Ứng dụng kỹ thuật Pcr và MULTIPLEX PCR xác định tỷ lệ nhiễm neisseria meningitidis và điều tra các nhóm huyết thanh lưu hành tại 2 sư đoàn huấn luyện tân binh 312 và 325

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 1 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ MULTIPLEX PCR XÁC ĐINH TỶ LỆ NHIỄM NEISSERIA MENINGITIDIS VÀ ĐIỀU TRA CÁC NHÓM HUYẾT THANH LƢU HÀNH TẠI 2 SƢ ĐOÀN HUẤN LUYỆN TÂN BINH 312 VÀ 325 Triệu Phi Long*; Lê Thu Hà**; Lê Thị Hải Yến** Phạm Trắc Đông**; Nguyễn Văn Hiệp**; Đoàn Trọng Tuyên** TÓM TẮT Thu thập ngẫu nhiên 207 mẫu nhày họng của quân nhân thuộc f 312 và f 325 tại thời điểm đầu tháng 4 - 2012 (sau gần 2 tháng huấn luyện tân binh). Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện N. meningitidis trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện 5 nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu (A, B, C, Y, W135) của N. meningitidis. Kết quả: tỷ lệ nhiễm N. meningitidis trung bình ở 2 sƣ đoàn này khi không có dịch là 16,42%. Trong đó, ®¬n vÞ cao nhất là 32,26% (Trung đoàn 209); ®¬n vÞ thấp nhất là 6,25% (Trung đoàn 18). Các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu ở 2 sƣ đoàn đƣợc xác định là B và C, chiếm tỷ lệ khá cao (53%). * Từ khóa: Neisseria meningitidis; Kỹ thuật PCR; Kỹ thuật multiplex PCR; Nhóm huyết thanh. APPLYING PCR AND MULTIPLEX-PCR TECHNIQUES TO DETERMINE NEISSERIA MENINGITIDIS INFECTION RATE AND INVESTIGATE THE SEROGROUPS CIRCULATION IN TWO RECRUIT TRAINING DIVISION 312 AND 325 SUMMARY Randomly collected 207 samples of throat muscus in Division 312 and Division 325 in April, 2012, two months after recruit training had started. Apply direct PCR technique to identify N. meningitidis in clinical samples. Apply multiplex PCR technique to identify five main pathogenic serogroups (i.e. A, B, C, Y, W135) of N. meningitidis. Results: The infection average rate of N. meningitidis outside epidemic in these two Divisions was 16.42%; the highest rate was 32.26% (Regiment 209) and the lowest was 6.25% (Regiment 18). The main pathogenic serogroups were distributed at the two Divisions B and C that had quite high rate (53%). * Key words: Neisseria meningitidis; PCR; Multiplex PCR; Serogroup. * Học viện Quân y ** Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn TS. Trần Viết Tiến TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Phòng và chống não mô cầu đang là vấn đề đƣợc Ngành Y tế nói chung và Ngành Quân y nói riêng đặc biệt quan tâm. Từ tháng 02 - 2012, não mô cầu là một trong 3 mầm bệnh cần đƣợc tăng cƣờng giám sát (Bộ Y tế). Não mô cầu (Neisseria meningitidis) tồn tại tự nhiên trong hầu họng của ngƣời, thƣờng không gây bệnh. Tỷ lệ ngƣời lành mang VK chiếm khoảng 5 - 15% [2]. VK có thể truyền từ ngƣời sang ngƣời theo những giọt nƣớc nhỏ bài tiết qua đƣờng hô hấp. Ngƣời là vật chủ duy nhất của não mô cầu và ngƣời lành mang VK là yếu tố lan truyền bệnh mạnh mẽ hơn cả bệnh nhân (BN). Tính chất gây dịch của não mô cầu ở các quốc gia, khu vực khác nhau phụ thuộc nhiều vào nhóm huyết thanh lƣu hành. Hiện nay, đã xác định đƣợc 13 nhóm huyết thanh đó là A, B, C, D, 29- E, H, I, K, L, W135, X, Y và Z. Trong đó, 5 nhóm huyết thanh của não mô cầu có khả năng gây dịch, đó là A, B, C, Y và W135 [1]. Những năm gần đây, dịch do não mô cầu liên tục xuất hiện tại các đơn vị quân đội đóng quân tại khu vực miền Bắc. Trong đó, Sƣ đoàn huấn luyện tân binh 312 (f 312) và 325 (f 325) là hai đơn vị thƣờng xuyên có dịch lƣu hành và có ca bệnh tử vong. Xác định tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và điều tra sự lƣu hành các nhóm huyết thanh của N. meningitidis trong cộng đồng giữa những vụ dịch là một nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng, nhằm sớm đƣa ra yếu tố dự báo dịch và biện pháp dự phòng hiệu quả. Qua nghiên cứu chúng tôi thấy, PCR (Polymerase chain reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, để chẩn đoán xác định N. meningitidis [8]. Nếu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện N. meningitidis và multiplex PCR phát hiện đồng thời 5 nhóm huyết thanh (A, B, C, Y, W135) trên các gen đặc hiệu mã hóa cho loài và các nhóm huyết thanh sẽ có hiệu quả cao hơn nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy phân lập, định danh thƣờng quy [6, 7]. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu và triển khai đề tài này nhằm: - Xác định tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm. - Xác định các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu lưu hành tại 2 đơn vị f 312 và f 325. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 207 mẫu dịch nhày họng của quân nhân thuộc f 312 và f 325. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Nghiên cứu dịch tễ học mô tả và phân tích. - Điều tra các yếu tố liên quan tới tình trạng nhiễm theo mẫu phiếu điều tra của Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội. - Thu thập ngẫu nhiên mẫu nhày họng của nh÷ng quân nhân đang công tác, huấn luyện tại 2 sƣ đoàn trên. - Tách chiết và tinh sạch ADN của N. meningitidis bằng kít tách của hãng Qiagen. - Ứng dụng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi xác định loài N. meningitidis nằm trên gen CtrA mã hóa cho: capsule polysaccharide export outer membrane protein. Những mẫu dƣơng tính với phản ứng PCR tiếp tục chạy phản ứng multiplex PCR để phát hiện nhóm huyết thanh [10]. - Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR: sử dụng 01 cặp mồi xác định nhóm huyết thanh A trên gen pJS-B-02 (đƣợc biết với tên khác orf-2): mã hóa cho hypothetical protein và 04 cặp mồi xác định nhóm huyết thanh B, C, Y và W135 nằm trên siaD mã hóa cho alpha-2,8 polysialyltransferase [10]. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 3 - Tổng hợp kết quả xét nghiệm PCR, multiplex PCR và thông tin trong mẫu phiếu điều tra dịch tễ. Phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm Epi.info 3.5.3 (phiên bản cập nhật 2007). - Đƣa ra kết luận về tình trạng nhiễm N. meningitidis và các yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm. Đánh giá sự lƣu hành nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu tại ở những đơn vị trực thuộc f 312 và f 325. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và các yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm tại f 312 và f 325. *.Thực hiện PCR phát hiện loài N. meningitidis: 1 2 3 4 M 6 7 8 H×nh 1A: Ph¶n øng PCR ph¸t hiÖn loµi. 1. Chøng (-); 2, 3, 4, 7: nh÷ng mÉu (-); M: thang marker; 6: chøng (+); 8: mÉu (+). Chứng dƣơng và mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với loài N. meningitidis đều cho hình ảnh điện di rõ nét ở mức 176 bp, mẫu chứng âm không xuất hiện, không có sản phẩm phụ, chứng tỏ không có nhiễm chéo với loài khác. PCR là kỹ thuật đƣợc WHO công nhận đạt tiêu chuẩn chẩn đoán xác định N. meningitidis [8]. Nguyễn Ngọc Bảo và CS (2010) [4] nghiên cứu so sánh tỷ lệ phát hiện N. meningitidis của phƣơng pháp PCR và nuôi cấy phân lập cho thấy: phƣơng pháp PCR có tỷ lệ phát hiện N. meningitidis đạt 73,91% trong các loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng, so với kỹ thuật nuôi cấy phân lập là 13,04%; kỹ thuật PCR đạt tỷ lệ phát hiện 100%, độ nhạy 103 CFU/ml trên mẫu dịch nhày họng, so với nuôi cấy 50%. Theo M. Qurbanalizadegan (Iran) và CS (2010) [7], phƣơng pháp PCR có độ nhạy cao hơn phƣơng pháp nuôi cấy, ngƣỡng phát hiện của PCR là 500 ng ADN/ml, tƣơng ứng với 90 copies/ml, độ đặc hiệu 100%. Kỹ thuật nuôi cấy phân lập là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán, nhƣng hiệu suất không cao do đặc điểm N. meningitidis khó nuôi cấy, sức chịu đựng ngoại cảnh kém. Do đó, kỹ thuật PCR để phát hiện loài N. meningitidis là phƣơng pháp tối ƣu. * Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis tại các Trung đoàn (e) thuộc f 312 và f 325: Bảng 1: Kết quả ứng dụng kỹ thuật PCR xác định tỷ lệ nhiễm N. meningitidis tại các e thuộc f 312 và f 325. ĐƠN VỊ KẾT QUẢ PCR p sè mÉu (+) % f 312 e 141 39 6 15,38 p (1;2;3) > 0,05 p (3-5) < 0,01 e 165 35 5 14,29 e 209 31 10 32,26 f 325 e 101 34 5 14,71 p (3;4;5) > 0,05 e 18 32 2 6,25 e 95 36 6 16,67 Tổng 207 34 16,42 Kết quả cho thấy, tỷ lệ nhiễm N. meningitidis tính trung bình ở các e thuộc 2 sƣ đoàn trên tăng nhẹ (16,42 %) so với tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng (5 - 15%). Trong đó, tỷ lệ nhiễm 176 bp TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 4 thấp nhất là e 18 (6,25%) và cao nhất là e 209 (32,26%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Trong 2 sƣ đoàn trên, chỉ có e 209 thuộc f 312 có tỷ lệ nhiễm N. meningitidis cao tới mức cần đề phòng dịch xảy ra (> 20%) [1]. * Phân tích các yếu tố liên quan tới tình trạng nhiễm trong phiếu điều tra dịch tễ: Phân tích phiếu điều tra thấy các e thuộc 2 sƣ đoàn trên đều có điều kiện ngoại cảnh, chế độ huấn luyện: cƣờng độ luyện tập; thời gian sinh hoạt tập thể, điều kiện dinh dƣỡng và đảm bảo y tế, hậu cần... tƣơng đối giống nhau. So sánh tỷ lệ nhiễm của các đối tƣợng quân nhân phân chia theo nhóm tuổi quân (tính theo năm nhập ngũ), quê quán cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Tuy nhiên, khi so sánh khoảng cách giƣờng nằm của bộ đội tại e 209 và e 18, số quân nhân thuộc e 209 có giƣờng nằm cách nhau < 1 m là 23/32 (72%), so với đơn vị e 18 là 9/32 (28%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Bảng 2: So sánh khoảng cách giƣờng nằm của bộ đội tại e 209 và e 18. Đ e 209 e 18 p Khoảng cách giƣờng ≥ 1 m 9 (29%) 22 (71%) p < 0,05 Khoảng cách giƣờng < 1 m 23 (72%) 9 (28%) Tổng số 32 31 Khoảng cách giƣờng nằm của quân nhân < 1 m sẽ làm tăng nguy cơ lây nhiễm vì N. meningitidis có khả năng lây truyền mạnh mẽ qua các giọt nƣớc nhỏ bắn vào không khí trong phạm vi < 1 m [8]; thời gian tiếp xúc với mầm bệnh lâu (thời gian ngủ của bộ đội khoảng 9 giờ/ngày); vào thời điểm giao mùa, độ ẩm không khí tăng về ban đêm, sức đề kháng tự nhiên của cơ thể dễ bị suy giảm. Khoảng cách giƣờng nằm < 1 m của quân nhân thuộc e 209 chiếm đa số (72%) và tỷ lệ nhiễm N. meningitidis của đơn vị này rất cao (32,26%). Ngƣợc lại, ở đơn vị e 18, khoảng cách giƣờng nằm của quân nhân ≥ 1 m (71%), tỷ lệ nhiễm N. meningitidis ở đơn vị này thấp hơn rõ rệt (6,25%). 2. Xác định các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu lƣu hành tại f 312 và f 325. * Thực hiện multiplex PCR phát hiện các nhóm huyết thanh: 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 Hình 1B: Phản ứng multiplex-PCR phát hiện nhóm. M: thang marker; 13 (chứng âm): 1, 3, 4, 11 (những mẫu không xác định); 2, 5, 6, 12 (những mẫu dƣơng tính với nhóm huyết thanh B); 7 (chứng dƣơng nhóm huyết thanh B); 8 (chứng dƣơng nhóm huyết thanh C); 9 (chứng dƣơng nhóm huyết thanh W135); 10 (mẫu dƣơng tính nhóm huyết thanh C). Phân tích hình 1B thấy, chứng dƣơng và mẫu dƣơng tính với nhóm huyết thanh B đều ở mức 450 bp, chứng dƣơng mà mẫu dƣơng tính với nhóm huyết thanh C đều ở mức 250 pb, chứng dƣơng nhóm huyết thanh W135 ở mức 120 pb. Chứng âm không xuất hiện và các băng vạch rõ nét, không có sản phẩm phụ. Chứng tỏ kết quả 450 bp 250 bp 120 bp TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 5 multiplex PCR đảm bảo, không có tình trạng nhiễm chéo. Đối với mẫu dịch nhày họng, để phát hiện nhóm huyết thanh của N. meningitidis cần phải nuôi cấy, định danh, sau đó ngƣng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu của 5 nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu là A, B, C, Y, W135 trên lam kính. Nhƣ vậy sẽ không hiệu quả, vì bản thân kỹ thuật nuôi cấy có tỷ lệ phát hiện thấp. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là phản ứng multiplex PCR phát hiện 5 nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu (A, B, C, Y, W135) đƣợc thực hiện ngay trên những mẫu tách chiết ADN (mẫu dƣơng tính với phản ứng PCR). Phản ứng multiplex PCR có độ nhạy 104 CFU/ml và không có nhiễm chéo) [4]. Việc lựa chọn các vùng gen bảo thủ đặc hiệu cho loài và nhóm N. meningitidis, cách thiết kế những cặp mồi dựa trên kết quả nghiên cứu của CDC (Mỹ) [9, 10]. Những trình tự này đƣợc đăng ký trên GenBank: CtrA, pJS-B-02, SiaD. Quy trình của chúng tôi đƣợc phòng xét nghiệm Meningococcus của WHO đặt tại Pharo (Pháp) đối chứng năm 2008 [4]. * Cơ cấu lưu hành các nhóm huyết thanh của N. meningitidis tại f 312 và f 325: Bảng 3: Kết quả ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR xác định các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu (A, B, C, Y, W135) tại f 312 và f 325. ĐƠN VỊ SỐ MẪU (+) N. meningitidis NHÓM HUYẾT THANH B C KXĐ f 312 21 11 0 10 f 325 13 2 5 6 Các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu ở f 312 và f 325 là B và C (53%) (vẫn là hai nhóm huyết thanh chúng tôi xác định đƣợc từ những vụ dịch trƣớc đây đã xảy ra tại hai đơn vị trên). Các nhóm huyết thanh không xác định chiếm 47% (những nhóm huyết thanh này thƣờng không gây bệnh, nên chúng tôi không thiết kế mồi để phát hiện). Nhiều nghiên cứu cho thấy, chỉ số dƣơng tính với N. meningitidis trong cộng đồng thƣờng chiếm khoảng 5 - 15%, số chủng không gây bệnh chiếm khoảng 90% [2]. Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và các nhóm huyết thanh gây bệnh của 2 đơn vị trên khá cao (53%), tƣơng đƣơng với kết quả giám sát đối tƣợng tiếp xúc gần với ca bệnh trƣớc đây chúng tôi điều tra tại các đơn vị xảy ra dịch (50,81%) [5]. Điều đó cho thấy, biện pháp xử lý ổ dịch trƣớc đây ở 2 đơn vị này chƣa triệt để. Có thể VK N. meningitidis chỉ gây triệu chứng lâm sàng nhẹ nhƣ sốt, viêm mũi họng nên ít đƣợc quan tâm. KÕt luËn - Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis trung bình ở 2 sƣ đoàn này khi không có dịch là 16,42%, tăng nhẹ so với tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng (5 - 15%). Trong đó, đơn vị cao nhất là 32,26% (Trung đoàn 209), đơn vị thấp nhất là 6,25% (Trung đoàn 18). - Cần đề phòng dịch xảy ra tại e 209. - Một trong những nguyên nhân khiến tỷ lệ nhiễm N. meningitidis tăng cao ở e 209 bƣớc đầu xác định là do khoảng cách giƣờng nằm của quân nhân không hợp lý (< 1 m). - Các nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu của N. meningitidis phân bố ở 2 sƣ đoàn là B và C, chiếm tỷ lệ khá cao (53%). Tµi liÖu tham kh¶o 1. Bộ môn Truyền nhiễm, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Bệnh truyền nhiễm. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 6 Nhà xuất bản Hội Y Dƣợc học Thành phố Hồ Chí Minh. 1992. 2. Bộ Y tế. Vi khuẩn y học (dùng cho đào tạo bác sỹ và học viên sau đại học). Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 2009. 3. Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn. Bệnh học truyền nhiễm. Nhà xuất bản Y học. 2009. 7. Nguyễn Ngọc Bảo, Phạm Thị Kim Nhung, Vũ Thị Phương Liên, Đoàn Trọng Tuyên. Ứng dụng kỹ thuật PCR và multiplex PCR phát hiện Neisseria meningitidis trong các loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Tạp chí Y dƣợc Lâm sàng 108. 2010. 8. Đoàn Trọng Tuyên, Cao Thị Minh Ngọc, Lê Hải Yến, Phạm Thị Kim Nhung và CS. Điều tra nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis từ một số vụ dịch viêm màng não trong quân đội. Tạp chí Y học Quân sự. 2011, 275. 9. Hongfei Zhu, Quan Wang, Liuqing Wen, Jianguo Xu, Zhujun Shao, Min Chen, Mingliang Chen, Peter R Reeves, Boyang Cao, Lei Wang. Development of a multiplex PCR assay for detection and genogrouping of Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol. 2012, January, 50, pp.146-151. 10. M. Qurbanalizadegan, R Ranjbar, R A Ataee, M Hajia, Z Goodarzi, S Farshad, N Jonaidi Jafari, Y Panahi, H Kohanzad, M Rahbar, H Ghadimi, M Izadi. Specific PCR assay for rapid and direct detection of Neisseria meningitidis in cerebrospinal fluid specimens. Iranian Journal of Public Heath. 2010, 39, 4, pp.45-50. Ngµy nhËn bµi: 19/9/2012 Ngµy giao ph¶n biÖn: 30/10/2012 Ngµy giao b¶n th¶o in: 28/12/2012 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 7