Ứng dụng kỹ thuật MLPA và QF-PCR chẩn đoán các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 8 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA VÀ QF-PCR CHẨN ĐOÁN CÁC HỘI CHỨNG DI TRUYỀN GÂY CHẬM PHÁT TRIỂN TRÍ TUỆ Nguyễn Thị Băng Sương*,**, Nguyễn Hữu Huy*, Lê Thị Hương Lan***, Lâm Vĩnh Niên**, Lê Minh Khôi*,**, Đỗ Văn Dũng** TÓM TẮT Mở đầu: Chậm phát triển trí tuệ là một vấn đề đang được quan tâm trong giáo dục và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Các bất thường về nhiễm sắc thể là nguyên nhân chính gây ra chậm phát triển trí tuệ thể nặng. Hiện nay, kĩ thuật MLPA và QF-PCR là các kĩ thuật có nhiều ưu điểm trong chẩn đoán các dạng đột biến cấu trúc và số lượng NST. Mục tiêu:Ứng dụng kỹ thuật MLPA và QF-PCRphát hiện các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chúng tôinghiên cứu trên109 bệnh nhân được chẩn đoán chậm phát triển trí tuệ. Thực hiệntách chiết ADN từ mẫu máu, kiểm tra độ tinh sạch của ADN, chạy phản ứng MLPA và QF-PCR. Kết quả: Chúng tôi đã phát hiện 3 bệnh nhân mắc Hội chứng Down (Trisomy 21) và 1 bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (47,XXY). Kết quả MLPA phân tích cho thấy 7 bệnh nhân có đột biến mất đoạn, lặp đoạn. Sáu hội chứng di truyền đã được xác định, bao gồm hội chứng Cri du chat, hội chứng Phelan-Mcdermid, hội chứng mất đoạn 1p36, hội chứng Wolf-Hirschhorn, hội chứng DiGeorge, hội chứng lặp đoạn 7q11.23. Phát hiện 1 bệnh nhân Fragile X bằng phương pháp QF-PCR Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật MLPA và QF-PCR phát hiện các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ. Cần tiếp tục nghiên cứu trên nhiều bệnh nhân nữa nhằm khẳng định giá trị của MLPA VÀ QF-PCR trong phát hiện và xác định đặc trưng những trường hợp chậm phát triển trí tuệ do những hội chứng di truyền hiếm gặp. Từ khóa: Chậm phát triển trí tuệ, MLPA, QF-PCR, hội chứng di truyền ABSTRACT APPLICATION OF MLPAAND QF-PCR METHODS FOR DETECTING GENETIC SYNDROMES ASSOCIATED WITH INTELLECTUAL DISABILITY Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Thi Huong Lan, Lam Vinh Nien, Le Minh Khoi, Do Van Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 21 - No 3 - 2017: 8 – 16 Introduction: Intellectual Disability has gained increasing attention in the area of community education and health care. Chromosomal abnormalities are thought to be the most common cause of severe intellectual disability. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) and Quantitative Fluorescence- Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) has many advantages in detecting mutations in number or structure of chromosomes. Objective: We studied the application of MLPA and QF-PCR methods to detect genetic syndromes ** Bệnh viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh *** Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên Tác giả liên lạc:TS. BS. Nguyễn thị Băng Sương ĐT: 0914007038 Email:suongnguyenmd@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 9 associated with intellectual disability. Patients and Methods:109 patients with intellectual disability. DNA extracted from whole blood samples was tested for purity then MLPA and QF-PCR were performed. Results: We found that 3 of 22 patients with Down syndrome (Trisomy X) and 1 patients with Klinefelter syndrome (47,XXY). MLPA analysis revealed deletions and duplications in 7 patients. Six genetic syndromes were identified, including Cri du chat syndrome, Phelan-Mcdermid syndrome, 1p36 deletion syndrome, Wolf- Hirschhorn syndrome, DiGeorge syndrome, 7q11.23 duplication syndrome. One patient with Fragile X syndrome was identified by QF-PCR. Conclusions: We have successfully applied MLPA and QF-PCR methods in detecting genetic syndromes associated with intellectual disability. More investigations of larger scale need to be done to verify the value of MLPA and QF-PCR in detecting genetic syndromes associated with intellectual disability. Keywords: Intellectual disability, MLPA, QF-PCR, genetic syndromes ĐẶT VẤN ĐỀ Chậm phát triển trí tuệ (CPTTT, chậm phát triển tâm thần, khuyết tật trí tuệ) là một vấn đề đang được quan tâm trong giáo dục và chăm sóc sức khỏe cộng đồng vì tần suất CPTTT khá phổ biến (1-3% dân số) (9). Hơn nữa, sinh bệnh học của CPTTT còn chưa được hiểu rõ, chỉ có khoảng 50% các ca CPTTT được xác định nguyên nhân. Do cơ chế chưa được hiểu rõ, các phương pháp điều trị CPTTT hiện nay rất hạn chế. Nguyên nhân của CPTTT rất đa dạng. Nhờ những thành tựu của y sinh học trong việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh và nhờ sự phát triển của các phương tiện kỹ thuật chẩn đoán, các nguyên nhân mới của CPTTT được phát hiện và bổ sung không ngừng. Đặc biệt nhóm nguyên nhân di truyền bao gồm các bất thường nhiễm sắc thể, đột biến đơn gen và di truyền đa nhân tố là nhóm nguyên nhân quan trọng gây chậm phát triển trí tuệ(5),(6). Các nguyên nhân di truyền gây ra CPTTT có thể kể đến như các rối loạn nhiễm sắc thể (Hội chứng Down, Klinefelter, Turner), các bất thường về gen như hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy (Fragile X syndrome), hội chứng Prader-willi, bệnh phenylketone niệu. Ngoài ra CPTTT di truyền còn do một số đột biến khác như hội chứng Phelan-McDermid (22q13del), hội chứng Mowat-Wilson, hội chứng Cri du chat hay Wolf-Hirschhorn nhưng chiếm tỷ lệ thấp hơn. Trong số đó các bất thường nhiễm sắc thể chiếm 28-40% CPTTT nặng và 4-10% CPTTT nhẹ (4,7,8). Điều đáng lưu ý là CPTTT do nguyên nhân di truyền có nguy cơ di truyền cho thế hệ sau. Do đó, việc chẩn đoán nguyên nhân di truyền ở các bệnh nhân CPTTT có ý nghĩa thực tiễn và nhân văn rất cao, là cơ sở để tư vấn và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có con mắc bệnh. Bên cạnh đó việc xác định được yếu tố di truyền giúp hiểu rõ cơ chế gây bệnh và từ đó xây dựng các biện pháp dự phòng hiệu quả. Để phát hiện các bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như FISH (fluorescence in situ hybridization), microarray, giải trình tự thế hệ mới,MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) và QF-PCR (Quantitative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction). Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng MLPA và QF-PCR là phương pháp dễ dàng, nhanh chóng, hiệu quả, kinh tế và phù hợp trong việc phát hiện các đột biến gây ra các hội chứng di truyền ở bệnh nhân chậm phát triên trí tuệ. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: “Ứng dụng kỹ thuật MLPA và QF-PCR phát hiện các hội chứng di truyền ở bệnh nhân chậm phát triển trí tuệ” ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Nhóm nghiên cứu: 109 học sinh cấp một Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 10 được chẩn đoán chậm phát triển trí tuệ đã qua thăm khám của bác sĩ lâm sàng. - Nhóm chứng: gồm 10 học sinh bình thường, tiền sử gia đình không có ai mắc bệnh di truyền. Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật tách chiết ADN từ 200 μl máu ngoại vi Máu tươi được chống đông bằng EDTA, được tách trong vòng 24 giờ. Quy trình tách chiết ADN từ 200μl máu ngoại vi được tiến hành theo QiAgen Kit. Đo nồng độ và độ tinh sạch của ADN,những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA. Phản ứng QF-PCR phát hiện lệch bội Sử dụng bộ kit thương mại kit QF-PCR Aneufast® (molGENTIX S.L., Tây Ban Nha) chẩn đoán lệch bội NST 13, 18, 21, X, Y. Thành phần phản ứng QF-PCR: 1μL DNA tách chiết, 4μL H2O và 10 μL Multiplex PCR Mix. Sau đó tăng nhiệt độ lên 95°C (15’) và tiến hành thực hiện quy trình nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại: 95°C (40”), 60°C (90”), 72°C (40”) lặp lại 35 chu kỳ. Sau đó kéo dài kết thúc ở 60oC (30’). Cuối cùng, nhiệt độ được hạ xuống còn 4oC. Điện di và phân tích kết quả: Điện di mao quản trên máy ABI 3500. Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.91 (Softgenetics, State College, PA) để phân tích kết quả. Phản ứng MLPA Sử dụng bộ kit thương mại SALSA MLPA P064 Mental Retardation-1 probemix và SALSA MLPA probemix P096-B1 Mental Retardation-2 của MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan. Phản ứng lai: 100 ng genomic ADN (hòa trong 5 μL) được biến tính và lai với 1,5 μL hỗn hợp probe cùng với 1,5 μL buffer MLPA. Sau đó lai ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm). Phản ứng nối: Cho enzyme ligase vào và ủ ở 54°C (15’). Sau đó tăng nhiệt độ lên 98°C (5’) để phá hủy ligase và tiến hành thực hiện quy trình nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại các probe. Khi phản ứng PCR kết thúc, giảm nhiệt độ xuống 40C. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng PCR gồm primer, polymerase, buffer, dNTP, nước. Chu kỳ nhiệt: 90°C (20”), 65°C (80”), lặp lại 35 chu kỳ. Sau đó kéo dài kết thúc ở 720C (20’). Cuối cùng, nhiệt độ được hạ xuống còn 40C. Điện di và phân tích kết quả: Điện di mao quản trên máy Beckman Coulter. Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.92 (Softgenetics, State College, PA) để phân tích kết quả. Phản ứng QF-PCR phát hiện Hội chứng NST X dễ gãy Kỹ thuật QF-PCR sử dụng bộ kit thương mại AmplideXPCR/CE FMR1 củahãng Asuragen bao gồm hai phản ứng PCR thứ nhất là phản ứng PCR đặc hiệu gen sử dụng 1 cặp mồi khuếch đại vùng lặp lại CGG và phản ứng thứ hai là phản ứng PCRCGG RP (CGG Repeat Primed PCR) sử dụng 3 mồi gồm 1 cặp mồi khuếch đại vùng lặp lại CGG và 1 mồi bắt cặp với trình tự lặp lại CGG. Sau khi thực hiện phản ứng luân nhiệt tiến hành điện di và phân tích kết quả: Điện di mao quản trên máy ABI 3500. Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.91(Softgenetics, State College, PA) để phân tích kết quả. Lưu đồ nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 11 KẾT QUẢ Kết quả tách chiết DNA Các mẫu DNA được tách chiết đều có độ tinh sạch cao với tỉ số mật độ quang ở bước sóng 260/280nm đều trong khoảng 1,8 –2,0, nồng độ DNA từ 50 ng/μL đạt yêu cầu để thực hiện các xét nghiệm tiếp theo. Kết quả QF-PCR phát hiện lệch bội NST Sau khi thực hiện phản ứng QF-PCR cho 22 trẻ CPTTT nghi ngờ lệch bội NST, phát hiện được 4 trường hợp bất thường NST chiếm tỷ lệ 18,2%. Xét nghiệm QF-PCR cho 22 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ lệch bội nhân bị đột biến 109 Bệnh nhân CPTTT Xét nghiệm MLPA cho105 bệnh nhân không phát hiện Xét nghiệm QF-PCR chẩn đoán Fragile X cho 98 bệnh nhân không phát hiện đột biến 1 Bệnh nhân bị đột biến Tư vấn di truyền Tư vấn di truyền 7 Bệnh nhân bị đột biến Bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 12 Hình 1:Kết quả QF-PCR bệnh nhân CPT20 Nhận xét: Marker chẩn đoán cho NST giới: marker SRY không có đỉnh, marker AMXY có 1 đỉnh, các marker X22, HPRT, DXYS267 có 2 đỉnh. Kết luận bệnh nhân này có 2 NST X. Marker chẩn đoán cho NST 21: marker D21S1414 và D21S1446 có tỉ lệ 2:1, marker D21S1442 có tỉ lệ 1:1:1. Như vậy có 3 trên 5 marker có tỉ lệ bất thường kết luận bệnh nhân này có 3 NST 21. Bảng 1. Tổng kết các lệch bội bất thường ở trẻ CPTTT Hội chứng Karyotype Số trẻ Hội chứng Down 47,XY,+21 2 (CPT47, CPT90) 47,XX,+21 1 (CPT20) Hội chứng Klinefelter 47,XXY 1 (CPT51) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 13 Nhận xét: Hội chứng Down chiếm đa số trong các trường hợp bất thường karyotype, chiếm 3/4 trường hợp. Có 1 bệnh nhân Klinefelter: 47,XXY chiếm 1/4 trường hợp bất thường karyotype. 18 bệnh nhân còn lại lâm sàng nghi ngờ có trisomie nhưng kết quả QF- PCR không phát hiện bất thường số lượng NST được tiếp tục phân tích gen (phản ứng MLPA) để xác định nguyên nhân gây CPTTT. Kết quả MLPA phát hiện đột biến vi mất đoạn, lặp đoạn Kết quả MLPA phân tích cho thấy 7/105 bệnh nhân có đột biến mất đoạn, lặp đoạn. Sáu hội chứng di truyền đã được xác định, bao gồm hội chứng Cri du chat, hội chứng Phelan- Mcdermid,hội chứng mất đoạn 1p36, hội chứng Wolf-Hirschhorn, hội chứng DiGeorge, hội chứng lặp đoạn 7q11.23. Hình 2: Kết quả MLPA của bệnh nhân CPT64 trên kit SALSA MLPA P064 (1A) và trên kit SALSA MLPA P096 (1B) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 14 Nhận xét: Kết quả của bệnh nhân (CPT64) có đỉnh tín hiệu tương ứng với các gene CLPTM1L, IRX4, TERT ở kit P064 và gene CLPTM1L, PDCD6, TERT ở kit P096 của bệnh nhân chỉ bằng một nửa so với mẫu chứng (DQ ~ 0,5), chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn dị hợp tử ở các gene này. Các gene này đều nằm trên nhiễm sắc thể số 5, vì thế có thể kết luận bệnh nhân mắc hội chứng Cri du chat. Bảng 2: Tổng kết các hội chứng mất đoạn – lặp đoạn NST ở trẻ CPTTT Hội chứng Mất đoạn – lặp đoạn Số trẻ Hội chứng Cri du chat Mất đoạn NST 5p 1 (CPT64) Hội chứng Phelan-McDermid (PMS) Mất đoạn NST 22q13 3 (CPT10, CPT13, CPT29) Hội chứng mất đoạn 1p36 Mất đoạn NST 1p36 1 (CPT26) Hội chứng Wolf-hirschhorn Mất đoạn NST 4p 1 (CPT26) Hội chứng DiGeorge Mất đoạn và lặp đoạn 22q11.21 1 (CPT92) Hội chứng lặp đoạn 7q11.23 Lặp đoạn 7q11.23 1 (CPT25) Nhận xét: Hội chứng Phelan-McDermid chiếm đa số trong các trường hợp mất đoạn – lặp đoạn NST. Bên cạnh đó, nghiên cứu đã phát hiện 2 trường hợp mất đoạn nhiễm sắc thể hiếm gặp đó là trường hợp bệnh nhân CPT26 mất đoạn gene PEX10 nằm ở 1p36.32 và gene WHSC1 nằm ở vị trí 4p16.3, mất đoạn 2 gene này gây ra 2 hội chứng chậm phát triển trí tuệ khác nhau là hội chứng mất đoạn 1p36 và hội chứng Wolf- Hirschhorn. Trường hợp thứ hai là bệnh nhân CPT92 mất đoạn dị hợp tử gene CDC45 và có lặp đoạn dị hợp tử ở gene SNAP29. Cả 2 gene này đều nằm ở vị trí 22q11.21 chứng tỏ bệnh nhân đã mắc một biến thể của hội chứng DiGeorge. Kết quả QF-PCR phát hiện lệch bội NST Chúng tôi đã thực hiện phản ứng QF-PCR chẩn đoán Fragile X cho 95 bệnh nhân còn lại chưa xác định đột biến và đã phát hiện bệnh nhân CPT43 có đột biến gây bệnh Fragile X. Hình 3. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân CPT43 có đột biến Nhận xét: Kết quả QF-PCR có đỉnh tín hiệu kích thước 524 bp tương ứng với số lần lặp lại của bộ ba CGG là 99 lần cao hơn nhiều so với mức bình thường (<40 lần) chứng tỏ bệnh nhân CPT43 mắc bệnh Fragile X. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 15 BÀN LUẬN Trước đây, FISH được sử dụng rất rộng rãi trong các xét nghiệm liên quan đến đột biến trên nhiễm sắc thể và hiện nay một số phòng thí nghiệm vẫn coi đó là tiêu chuẩn vàng cho một số loại bệnh. Tuy nhiên FISH lại là một phương pháp tốn nhiều công lao động, đòi hỏi thời gian và sự tỉ mỉ, không thể tự động hóa được. Thêm vào đó, các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất độc hại. Về mặt hiệu quả của xét nghiệm, FISH có độ nhạy thấp hơn so với MLPA và QF-PCR, kỹ thuật FISH cũng không xác định được các đột biến vi mất đoạn – lặp đoạn. Sử dụng kĩ thuật MLPA và QF-PCR, nghiên cứu đã tập trung vào các nguyên nhân di truyền là bất thường về số lượng và cấu trúc NST, đột biến gen FMR1 trong hội chứng NST X dễ gãy.Tỷ lệ phát hiện nguyên nhân CPTTT trong nghiên cứu này là 11% (12/109) trong đó gồm 4 bệnh nhân lệch bội, 7 bệnh nhân có đột biến mất đoạn/lặp đoạn và 1 bệnh nhân Fragile X. Theo nghiên cứu của Stegmann AP và cộng sự (2008) thực hiện tại Hà Lan sử dụng phương pháp MLPA khảo sát trên 466 bệnh nhân CPTTT đã phát hiện 18 bệnh nhân có đột biến (tỷ lệ 3,9%) trong đó có 3 trường hợp Prader-Willi và 15 trường hợp vi mất đoạn/chuyển đoạn hiếm gặp(2). Tại Iran theo nghiên cứu của Behjati F và cộng sự (2013) sử dụng phương pháp MLPA (bộ kit SALSA P036 và SALSA P070) khảo sát trên 100 bệnh nhân CPTTT đã phát hiện 9 bệnh nhân có đột biến (tỷ lệ 9%) (3). Theo nghiên cứu của Sireteanu A và cộng sự (2014) thực hiện tại Romani sử dụng phương pháp MLPA khảo sát trên 358 bệnh nhân CPTTT đã phát hiện 38 bệnh nhân có đột biến (tỷ lệ 10,6%)(1). Như vậy, tỷ lệ phát hiện nguyên nhân CPTTT trong nghiên cứu này cũng không khác biệt nhiều so với các nghiên cứu khác trên thế giới, thậm chí tỷ lệ đột biến của chúng tôi còn cao hơn một số nghiên cứu điều này được giải thích do chúng tôi đã kết hợp 2 phương pháp là MLPA và QF-PCR là hai kĩ thuật hết sức tiên tiến đang được áp dụng để chẩn đoán nguyên nhân di truyền của CPTTT hiện nay. Bên cạnh đó, đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là học sinh đang học cấp 1 tại TP.HCM, ở lứa tuổi này một số trẻ chưa được phát hiện và điều trị kịp thời. Kết quả nghiên cứu cho thấy các trường hợp chậm phát triển trí tuệ có nguyên nhân di truyền chiếm một tỷ lệ đáng kể, do nhiều hội chứng di truyền khác nhau gây ra và phương pháp MLPA phối hợp với QF-PCR có tiềm năng ứng dụng cao giúp chẩn đoán các hội chứng di truyền này. KẾT LUẬN Chúng tôi đã thành công trong việc ứng dụng MLPA và QF-PCRphát hiện các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ. Cần tiếp tục nghiên cứu trên nhiều bệnh nhân nữa nhằm khẳng định giá trị của MLPA và QF-PCR trong phát hiện và xác định đặc trưng những trường hợp chậm phát triển trí tuệ do những hội chứng di truyền hiếm gặp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adriana S, Roxana P, et al(2014) "Detection of chromosomal imbalances using combined MLPA kits in patients with syndromic intellectual disability". Romanian Review of Laboratory Medicine, 22 (2), 157-164. 2. Stegmann A, Jonker L, Engelen J (2008) "Prospective screening of patients with unexplained mental retardation using subtelomeric MLPA strongly increases the detection rate of cryptic unbalanced chromosomal rearrangements". European journal of medical genetics, 51 (2), 93-105. 3. Behjati F, Firouzabadi S, Sajedi F, Kahrizi K (2013) "Identification of chromosome abnormalities in subtelomeric regions using Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) Technique in 100 Iranian patients with idiopathic mental retardation". Iranian Red Crescent Medical Journal, 15 (10) 4. Ghosh K, Gorakshakar A (2009) "Genetics of autism and mental retardation: A spoonful from the sea!". Indian journal of human genetics, 15 (3), 85. 5. R Matilainen, Airaksinen E, T Mononen, K Launiala, R Kääriäinen (1995) "A population‐based study on the causes of mild and severe mental retardation". Acta Paediatrica, 84 (3), 261-266. 6. Rauch A, et al. (2012), "Range of genetic mutations associated with severe non-syndromic sporadic intellectual disability: an exome sequencing study", The Lancet, 380(9854), pp. 1674- 1682. 7. Slavotinek A, et al. (1999), "Screening for submicroscopic chromosome rearrangements in children with idiopathic mental retardation using microsatellite markers for the chromosome telomeres", Journal of medical genetics, 36(5), pp. 405-411. 8. Thomas F Boat, Joel T Wu (2015) Mental disorders and Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 16 disabilities among low-income children, National Academies Press. 9. World Health Organization (2001) Burden of mental and behavioural disorders. The world health report 2001: Mental health: New understanding, new hope. Ngày nhận bài báo: 07/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/04/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017