Xác định đa hình đơn nucleotide (SNP) của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 115 XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (SNP) CỦA GEN APC Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH Nguyễn Thị Băng Sương*,**, Nguyễn Hữu Huy**, Lê Minh Khôi *,**, Nguyễn Trung Tín*,**, Nguyễn Hoàng Bắc*,** TÓM TẮT Mở đầu: Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đặc trưng bởi sự hiện diện rất nhiều polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp. Theo Sheng và cộng sự, 100% bệnh nhân FAP không được điều trị sẽ dẫn đến ung thư đại tràng ở tuổi 35-40. Nguyên nhân gây nên FAP được xác định là do đột biến gen APC. Các đa hình ở gen APC nhạy cảm với ung thu. Tuy nhiên mối liên hệ giữa các đa hình gen APC và nguy cơ ung thư đại trực tràng vẫn chưa được biết rõ. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự xác định các SNP ở gen APC trên bệnh nhân FAP. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 63 bệnh nhân có triệu chứng đa polyp tham gia nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự để phát hiện SNP ở gen APC. Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC. Trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi acid amin nên các SNP này không làm thay đổi kiểu hình. Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Trong số đó, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) có nguy cơ cao gây ung thư đại trực tràng Kết luận: Chúng tôi phát hiện 3 SNP làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Vai trò của các SNP này cần được làm rõ qua các nghiên cứu tiếp theo Từ khoá: FAP, gen APC, SNP, giải trình tự ABSTRACT MOLECULAR DIAGNOSIS OF FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS (FAP) Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Nguyen Hoang Bac * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 21 - No 3 - 2017: 115 - 119 Background: Familial adenomatous polyposis-FAP is an inherited disorder characterized by the presence lot of adenomatous polyps in the colon, usually over 100 polyps. According to Sheng et al, 100% of patients with untreated FAP will lead to colon cancer at the age of 35-40. FAP is caused by germline mutations in APC genes. Adenomatous polyposis coli (APC) gene polymorphisms are believed to contribute to tumor susceptibility. However, the association between single-nucleotide polymorphisms (SNP) in the APC gene and colorectal cancer (CRC) susceptibility remains unknown Objective: Applying sequencing methods to detect SNPs of APC gene in FAP patients. Materials and Methods: 63 polyposis patients were recruited in the research. We use the sequencing method to detect SNPs in APC genes. Results: In this study, we found 10 SNPs in the APC gene. 7 of 10 SNPs do not change the amino acid * Đại học Y Dược TP.HCM, ** Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT:0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 116 sequence of a protein so there is no significant change in phenotype. However, there are 3 SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Among them, SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) is associated with a high risk of colorectal cancer. Conclusion: We detected three SNPs that change amino acid: SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) and SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Their role should be clarified through further research. Key words: FAP, APC gene, SNP, sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary familial adenomatous polyposis: FAP) là một bệnh rối loạn di truyền trội(6). Đa polyp tuyến gia đình được đặc trưng bởi sự phát sinh hàng trăm đến hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, hầu hết là ở tuổi vị thành niên(6,7). Triệu chứng đầu tiên của FAP là tiêu chảy và có máu trong phân(6). Bệnh xảy ra với tần suất là 1/8300 trẻ sinh ra và sống(2) và có nguy cơ cao dẫn đến ung thư đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa trước 40 tuổi nếu không được điều trị sớm(1). Bệnh có liên quan mật thiết đến những đột biến dòng mầm của gen ức chế khối u APC (tumor - supressor adenomatous polyposis coligen: APC) nằm tại vị trí 5q21-q22(4,6). Gen APC là một gen ức chế khối u cổ điển dài 14000 nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa ra phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin. Các nghiên cứu trên thế giới đã tìm thấy khoảng 300 đột biến khác nhau trên gen APC gây bệnh FAP(2). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã xác định tầm quan trọng của các đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms – SNP) bên cạnh đột biến ở các gen liên quan đến ung thư đại trực tràng. Một số SNP đóng vai trò trong sự phát triển của ung thư đại trực tràng do tác động của nó đến chức năng các gen điều hòa hoạt động của tế bào. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen APC ở bệnh nhân FAP vẫn còn rất hạn chế. Năm 2012 tác giả Nguyễn Phương Anh đã phân tích gen APC cho một số gia đình bệnh nhân FAP và đã phát hiện các đột biến gây bệnh ở exon 15 của gen APC tuy nhiên các SNP ở gen APC vẫn chưa được báo cáo(3,2). Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: “Xác định đa hình đơn nucleotide (SNP) gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình” ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đây là bệnh hiếm gặp, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/10.000-1/6000, trong thời gian 2 năm nghiên cứu, chúng tôi thực hiện nghiên cứu trên 63 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp gia đình. Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong ống chống đông bằng EDTA nắp xanh dương và được ly trích trong vòng 24 giờ. Sử dụng bộ kit QiAamp DNA blood mini kit của hãng Qiagen – Đức để ly trích DNA. Sản phẩm ly trích được tiến hành kiểm tra độ nguyên vẹn của mạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose 3%, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000. Chỉ những mẫu tách chiết đạt độ tinh sạch với tỷ số A260/A280 trong khoảng 1,8-2,0 mới tiếp tục được sử dụng cho các thí nghiệm sau. Kỹ thuật khuếch đại các exon của gen APC Dùng phương pháp PCR khuếch đại 15 đoạn exon của gen APC bằng máy Gene Amp PCR System 9700 (USA). Thành phần của phản ứng PCR gồm 20 μl chứa các thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1-0,2 μmol/L primer và 1-1,5 đơn vị Taq polymerase. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 117 Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 94°C trong 5 phút, tiếp theo là 35-40 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C trong 30 giây; gắn mồi ở 60°C trong 30 giây và bước kéo dài 72°C trong 30 giây, cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 4°C. Kết quả PCR sau đó được kiểm chứng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%. Kỹ thuật giải trình tự gen Thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye version 3.1 của công ty Applied Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược, giải trình tự DNA bằng máy sequencer ABI 3500. Phân tích kết quả giải trình tự Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5 và so sánh với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham chiếu trên NCBI là NG_008481.4. Xử lý thống kê Số liệu thống kê được phân tích và xử lý bằng phần mềm SPSS 19.0. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Đặc điểm nhóm nghiên cứu Bảng 1. Phân bố theo giới và tuổi của bệnh nhân Nhóm tuổi Nam Nữ Chung hai giới n Tỷ lệ % n Tỷ lệ % n Tỷ lệ % Dưới 30 7 11,1 4 6,3 11 17,4 Từ 30 - 60 25 39,7 19 30,1 44 69,8 Trên 60 8 12,7 0 0 8 12,7 Tổng số 40 63,5 23 36,5 63 100 Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu thì nhóm các bệnh nhân từ 30 đến 60 tuổi chiếm đa số (69,8%), độ tuổi trung bình của bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu là 43,9. Tỷ lệ bệnh nhân nam tham gia nghiên cứu là 63,5% và nữ chiếm 36,5%. Kết quả thống kê các SNP trên gen APC Bảng 2. Thống kê các SNP trên gen APC STT Exon chứa đột biến Nucleotide bị thay đổi Acid amin bị thay đổi Mã SNP Số lượng kiểu gen Dị hợp Đồng hợp 1 3 c.317G>A p.Arg106His rs201764637 1 0 2 11 c.1458 T>C p.Tyr486Tyr rs2229992 20 9 3 13 c.1635 G>A p.Ala545Ala rs351771 13 5 4 15 c.4479 G>A p.Thr1493Thr rs41115 25 13 5 15 c.5034 G>A p.Gly1678Gly rs42427 14 8 6 15 c.5268 T>G p.Ser1756Ser rs866006 24 11 7 15 c.5465 T>A p.Val1822Asp rs459552 17 8 8 15 c.5880 G>A p.Pro1960Pro rs465899 16 7 9 15 c.6063 C>T p.Phe2021Phe rs786203342 22 10 10 15 c.6691 A>T p.Ile2231Phe rs534228737 1 0 Nhận xét: Chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC, trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi acid amin, các SNP này không có ý nghĩa về mặt lâm sàng vì không ảnh hưởng đến cấu trúc protein. Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Kiểm tra trên cơ sở dữ liệu 1000genomes ( khi giải trình tự 99 người dân tộc Kinh ở Việt Nam thì không phát hiện hai SNP rs201764637 (p.Arg106His) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe) còn SNP rs459552 (p.Val1822Asp) thì có 13 người dị hợp và 2 người đồng hợp. Điều này cho thấy SNP rs459552 (p.Val1822Asp) phổ biến trong quần Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 118 thể người Việt Nam nên không phải là SNP gây bệnh. Tuy nhiên theo nghiên cứu Guerreiro vào năm 2017 cho thấy SNP rs459552 (p.Val1822Asp) có liên quan đến khẩu phần ăn và nguy cơ ung thư trực tràng cụ thể những người có mang allen đột biến sẽ có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cao hơn nếu ăn khẩu phần ăn nhiều cholesterol, ít chất xơ và canxi so với người có kiểu gen bình thường có khẩu phần ăn tương tự(3). Điều này cho thấy các SNP có tương tác nhất định đối với nguy cơ ung thư đại trực tràng. Khi tiếp tục hồi cứu kết quả giải trình tự 2503 người trên toàn thế giới thì thống kê của 1000genomes cho thấy chỉ có 2 trường hợp dị hợp tử tương ứng với SNP rs201764637 (p.Arg106His) và 2 trường hợp dị hợp tử đối với SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Điều này chứng tỏ 2 SNP này có tỉ lệ rất thấp. Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP rs201764637 (p.Arg106His) đã được Johnston báo cáo từ năm 2012(3) và không có ý nghĩa rõ ràng về mặt lâm sàng. Theo tiêu chuẩn phân loại Counsyl (2015) thì SNP rs201764637 được xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng (variant of uncertain significance - VUS) do chỉ mới có 2 báo cáo về SNP này trên thế giới nên chưa đủ dữ liệu để đánh giá ảnh hưởng của SNP lên kiểu hình bệnh. Theo cơ sở dữ liệu ClinVar thì SNP rs534228737 cũng được xếp loại biến thể chưa có ý nghĩa rõ ràng. Tuy nhiên biến thể này cũng không được tìm thấy khi giải trình tự 6500 người Mỹ gốc châu Âu và châu Phi trong dự án NHLBI Exome Sequencing Project cho thấy SNP này không phải là một biến thể lành tính thông thường trong những quần thể này. Dựa trên thông tin hiện có, chưa thể kết luận SNP rs534228737 là một đột biến gây bệnh hoặc một biến thể lành tính. Tuy nhiên đây là SNP thay đổi acid amin p.Ile2231Phe nằm trong vùng cơ bản của protein APC, là vùng có chức năng ổn định và kích thích sự trùng hợp vi ống tham gia trong quá trình phân chia tế bào. Cấu trúc của vùng này có tính bảo tồn rất cao. Hình 1. Phân tích Polyphen-2 SNP rs534228737 Phân tích SNP c.6691A>T bằng phần mềm Polyphen-2 chúng tôi thu được số điểm nguy cơ của SNP là 0.997, đây là một số điểm rất cao, chứng tỏ SNP này có thể gây bệnh ở bệnh nhân. Do vậy chúng ta cần theo dõi diễn tiến lâm sàng ở bệnh nhân cũng như theo dõi báo cáo cập nhật của các tác giả khác nhau trên thế giới về SNP này. KẾT LUẬN Bằng phương pháp giải trình tự, chúng tôi đã tìm thấy 10 SNP ở gen APC, trong đó 7/10 SNP không làm thay đổi acid amin, các SNP này không có ý nghĩa về mặt lâm sàng vì không ảnh hưởng đến cấu trúc protein. Tuy nhiên, có 3 SNP có ảnh hưởng làm thay đổi acid amin đó là SNP Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 119 rs201764637 (p.Arg106His), SNP rs459552 (p.Val1822Asp) và SNP rs534228737 (p.Ile2231Phe). Vai trò của các SNP này cần được làm rõ qua các nghiên cứu tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Guerreiro CS et al. (2007), "The D1822V APC polymorphism interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the risk of colorectal cancer in Portuguese persons", The American journal of clinical nutrition, 85(6), pp. 1592-1597. 5 2. Half E, Bercovich D, and Rozen P (2009), "Familial adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis, 4(22Jian-Qiu Sheng, et al. (2010), "APC gene mutations in Chinese familial adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol, 16(12), pp. 1522–1526. 2 3. Johnston JJ et al. (2012), "Secondary variants in individuals undergoing exome sequencing: screening of 572 individuals identifies high-penetrance mutations in cancer-susceptibility genes", The American Journal of Human Genetics, 91(1), pp. 97-108. 4 4. Leppert M, et al. (1987), "The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5", Science, 238(4832), pp. 1411-3. 7 5. Nguyễn Phương Anh, Nguyễn Nghiêm Luật, and Trần Văn Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC ở bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội. 3 6. Plawski A and Slomski R (2009), "APC gene mutations causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J Appl Genet, 49(4), pp. 407–414. 1 7. Poovorawan K, et al. (2012), "Colon Cancer Prevention by Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev, 13(10), pp. 5101-5104. 6 Ngày nhận bài báo: 29/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2016 Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017