Vật liệu và phương pháp nghiên cứu bưởi Năm Roi

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Bưởi Năm Roi Hình 3.1: Bưởi Năm Roi Chủng vi sinh vật Chủng nấm men sử dụng để nghiên cứu là Saccharomyces cerevisae F28 nhận từ phòng thí nghiệm trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM. Hóa chất và thiết bị Hóa chất Môi trường dùng để nhân giống Saccharomyces cerevisae F28 là môi trường M166 - môi trường giá đậu - đường: Cân 300g giá đậu, thêm 1000ml nước đun sôi 30 phút, lọc lấy phần dịch trong, thêm nước cho đủ 1000ml, cho thêm 30g đường. Hoá chất định lượng acid tổng số: NaOH 0,1N, phenolphtalein… Nhóm hóa chất định lượng đường tổng, đường khử: Ferrycyanure K3Fe(CN)6, NaOH 2,5N, HCl 5%, dung dịch glucose 0,5%,… dung dịch Na2SO3 (5mg/ml). Thiết bị sử dụng Tủ ấm 320; tủ sấy 1000; hệ thống chưng cất cồn, máy đo pH; khúc xạ kế; buồng đếm hồng cầu; kính hiển vi quang học nền sáng; tủ cấy; cân điện tử; rượu kế. Bố trí thí nghiệm Sơ đồ nội dung nghiên cứu Khảo sát thành phần bưởi Năm Roi Khảo sát đặc điểm của Saccharomyces cerevisae F28 Lên men chính với Saccharomyces cerevisae F28 tự do - Tối ưu các thông số lên men Lên men tối ưu Phân tích đánh giá sơ bộ chất lượng sản phẩm Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix Khảo sát ảnh hưởng của pH Khảo sát thời gian lên men chính Khảo sát độ pha loãng của dịch bưởi Nội dung nghiên cứu Khảo sát thành phần bưởi Năm Roi Nhằm xác định một số các thông số kỹ thuật trong quá trình lên men rượu bưởi, chúng tôi tiến hành xác định một số chỉ tiêu của bưởi như sau: Xác định pH: bằng máy đo pH Xác định hàm lượng đường khử-đường tổng Xác định hàm lượng acid tổng (tính theo acid citric): dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH/KOH và chỉ thị phenolphtalein Xác định hàm lượng vitamin C: theo AOAC 2002. Thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh học của Saccharomyces ceverisae F28 Tiến hành trải đĩa để kiểm tra tính thuần của giống, nhuộm tế bào để quan sát hình thái nấm men. Các thí nghiệm tối ưu môi trường lên men Thí nghiệm 1: Khảo sát độ pha loãng của dịch bưởi sau khi ép Dịch bưởi Lọc Pha loãng 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 Kiểm tra các thông số: độ Brix, pH, đường tổng, acid tổng, cảm quan Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian lên men chính của rượu bưởi Dịch bưởi Giống Saccharomyces cerevisae F28 Nhân giống cấp 2 Lọc Nhân giống cấp 1 Pha loãng theo thí nghiệm (1) Phối chế (pH=4,5; 0Bx=20, Na2SO3 50mg/l dịch bưởi) Lên men Kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu theo thời gian theo dõi Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men của dịch rượu bưởi Dịch bưởi Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1 Giống Saccharomyces cerevisae F28 Lọc, pha loãng theo thí nghiệm (1) Bổ sung 10% Đường Saccharose Chỉnh 0Bx=20 Khảo sát ở 4 giá trị pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2) Kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 giá trị pH Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô hòa tan đến khả năng lên men rượu bưởi Dịch bưởi Giống Saccharomyces cerevisae F28 Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1 Lọc, pha loãng theo thí nghiệm (1) Đường Saccharose Khảo sát 0Bx ở các giá trị: 18; 20; 22; 24 Điều chỉnh pH về giá trị được xác định ở thí nghiệm (3) Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi Bổ sung 10% Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2) Kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 giá trị 0Bx Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung vào trước khi lên men rượu bưởi Dịch bưởi Chỉnh 0Bx về giá trị thí ngiệm (4) Điều chỉnh pH về giá trị được xác định trong thí nghiệm (3) Bổ sung Na2SO3 50mg/l dịch bưởi Đường Saccharose Lọc, pha loãng theo thí nghiệm (1) Lên men chính với thời gian được xác định ở thí nghiệm (2) 12% 10% 7% 5% Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Giống Saccharomyces cerevisae F28 Kiểm tra các thông số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, độ rượu ứng với 4 tỷ lệ giống khảo sát Lên men tối ưu Dịch bưởi Lọc Pha loãng theo độ pha loãng tối ưu Giống Saccharomyces cerevisae F28 Điều chỉnh về 0Bx tối ưu Nhân giống cấp 1 Bổ sung dd Na2SO3 theo tỷ lệ 50mg/l dịch bưởi Nhân giống cấp 2 Điều chỉnh về pH tối ưu Bổ sung tỷ lệ tối ưu Lên men chính theo thời gian tối ưu Rượu bưởi Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp vi sinh Phương pháp đếm khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch Nguyên tắc: cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha loãng) lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng lấy lặp lại ít nhất là 2 hộp và mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30 đến 300 khuẩn lạc. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. Ta tiến hành như sau: Đầu tiên chuẩn bị môi trường thích hợp và dịch pha loãng, sau đó khử trùng cùng với các dụng cụ cần dùng, pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết. Sau đó cấy mẫu trên môi trường thạch: rót khoảng 15-18ml môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội 450 vào mỗi đĩa Petri đã vô trùng. Sau đó để thạch nguội đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng của chúng. Đưa một cách vô trùng một thể tích 0,05-0,1ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch. Dùng que trang vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt mội trường. Lật hộp lại và đem ủ trong tủ ủ ở 320C trong 48h, sau đó tiến hành đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa [8]. Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml mẫu được tính theo công thức: Trong đó: N- số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai f1- hệ số pha loãng của đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất v- thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu Tế bào nấm men có kích thước tuông đối lớn nên có thể đếm trực tiếp số tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng có kẽ một lưới gồm 400 ô vuông có diện tích tổng cộng là 1mm2. Ô vuông trung tâm được khoanh tròn gồm 25 ô, trong mỗi ô có 16 ô nhỏ, chiều sâu mỗi ô nhỏ là 0.1mm, diện tích một ô là 0.0025mm2. Khi đếm ta có thể đếm ở 5 ô vuông theo đường chéo hoặc 4 ô ở 4 góc và ô trung tâm [8]. Mật độ tế bào được tính theo công thức sau: Số tế bào đếm được độ pha loãng 0,0025 Trong đó: 0,0025: Diện tích 1 ô nhỏ 0,1: Chiều sâu của một ô nhỏ 16: Số ô nhỏ trong 1 ô lớn 5: Số ô lớn được đếm trong ô trung tâm 10-3: Đổi từ mm3 sang ml. Phương pháp hóa sinh Phương pháp định lượng đường tổng Pha dung dịch saccharose 0,1% ( cân 500mg saccharose, sấy khô ở 600C hòa tan trong 500ml nước cất) Pha các dung dịch đường với hàm lượng khác nhau: lấy 7 bình định mức 100ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1% ở trên, cho nước cất tới vạch mức. Pha phelnol 5%: cân 5g phenol trong 100ml nước cất. Hút từ 7 dung dịch đường đã pha ở trên mỗi dung dịch 1ml cho vào ống nghiệm, lấy 1ml dung dịch phenol 5% và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, để phản ứng trong 10 phút rồi lắc, để cách thủy 10-20 phút ở 25-300C, khi màu bền trong vài giờ thì tiến hành đi đo OD ở bước sóng 490nm. Ta dựng được đồ thị chuẩn, làm tương tự với mẫu cần xác định đường tổng ta sẽ xác định được giá trị đường tổng [8]. Phương pháp đo độ cồn Dùng bình tỷ trọng: Đầu tiên rửa sạch bình tỷ trọng, sấy khọ và làm lạnh trong bình hút ẩm, sau đó đem cân bình không ta được m1 gam. Tiếp theo rót nước cất vào bình đến trên ngấn định mức, đặt bình vào nồi cách thủy có nhiệt độ 200C. Sau 15 phút dùng giấy lọc thấm nước tới ngấn bình đồng thời thấm khô phần không chứa nước, lau khô nút và đậy lại. Lấy bình ra khỏi nồi điều nhiệt, lau khô phía ngoài bình rồi đem cân ta được m2 gam. Tiếp theo đổ nước khỏi bình, tráng bình 2 đến 3 lần bằng dung dịch cần đo tỷ trọng rồi cũng rót chất lỏng tới trên vạch, sau đó làm tương tự như khi bình chứa nước cất, cân được khối lượng m3 gam. Tính d2020, tra phụ lục ta biết được nồng độ rượu cần đo [9]. d2020 = Phương pháp định lượng acid Nguyên tắc: dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chất chỉ thị là phenolphtalein. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính đượng acid tổng số có trong mẫu [9]. Hàm lượng acid tổng (tính theo g acid trên 1 lít (g/l)) được tính theo công thức: , g/l. Trong đó: Ax: lượng acid có trong 1 lít sản phẩm, g/l; n: số ml NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân mẫu thực, ml; V: lượng mẫu mang đi phân tích. K: số g acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N. (Với: Acid citric K=0,0064). Phương pháp định lượng vitamin C Nguyên tắc: Acid L-ascorbic có tính khử mạnh được oxy hóa bằng dung dịch I2 với chỉ thị là dung dịch tinh bột. Điểm kết thúc của phản ứng nhận biết được nhờ chỉ thị dung dịch tinh bột. Đây là phương pháp xác định nhanh và cho kết quả gần đúng. Tiến hành: Lấy 10ml dịch quả cho vào bình tam giác 250ml, cho 5ml dung dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh [9]. Kết quả: Lượng vitamin C được tính theo công thức sau: Hàm lượng vitamin C=, mg/l. Trong đó: n: số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ; 0,88: số mg vitamin C tương ứng với 1ml I2 0,01N; V: số ml dịch quả đã lấy để phân tích. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc. Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm để đánh giá về chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu bưởi. Phương pháp cho điểm : Phương pháp cho điểm được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị và trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng của chất lượng sản phẩm. Do các chỉ tiêu có vai trò đối với chất lượng chung của sản phẩm ở mức khác nhau nên các giá trị cho được đối với mỗi chỉ tiêu được nhân thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì có hệ số trọng lượng cao hơn. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm này quyết định mức chất lượng của sản phẩm được đánh giá [13]. Bảng 3.1: Bảng điểm đánh giá các chỉ tiêu của sản phẩm rượu bưởi (TCVN 3217 – 79) Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu Độ trong và màu sắc 5 Trong, không vẩn đục, màu vàng nhạt sáng, màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Trong, không vẩn đục, màu vàng nhạt. 3 Trong, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm, màu vàng. 2 Hơi đục, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm. 1 Đục nhiều, lắng cặn, màu không đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm đen. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng, có xuất hiện màu lạ Mùi 5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy. 3 Hơi nồng, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. Vị 5 Hòa hợp, yêm dịu, hậu vị tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vị vừa phải, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm bình thường. 3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và sốc, hậu vị yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, sốc, thoảng vị lạ, ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Đắng, sốc, không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo phép thử cho điểm: PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN Tên sản phẩm: Rượu bưởi. Ngày .. Tháng .. Năm .. Họ tên người kiểm tra:…………………………………… Chữ ký:……. Các chỉ tiêu Điểm (0-5) Nhận xét Màu Mùi Vị Trạng thái Rượu bưởi được đánh giá cảm quan qua 4 chỉ tiêu với các hệ số trọng lượng như sau: Bảng 3.2: Hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2