et al (2005). Cancer statistic review 1995-2002. National Cancer Institute, Bethesda, MD. 20. Sequist LV, Soria J, Gadgeel SM (2014). First-in-human evaluation of CO-1686, an irreversible, highly selective tyrosine kinase inhibitor of mutations of EGFR (activating and T790M). J Clin Oncol. 32:5s. 21. Shi Y, Au JS et al (2014). A Prospective, molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small cell lung cancer of adenocarcinoma histology (PIONEER). J. Thoracic Oncology. 9(2): 154–162. 22. Shigematsu H, Lin L, Takahashi T et al (2005). Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers. J. Natl Cancer Inst. 97(5):339-46. 23. Sriuranpong V, Chantranuwat C, Huapai N et al (2006). High frequency of mutation of epidermal growth factor receptor in lung adenocarcinoma in Thailand. Cancer Lett. 239(2):292-7. 24. Sun PL, Seol H, Lee HJ et al (2012). High incidence of EGFR mutations in Korean men smokers with no intratumoral heterogeneity of lung adenocarcinomas. Journal of Thoracic Oncology. 7(2):324-330. 25. Wu K, House L, Liu W, Cho WC (2012). Personalized targeted therapy for lung cancer. Int J Mol Sci. 13(9):11471–11496. Ngày nhận bài báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016