Vấn đề nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá và phôi vôtính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi

NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Hà Thị Thuý1, Trần Thị Hạnh1,Nguyễn Hồng Chiên1, Đỗ Năng Vịnh1, Vũ Văn Vụ2 1 Viện di truyền nông nghiệp, 2 Đại học Quốc gia Hà Nội I. Đặt vấn đề: Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC - embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể (Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹo phôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn, không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000). Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm (Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãn đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn được tạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15 tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo, 1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấy mô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây (Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầu nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống citrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây (Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho thấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả tạo callus và tái sinh phôi tốt nhất. Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trình tạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và tái sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạt và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai. II. Nguyên liệu và phương pháp: a/ Nguyên liệu: Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du, Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3, đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 noãn. Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏ lụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi non rồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trên được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi. b/ Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy: Theo kết quả nghiên cứu nuôi cấy bầu nhuỵ và noãn ở quả non của một số giống citrus thì môi trường MT (Murashige & Tucker) là môi trường thích hợp nhất cho tạo callus phôi hoá (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy noãn và hạt non trên nền môi trường này. +Môi trường tạo callus phôi hoá: - MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch. - MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch. + Môi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phôi hoá: MT + BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/l Malt extract + 1,0g/l glutamin + Môi trường tạo phôi: • G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch • G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch • BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch + Môi trường nẩy mầm phôi vô tính: MS hoặc MT + 30g/l đường, không có chất điều hoà sinh trưởng. Môi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Noãn được nuôi trên đĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml môi trường thạch, để trong tối. Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trường đặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng ( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân mô sẹo trong tối ở nhiệt độ (25 - 27oC). Quá trình phôi hoá của mô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện có chiếu sáng 2400 Lx và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày. III. Kết quả và thảo luận 1.Tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng Để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng, chúng tôi tiến hành khử trùng quả non với hai loại hoá chất Ca(ClO)2 ở nồng độ 6% và HgCl2 ở nồng độ 0,01%. Kết quả cho thấy với các chất khử trùng khác nhau và trong khoảng thời gian khác nhau thì tỉ lệ tạo mẫu sạch là khác nhau. Khử trùng bằng Ca(ClO)2 ở nồng độ 6% trong thời gian 10 và 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch tương ứng là 62,4% và 87,8%. Khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,01% trong thời gian 5 và 10 phút, tỉ lệ tạo mẫu sạch tương ứng là 65,5% và 93%. Như vậy, khử trùng bằng HgCl2 cho tỉ lệ mẫu sạch rất cao nhưng sau đó mẫu nhanh chóng bị thâm đen. Hiện tượng này không thấy xuất hiện khi khử trùng bằng Ca(ClO)2. Vì vậy chúng tôi đã chọn chất khử trùng thích hợp cho quả non là Hypoclorit canxi - Ca(ClO)2 ở nồng độ 6% trong thời gian 15 phút. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi noãn bầu nhuỵ trước và sau thụ phấn lên khả năng tạo callus phôi hoá(EC). Trước khi hoa nở 1-2 ngày (trước khi thụ phấn) noãn được tách ra để nuôi cấy. Sau khi hoa được thụ phấn, cánh hoa và nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Kích thước của noãn tăng dần, sự tăng kích thước là kết quả của quá trình phân bào xảy ra ở các mô khác nhau, trong đó có lớp tế bào phôi tâm (nucellar), phôi hữu tính nhị bội và nội nhũ tam bội thể. Kết quả noãn phát triển thành hạt non. Sau khoảng 2-5 tháng nuôi cấy, chúng tôi quan sát phản ứng tạo callus phôi hoá từ noãn và hạt non ở các giống khác nhau. Đối với nuôi cấy noãn trước thụ phấn, chúng tôi chỉ thu được callus dạng cứng, màu vàng mà không thu được callus phôi hoá ở tất cả các giống. Đối với hạt non (từ quả non) có độ tuổi từ 1-8 tuần tuổi, chúng tôi đã thu được callus phôi hoá ở các giống cam Vân du, cam Sành, quýt Đường canh và quýt Chum. Riêng với giống bưởi Phúc Trạch, chúng tôi chưa thành công trong việc tạo callus phôi hoá mà chỉ thu được dạng callus cứng, màu vàng trắng. Mô sẹo phôi hoá tạo được từ noãn (hoặc noãn đã được phân hoá thành hạt non) đã được nhiều tác giả khẳng định là có nguồn gốc từ mô phôi tâm (Buttton and Bornman,1971; Gmitter and Moore,1986). Trong một số trường hợp, mô sẹo phôi hoá đã được tạo ra từ nội nhũ,tuy nhiên tỷ lệ cây tái sinh từ nội nhũ hạt non rất thấp (Gmitter et al.,1991). Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm ở các giống khác nhau, kết quả thu được được thể hiện ở bảng 1, Biểu đồ 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát sinh callus phôi hoá Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát sinh callus Hình ảnh các dạng mô sẹo nhận được từ nuôi cấy mô noãn sau thụ phấn từ 1-8 tuần tuổi Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 6 đối với cam Vân Du (12,5%) và rất thấp ở các độ tuổi 3 (0,9%), tuổi 1 (1,3%), tuổi 2 (1,7%), tuổi 4 (1,35%) và tuổi 5 (1,46) ; Với Cam Sành tỉ lệ tạo mô sẹo phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 2 (35,5%) và thấp nhất ở tuổi 3, 4 (tương ứng là 3,6%; 4,2%); ở quýt Chum tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1 (58,2%) và thấp nhất ở tuổi 8 (5,6%); Cũng giống như quýt Chum, ở quýt Đường Canh tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1 (63,5%), tỉ lệ này cũng khá cao ở tuổi 7 và tuổi 8 (56,7% và 59,5%). 3. Vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng đối với tạo callus phôi hoá ở một số giống citrus. Môi trường MT được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở cây ăn quả có múi (Murashige and Tucker, 1969; Gmitter et al.,1990; Kunitake and Mu,1995). Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với hai loại phytohormon khác nhau là Kinetine và BAP ở các nồng độ khác nhau để tìm ra chủng loại và nồng độ phytohormon thích hợp nhất cho việc tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở biểu đồ 2 và 3. Kết quả cho thấy Kinetine có hiệu quả tương đối thấp lên quá trình tạo callus phôi hoá ở cả 4 giống trên. Tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất mới là 15,3% (nồng độ 2,0mg/l K) ở giống quýt Đường canh. Với các giống còn lại tỉ lệ này còn thấp hơn: cam Vân du 9,5% (nồng độ 1,25mg/l K), cam Sành 10,8% (0,75mg/l K), quýt Chum 13,1% (0,25mg/l K). Trong khi đó, BAP cho tỉ lệ tạo callus phôi hoá cao hơn so với Kinetine ở cả 4 giống trên. Tỉ lệ tạo callus phôi hoá cao nhất là ở giống quýt Đường canh 33,2% (ở nồng độ 0,5mg/l BAP); tiếp đó là các giống cam Vân du 31,9% (2,0mg/l BAP), cam Sành 29,3% (2,0mg/l BAP), quýt Chum 27,6% (1,0mg/l BAP). Điều này cho thấy BAP là loại phytohormon thích hợp cho việc tạo callus phôi hoá ở một số giống citrus. Các giống cam Vân du và cam Sành tỏ ra thích hợp với BAP ở nồng độ cao (2mg/l), tuy nhiên, quýt Chum và quýt Đường canh lại thích hợp ở nồng độ thấp hơn. Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của Kinetine đến tỉ lệ tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của BAP đến tỉ lệ tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau 4. Nghiên cứu quy trình nhân sinh khối callus phôi hoá bằng nuôi cấy lỏng lắc Mô sẹo thường có biểu hiện lão hoá khá nhanh khi nuôi cấy trên môi trường thạch trong thời gian dài. Biểu hiện của lão hoá là tế bào chuyển màu vàng nhạt sang vàng đậm, tiếp theo là nâu hoá. Tốc độ tăng sinh khối của callus trên môi trường đặc chậm. Tế bào có thể có biểu hiện khác là phân hoá thành các dạng khác nhau về cấu trúc và hình thái. Tính đồng nhất của quần thể tế bào do vậy bị giảm. Để khắc phục tình trạng này chúng tôi nghiên cứu nhân sinh khối mô sẹo phôi hoá theo phương thức luân chuyển như sau: ban đầu sinh khối được nhân trên môi trường đặc,tiếp sau môi trường lỏng lắc,tiếp theo EC lại được cấy chuyển để nhân trên môi trường đặc.Như vậy, EC sẽ được nhân theo chu kỳ đặc,lỏng kế tiếp nhau. Sau khi thu được sinh khối EC ban đầu từ các giống địa phương cam Vân du, Cam Sành, Quýt Chum, Quýt Đường canh và một số giống nhập ngoại: Murcott, Olinda Valencia, Navel N14-10 trên MT thạch. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhân callus phôi hoá trên môi trường lỏng lắc nhằm mục đích tạo ra dạng callus phôi hoá đồng đều về kích thước và độ tuổi. Thời gian nuôi cấy callus phôi hoá trên môi trường lỏng lắc từ 14-20 ngày. Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy rằng sau nuôi cấy14-20 ngày sinh khối callus đạt được cao, có màu trắng, mịn, gồm các tế bào đơn hoặc các cụm tế bào nhỏ tách rời, tương đối đồng đều về mặt kích thước và hình dạng.Kết quả nuôi cấy theo chu kỳ này cho phép tạo ra khối lượng lớn sinh khối mô sẹo phôi hoá đồng nhất trong thời gian ngắn.Nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc cho thấy Môi trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 3%, và BAP thích hợp với nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau thích hợp với các nồng độ khác nhau của BAP. 4. Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ callus phôi hoá ở các giống khác nhau. Callus phôi hoá thu nhận từ nuôi cấy trên môi trường đặc và môi trường lỏng của các giống đã được chuyển vào môi trường tạo phôi. Sau khoảng 2 tháng chúng tôi nhận được phôi vô tính có lá mầm phát triển. Một số phôi có cấu trúc tương tự như phôi 2 lá mầm của hạt hữu tính .Với hai giống cam Vân du và N14-N10, môi trường tạo phôi thích hợp nhất là môi trường G1. ở môi trường này, phôi vô tính thu được có dạng hai lá mầm hoàn chỉnh, đơn nhất, kích thước tương đối đồng đều (Ảnh 7). Trên môi trường G2 và BG, phôi vô tính thu được có dạng cụm phôi, nhiều lá mầm và phát sinh nhiều dạng hình thái phôi không rõ ràng (Ảnh 8). Việc nghiên cứu tạo ra tính đồng nhất của mô sẹo phôi hoá và những điều kiện môi trường tối ưu để tạo hàng loạt phôi vô tính có độ đồng đều cao từ các giống citrus khác nhau cần được tiếp tục nghiên cứu. 6. Nghiên cứu sự nảy mầm của phôi vô tính. Phôi vô tính thu được từ hai giống cam Vân du và N14-10 được cấy trên hai loại môi trường cơ bản MS và MT không có phytohormon để phôi nảy mầm thành cây con. Sau 15 ngày, chúng tôi thu được kết quả như sau: trên môi trường MT phôi có tạo rễ nhưng rễ vẫn còn ngắn và có dạng cụm rễ. Với dạng rễ như thế, ở cam quýt, cây sẽ khó sống khi đem ra trồng ở vườn ươm. Ngược lại, trên môi trường MS phôi ra rễ rất nhanh và sớm tạo cây con hoàn chỉnh,khoẻ mạnh,chỉ có một rễ ở mỗi phôi (ảnh 9 và 10).Cây con ra vườn ươm đạt tỷ lệ sống trên 90 %. IV. Kết luận: Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu ở trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Tỷ lệ tạo callus phôi hoá từ nuôi cấy noãn và hạt non phụ thuộc vào tuổi quả. Cam Vân Du ở 6 tuần tuổi, cam Sành 2 tuần tuổi, quýt Chum và quýt Đường Canh ở tuần tuổi 1,7 và 8 cho tỷ lệ tạo callus phôi hoá cao nhất. Đối với noãn chưa qua thụ phấn chúng tôi chưa thu được dạng callus phôi hoá. 2. Môi trường thích hợp cho tạo callus phôi hoá là môi trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 5%, thạch 5g/l và BAP với nồng độ khác nhau ở các giống khác nhau. Với cam Vân du tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở nồng độ 2,0mg/l; cam Sành 2,0mg/l; quýt Chum 1,0mg/l và quýt Đường canh 0,5mg/l. 3. Nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc cho thấy Môi trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 3%, và BAP thích hợp với nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau thích hợp với các nồng độ khác nhau của BAP. 4. Callus phôi hoá có xu hướng tạo phôi vô tính trên môi trường có hàm lượng BAP thấp. Trên môi trường có BAP nồng độ cao hơn các phôi có xu hướng phát triển không bình thường. 5. Phôi vô tính với lá mầm phát triển đã nảy mầm thành cây con khoẻ mạnh khi được nuôi cấy trên môi trường MS không có chất điều hoà sinh trưởng. Summary: Induction of somatic embryogenic callus and somatic embryos derived from ovule cultures of local citrus cultivars Ha Thi Thuy 1, Tran Thi Hanh 1,Nguyen Hong Chien, Do Nang Vinh 1 ,Vu Van Vu2 Institute of Agricultural Genetics 1, Hanoi National University 2 Somatic embryogenic callus derived from nucellar cells have been induced by ovule culture of local Citrus cultivars including orange Van du (C.sinensis), mandarins Quyt Chum,Duong Canh( C. reticulata) and Cam Sanh ( Citrus nobilis).Ovaries and immature fruits (1-8 weeks after anthesis) are surface disinfected and cut open under aseptical condition.The ovules are excised and cultured on the MT culture media with different concentrations of Kinetine and BAP.The embryogenic callus (EC) induction rates are quite different and depending both on genotypes and cultured media.The induced callus have been propagated by periodically cultures on solid and liquid media.The suitable media for EC induction and propagation have been developed for each studied cultivars.Embryogenic callus were profusely developed into well-formulated somatic embryos which are developed into microplants in MT medium without growth regulator.The percentage of plants survive after transfered to the soil is very high. Embryogenic callus is currently used in our laboratory for different researches: embryogenesis in bioreactor,tetraploid induction in vitro by colchicine treatement,development of disease-free materials and for study on obtaining seedless somaclones derived from local cultivars. Tài liệu tham khảo: 1. Đỗ Năng Vịnh (2002). "Công nghệ sinh học cây trồng " Nhà xuất bản NN 2. Button J., Bornman C.H. (1971). Development of nucelar plantsfrom unpollinated and unfertilised ovules of Washington Navel orange in vitro, J. South Afric. Bot., 37: 127-134. 3. Cameron. J.W and Reuther. H.B. (1968). Genetics, Breeding, and nucellar Embryony. In "The Citrus Industry" H.B. Reuther Edited: 325 - 370. 4. Carimi. F, De Pasquale and Grescimanno F. G. (1995). Somatic embryo- genesis in citrus from styles culture. Plant sciences. 105, 81- 86 5. De Pasquale F, F. Carimi and Grescimanno F. G. (1994). Somatic embryo genesis from styler of different cultivars of Citrus limon (L.) Burm. Aust. J. Bot.42.587-594 6. Gmitter. F.G.Fr and G.A.Moore (1986). Plant regeneration from undeveloped ovules, and embryonic calli of citrus- Embryo production germination, and plant survival, J. Plant celltissue organ cultrue, 6, 139- 147 7. Gmitter F.G., Ling X.B., Deng X.X. (1991). Induction of triploid Citrus plants from endosperm calli in vitro. Theor. Applied Genet(In press). 8. Grosser J.W, Ollitrault P. and Olivares-Fuster O., (2000). Somatic hybridization in Citrus: An effective tool to facilitate variety improvement. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 36: 434 - 449. November - December 2000, Society for in vitro Biology. 9. Hidaka T, Omura M (1989). Control of embryogenesis in Citrus cell culture. Regeneration from protoplasts and attempts to establish a callus bank. Bull fruit tree Ré Stn Ser B ( Okitsssu) 16: 1-17 ( in Japanese) 10. Kuntake H., Mu M. (1995). Somatic embryogenesis in Citrus Species. Biotechnology in Argiculture and forestry, vol. 30. 11. Murashige. T and D.P. H. Tucker, 1969. Growth factor requirements of citrus tissue cullture, Proc. 1ST Int. Citrus symp. 3, 1155 -1161 12. . Symposium sur Mandarines - 5 au 11 mars, Corse, France - INRA: 19. 13. Starrantino. A and F. Russo.1980. Seedling from undeveloped ovules of ripe fruit of polyembryonic citrus cultivars. Horst. Science.15. 296- 297 Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Đoàn Duy Thanh