Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS trong chẩn đoán rối loạn phát triển giới tính do thiếu enzym 5α-reductase type 2

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 445 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG GC-MS TRONG CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN PHÁT TRIỂN GIỚI TÍNH DO THIẾU ENZYM 5α-REDUCTASE TYPE 2 Trần Thị Ngọc Anh*, Trần Thị Chi Mai**, Nguyễn Việt Hoa*, Trần Minh Điển***, Vũ Chí Dũng***, Greaves F. Ronda**** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Thiếu enzym 5α-reductase type 2 là một trong hai nguyên nhân thường gặp gây rối loạn phát triển giới tính ở nam giới cần được chẩn đoán sớm. Mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, kết quả phân tích steroid niệu của 12 bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 được chẩn đoán dựa trên kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS). Phương pháp nghiên cứu: Định lượng steroid trong mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của 30 bệnh nhân mắc rối loạn phát triển giới tính trong năm 2016 - 2018 bằng kỹ thuật GC-MS. Kết quả: 12 bệnh nhân nam được chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 bằng kỹ thuật định lượng steroid niệu với đặc trưng là tỷ lệ 5α-THF/THF thấp. Các dấu hiệu lâm sàng điển hình ở bệnh nhân 5α-reductase type 2 như dương vật nhỏ, lỗ đái thấp thể nặng, bìu chẻ đôi. Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS giúp chẩn đoán 12 bệnh nhân mắc rối loạn phát triển giới tính thể thiếu enzym 5α-reductase type 2. Từ khóa: Rối loạn phát triển giới tính, thiếu 5α-reductase type 2, GC-MS. ABSTRACT APPLICATION OF GC-MS URINE STEROID METABOLOME IN DIAGNOSIS OF SEXUAL DEVELOPMENT DUE TO DEFICIENCY OF ENZYME 5α-REDUCTASE TYPE 2 Tran Thi Ngoc Anh, Tran Thi Chi Mai, Nguyen Viet Hoa, Tran Minh Đien, Vu Chi Dung, Greaves F. Ronda * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 445-451 Background: The deficiency of enzyme 5α-reductase type 2 is one of the two most common reasons causing 46, XY disorders of sexual development (DSD) in man which needs to be early diagnosed. Objectives: To describe clinical signs, biochemical and urinary steroid profiling of twelve patients with 5α- reductase type 2 deficiency diagnosed by gas chromatography- mass spectrometry (GC-MS) urine steroid analysis. Materials and methods: Random urine samples of 30 DSD patients in the period 2016-2018 were quantitated their steroid composition by GC-MS. The clinical and biochemical features of the twelve patients were also observed and described. Results: Among patients with DSD, twelve were diagnosed with 5α-reductase type 2 deficiency by GC-MS urinary steroid analysis. The 5α-THF/THF ratios of these patients were low. The clinical signs include: bifid scrotum, hypospadias servere, micropenis. The characteristic pattern of GC-MS urine steroid profiling helped to * Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, ** Trường Đại học Y Hà Nội, *** Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học RMIT – Australia Tác giả liên lạc: BS Trần Thị Ngọc Anh, ĐT: 0904395444, Email: ngocanhbm@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 446 confirm the diagnosis of 5α-reductase type 2 deficiency in these twelve DSD patients. Conclusions: For the first time in Viet Nam, twelve patients with DSD were diagnosed with 5α-reductase type 2 deficiency by GC-MS urine steroid analysis. Keywords: Disorders of sexual development (DSD), 5α-reductase type 2 deficiency, GC-MS. ĐẶT VẤN ĐỀ Enzym 5α-reductase xúc tác phản ứng khử liên kết đôi giữa C4-C5 của vòng A nhân sterol trên một số cơ chất trong đó có testosterone thành 5α-dihydrotestosterone (5α-DHT) - chất có tác dụng mạnh hơn testosterone hơn 10 lần trên thụ thể của androgen. Thiếu enzym 5α- reductase type 2 là bệnh lý di truyền do đột biến gen SRD5A2 trên nhiễm sắc thể số 2 (2p23), gây giảm một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính của enzym 5α-reductase. Đặc điểm lâm sàng nổi bật ở bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 là dấu hiệu nữ hóa ở trẻ nam mang nhiễm sắc thể 46, XY như bộ phận sinh dục không phân biệt được nam và nữ với dương vật nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp, ẩn tinh hoàn(5). Thiếu enzym 5α-reductase type 2 là bệnh hiếm gặp, một số nước có tần xuất mắc cao hơn như Dominica, Thổ Nhĩ Kỳ và Lebanon, Hy Lạp(8). Định lượng steroid niệu bằng GC-MS được sử dụng trên thế giới như một tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng thiếu hụt bẩm sinh các enzym tham gia tổng hợp hormon steroid trong đó có thiếu 5α-reductase type 2(5,7). Phân tích đột biến gen SRD5A2 được sử dụng để khẳng định thiếu hụt 5α-reductase type 2(4,5). Một số ca lâm sàng thiếu enzym 5α-reductase type 2 được công bố với các triệu chứng thường gặp như dương vật nhỏ, lỗ đái thấp, bìu chẻ đôi, ẩn tinh hoàn, nữ hóa(4,5,8). Các đặc trưng về định lượng steroid niệu bằng GC-MS được công bố ở bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 là tỷ lệ 5α- THF/THF (THF: tetrahydrocortisol), An/Et (Androsterone/Etiocholanolone), 11-OH An/11- OH Et và 5α-THB/THB (THB: tetrahydrocorticosterone) thấp hơn so với giá trị tham chiếu(3,5,9). Tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức và bệnh viện Nhi trung ương, có nhiều bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh và rối loạn phát triển giới tính nhưng chỉ một số rất ít bệnh nhân được chẩn đoán xác định thiếu enzym 5α- reductase type 2 nhờ gửi mẫu làm phân tích gen tại nước ngoài. Mục tiêu Mô tả đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và kết quả phân tích steroid niệu của 12 bệnh nhân mắc thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 được phát hiện bằng định lượng steroid niệu theo phương pháp GC-MS. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nhóm bệnh Tiêu chuẩn lựa chọn Bệnh nhân nam rối loạn phát triển giới tính theo phân loại Chicago 2006(6) gồm bệnh nhân bộ phận sinh dục không rõ ràng, không phân biệt nam và nữ; bệnh nhân bất thường về giải phẫu cơ quan sinh dục trong và ngoài; bệnh nhân phát triển không hoàn toàn về giải phẫu tuyến sinh dục. Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân nữ, bệnh nhân đã chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh. Thời gian lấy mẫu Từ tháng 1/2016 đến 5/2018. Địa điểm lấy mẫu Khoa Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền của bệnh viện Nhi Trung ương và khoa phẫu thuật Nhi – bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức. Nhóm chứng 103 trẻ nam khỏe mạnh trong cộng đồng có độ tuổi từ 3 tháng đến 12 tuổi, tương ứng với nhóm bệnh để xây dựng khoảng tham chiếu steroid niệu giúp chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2 (sử dụng trong Bảng 3). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 447 Mẫu bệnh phẩm Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên, thể tích >3 mL bảo quản ở -200C đến khi phân tích. Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang hàng loạt ca bệnh. Thiết kế nghiên cứu Thăm khám lâm sàng các triệu chứng lâm sàng về đặc điểm giới tính (bộ phận sinh dục). Làm xét nghiệm bộ nhiễm sắc thể. Định lượng FSH, LH, testosterone trên hệ thống miễn dịch tự động Roche Cobas e601. Định lượng steroid niệu cho tất cả các mẫu nước tiểu của trẻ khỏe mạnh và bệnh nhân mắc rối loạn phát triển giới tính. Xây dựng khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ em bình thường về tỷ lệ 5α-THF/THF, An/ Et từ 103 trẻ nam khỏe mạnh. Trong đó THF, 5α-THF là sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu của cortisol, An và Et là sản phẩm chuyển hóa của testosterone và 5α- dihydrotestosterone trong nước tiểu. So sánh kết quả bệnh nhân nam, mắc rối loạn phát triển giới tính với khoảng tham chiếu, phát hiện các trường hợp có tỷ lệ 5α-THF/THF, tỷ lệ An/ Et thấp hơn là những trẻ có nguy cơ mắc thiếu hụt 5α-reductase type 2 (theo nghiên cứu của O.K. Chan và cộng sự)(4,5). Tách chiết DNA phân tích đột biến gen SRD5A2 để khẳng định chẩn đoán khi có thể. (Hiện tại 7 bệnh nhân đã được phân tích gen SRD5A2, 7/7 bệnh nhân có đột biến gây bệnh). Trang thiết bị Hệ thống GC-MS của Agilent. Tủ lạnh, thiết bị làm khô bằng khí nitơ, tủ ấm, và các trang thiết bị cơ bản của phòng xét nghiệm. Hóa chất: enzym glucuronidase, TMSI, methoxyamin, vitamin C, acetat, HCl, Iso-octan của hãng Merck, Sigma Aldrich, Kura. Quy trình định lượng steroid niệu bằng GC-MS Thủy phân steroid niệu liên hợp bằng enzym glucuronidase và arylsulphatase. Tách chiết steroid tự do bằng cột Bond-Elut C18. Làm khô hoàn toàn dung dịch sau tách chiết bằng khí ni tơ. Tạo dẫn xuất oxim methylsilyl bằng methoxyamine/pyridine 3%. Tạo dẫn xuất trimethylsylil bằng trimethylsylin imidazol (TMSI). Tách chiết mẫu steroid bằng Iso-octan, mẫu được phân tích trên máy GC-MS 7890A của hãng Agilent. Xây dựng đường chuẩn từ mẫu chuẩn steroid được phân tích cùng mẫu bệnh, áp dụng phần mềm Chem Station để tính nồng độ các steroid niệu cở mẫu bệnh dựa vào đường chuẩn. Kỹ thuật có độ lặp lại CV đạt 1,01-7,72(%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở mẫu bệnh lý. Độ tái lặp CV đạt 10,16-14,53(%) ở mẫu bình thường và 12,51-16,95(%) ở mẫu bệnh lý. Giới hạn định lượng 0,05 - 0,27(µmol/L) và độ thu hồi của các sản phẩm chuyển hoá steroid đạt 90-115(%)(3). Kết quả định lượng steroid niệu được tính ra đơn vị µmol/L và µmol/mmol creatinine. Đạo đức y học Đề tài được hội đồng đạo đức y học trường Đại học Y Hà Nội thông qua, và được sự đồng ý của người bệnh/gia đình người bệnh. Xử lý số liệu Bằng phần mềm thống kê Excel, SPSS, tính giá trị khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán 5α- THF/THF và An/Et. Tính giá trị 5α-THF/THF và An/Et ở bệnh nhân và so sánh với khoảng tham chiếu xây dựng được từ 103 trẻ nam bình thường. KẾT QUẢ Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 Trong số 30 bệnh nhân rối loạn phát triển giới tính làm định lượng steroid niệu có 12 bệnh nhân nghi ngờ mắc thiếu enzym 5-reductase type 2 có đặc điểm lâm sàng được thể hiện trong Bảng 1. 12/12 bệnh nhân là nam có bộ nhiễm sắc thể 46, XY, không phát hiện bất thường về mặt nhiễm sắc thể. Dấu hiệu lâm sàng không phân biệt được nam và nữ ngay từ khi mới sinh khiến 6/12 bệnh nhân được cho là nữ. Hiện tại, các bệnh nhân đều có dương vật nhỏ hơn nhiều so Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 448 với tuổi, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp ở gốc dương vật, 1/12 bệnh nhân ẩn tinh hoàn một bên (bệnh nhân số 4). Bốn bệnh nhân là anh em trong hai gia đình, bệnh nhân số 7 và 10 là hai anh em ruột, bệnh nhân số 8 và 9 là anh em ruột, 8 bệnh nhân còn lại trong gia đình chỉ có chị gái, em gái không phát hiện bất thường về rối loạn phát triển giới tính. Hai bệnh nhân 11 và 12 chưa xuất hiện dấu hiệu dậy thì mặc dù đã 13 tuổi. Bệnh nhân số 6 chưa làm xét nghiệm. Nồng độ testosterone và LH cao ở bệnh nhân số 4. Nồng độ FSH của 12/12 bệnh nhân trong giới hạn bình thường (Bảng 2). Kết quả định lượng steroid niệu bằng GC-MS 12/12 bệnh nhân có tỷ lệ 5α-THF/THF thấp hơn khoảng tham chiếu (Bảng 3). Tỷ lệ An/Et thấp ở 6 bệnh nhân có độ tuổi 6-13, tỷ lệ An/Et không xác định ở bệnh nhân dưới 6 tuổi do nồng độ An và Et dưới giới hạn định lượng. Bảng 1: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 Bệnh nhân Họ và tên NST Thời điểm có dấu hiệu Lâm sang Thời điểm GC-MS 1 Đỗ Đăng Qu 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật rất nhỏ 0,5cm, lỗ đái thấp 6 tháng 2 Nguyễn Gia B 46, XY Khi sinh Dương vật <1cm, lỗ đái thấp, bìu chẻ đôi giống với nữ. 2 tuổi 3 Nguyễn Viết H 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật nhỏ <1cm, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp. 4 tuổi 4 Phạm Thanh Ph 46, XY Khi sinh Dương vật <1cm, lỗ đái thấp, bìu chẻ đôi, ẩn tinh hoàn trái. 2 tuổi 5 Đinh Xuân C 46, XY Khi sinh Dương vật nhỏ, lỗ đái thấp 5 tuổi 6 Lê Công Trí Ngh 46, XY Khi sinh Dương vật nhỏ, lỗ đái thấp ở gốc dương vật 5 tuổi 7 Trần Nguyễn H 46, XY Khi sinh Dương vật nhỏ, lỗ đái thấp thể gốc dương vật, bìu chẻ đôi 6 tuổi 8 Đỗ Tiến Thg 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp. 5 tuổi 9 Đỗ Tiến Th 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp. 8,5 tuổi 10 Trần Anh V 46, XY Khi sinh Dương vật nhỏ, lỗ đái thấp thể nặng ở gốc dương vật 11 tuổi 11 Nguyễn Đức A 46, XY Khi sinh Ngoại hình nam, dương vật ngắn <2cm, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp. 13 tuổi 12 Vi Thị Th 46, XY Khi sinh Ngoại hình nữ, dương vật teo nhỏ <1cm, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp. 12,3 tuổi Bảng 2: Đặc điểm xét nghiệm bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 Bệnh nhân Tuổi Testosterone (nmol/L) FSH (IU/L) LH (IU/L) BN Tham chiếu (*) BN Tham chiếu (*) BN Tham chiếu (*) 1 6 tháng 0,282 < 0,70 0,67 < 4,0 0,909 <0,02- 5,0 2 2 tuổi < 0,087 < 0,70 0,403 < 4,0 < 0,1 <0,02- 0,50 3 4 tuổi < 0,087 < 0,70 0,84 < 4,0 <0,1 < 0,02-0,50 4 2 tuổi 6,1 < 0,70 1,26 < 4,0 3,1 <0,02 0,50 5 5 tuổi < 0,087 < 0,70 0,56 < 4,0 0,04 <0,02- 0,50 7 5 tuổi < 0,087 < 0,70 0,71 < 4,0 0,02 < 0,02-0,50 8 6 tuổi < 0,087 < 0,70 1,04 < 4,0 0,223 <0,02- 0,50 9 5 tuổi < 0,087 < 0,70 1,49 0,3 -10,0 0,358 < 0,02-3,6 10 8,5 tuổi < 0,087 <0,07 – 4,51 2,02 0,3 -10,0 0,09 0,1- 5,7 11 11 tuổi 6,63 0,07 – 27,26 5,45 0,3 -10,0 1,26 0,1 -5,7 12 13 tuổi < 0,087 0,07 – 27,26 2,38 0,3 -10,0 0,519 0,1 -5,7 * Giá trị tham chiếu của Mayo Clinic (Mayo medical laboratories) cho trẻ em. Bảng 3: Steroid niệu ở bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 Bệnh nhân Tuổi THF (µmol/L) 5α-THF (µmol/L) Tỷ lệ 5α-THF/THF An (µmol/L) Et (µmol/L) Tỷ lệ An/Et BN Tham chiếu BN Tham chiếu 1 6 tháng 0,18 0,02 0,11 0,30-10,8 KXĐ KXĐ - 2 2 tuổi 0,39 0,05 0,13 0,42-4,1 KXĐ KXĐ - 3 4 tuổi 1,87 0,1 0,05 0,42-4,1 KXĐ KXĐ - 4 2 tuổi 10,19 0,1 0,01 0,42-4,1 KXĐ KXĐ - Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 449 Bệnh nhân Tuổi THF (µmol/L) 5α-THF (µmol/L) Tỷ lệ 5α-THF/THF An (µmol/L) Et (µmol/L) Tỷ lệ An/Et BN Tham chiếu BN Tham chiếu 5 5 tuổi 4,26 0,10 0,02 0,42-4,1 KXĐ KXĐ - 6 5 tuổi 0,79 0,1 0,13 0,42-4,1 KXĐ KXĐ - 7 6 tuổi 3,0 0,1 0,03 0,42-4,1 0,1 0,25 0,4 >1,0 8 5 tuổi 5,33 0,13 0,02 0,42-4,1 0,1 0,28 0,36 >1,0 9 8,5 tuổi 2,73 0,1 0,04 0,20-2,6 0,1 0,34 0,29 1,0-2,8 10 11 tuổi 1,94 0,1 0,05 0,20-2,6 0,24 1,21 0,20 11 13 tuổi 6,89 0,29 0,04 0,20-2,6 2,76 7,84 0,35 12 13 tuổi 1,93 0,1 0,05 0,20-2,6 0,1 0,36 0,17 KXĐ: không xác định do nồng độ thấp dưới giới hạn phát hiện. BN: kết quả của bệnh nhân. Tham chiếu: giá trị tham chiếu xây dựng được từ 103 trẻ nam bình thường từ 3 tháng đến 12 tuổi tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương. Sắc ký đồ mẫu bình thường Sắc ký đồ (hình 1) có các đỉnh xuất hiện lần lượt theo thứ tự thời gian lưu tăng dần trong đó đỉnh THF (10) và 5α-THF (11) rất rõ trên sắc ký đồ và so với chuẩn nội. A1: Nội chuẩn Androstanol 8: Androstentriol (A3) 1: Androsterone (An) 9: Tetrahydrocortisone (THE) 2: Etiocholanolone (Et) 10: Tetrahydrocortisol (THF) 3: Dehyroepiandrosterone (DHEA) 11: 5α-tetrahydrocortisol (5α-THF) 4: 11 Keto-androsterone (11-Keto An) 12: α-Cortolone 5: 11-hydroxy androsterone (11-OH An) 13: β-Cortol 6: Pregnanediol (PD) 14: β-Cortolone 7: Pregnanetriol (PT) 15: α-Cortol X: là chất chưa xác định, không phải sản phẩm cần định lượng Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ bệnh nhân thiếu 5 α- reductase type 2 Hình 2: Mẫu bình thường Hình 2 Mẫu bình thường có đỉnh THE và THF, 5α-THF rất rõ. Hình 3: Mẫu thiếu 5α-reductase type 2 Hình 3 Mẫu thiếu 5α-reductase có đỉnh THE và THF rất rõ trong khi đỉnh 5α-THF rất thấp. Đỉnh 5α-THF thấp hơn rất nhiều so với THF, trong khi các sản phẩm chuyển hóa cortisol như THE, THF, cortolone và cortol bình thường. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 450 Hình ảnh bộ phận sinh dục trẻ mắc thiếu enzym 5α-reductase type 2 Hình 4: Bộ phận sinh dục bệnh nhân số 2 Hình 4 bộ phận sinh dục trẻ nam, 3 tuổi gần giống với bộ phận sinh dục nữ, dương vật nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp, không có bìu rõ ràng. Hình 5: Bộ phận sinh dục bệnh nhân số 12 Hình 5 bộ phận sinh dục trẻ nam, 12,3 tuổi có dương vật teo nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp ở gốc dương vật. Chưa mọc lông mu, chưa có dấu hiệu dậy thì. BÀN LUẬN Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS để chẩn đoán thiếu enzym 5α-reductase type 2 nhờ mẫu hình sắc ký đồ đặc trưng và tỷ lệ chẩn đoán đặc hiệu. Ở Việt Nam, kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC-MS được ứng dụng để chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase(2). Đặc điểm lâm sàng 12/12 bệnh nhân có dấu hiệu là bộ phận sinh dục không rõ ràng ngay từ khi sinh do dương vật rất nhỏ, bìu chẻ đôi, lỗ đái thấp gần giống bộ phận sinh dục nữ. Ngoại hình 11/12 bệnh nhân là nam và 1/12 bệnh nhân là nữ mặc dù nhiễm sắc thể của 12 bệnh nhân là 46, XY. Do thiếu hụt enzym 5α-reductase type 2 nên testosterone không chuyển thành 5α-DHT có tác dụng mạnh hơn nhiều lần so với testosterone trên thụ thể của androgen tại tuyến tiền liệt, bộ phận sinh dục nam. Cả testosterone và 5α-DHT gây ra các dấu hiệu nam hóa và phát triển các đặc tính sinh dục phụ khi dậy thì. Bệnh nhân thiếu 5α- reductase type 2 có nồng độ 5α-DHT thấp nên các dấu hiệu nam hóa không hoàn toàn, tinh hoàn không xuống bìu, dương vật nhỏ kém phát triển, chậm hoặc không có dấu hiệu dậy thì như mọc lông mu, mùi cơ thể, thay đổi giọng nói, cơ bắp phát triển. Đặc điểm xét nghiệm Ở bảng 2 cho thấy nồng độ testosterone, LH cao ở 2/12 bệnh nhân, trong khi đó nồng độ FSH trong giới hạn bình thường ở 12/12 bệnh nhân. Tuy nhiên, có 2 bệnh nhân nam 12-13 tuổi nhưng các đặc tính sinh dục phụ thứ phát chưa xuất hiện như mọc lông mu, có mùi cơ thể, giọng nói thay đổi. Các xét nghiệm hormon trong máu thay đổi không đặc hiệu trong thiếu enzym 5α- reductase type 2 ở trẻ em. Đặc điểm phân tích steroid niệu bằng sắc ký khí khối phổ Mẫu hình sắc ký đồ trẻ khỏe mạnh hình 1 không có đỉnh bất thường, hai đỉnh THF và 5α- THF rõ ràng với cường độ tín hiệu ít chênh lệch hay 5α-THF thường cao bằng hoặc hơn THF. Trong khi đó tất cả 12/12 bệnh nhân thiếu 5α- reductase type 2 đều có mẫu hình sắc ký đồ với đỉnh 5α-THF thấp hơn rõ rệt so với THF tương tự công bố các tác giả trên thế giới(5,8). Điển hình là trong Hình 2 sắc ký đồ bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2 (bệnh nhân 12) với đặc trưng là đỉnh 5α-THF thấp hơn rất nhiều so với THF, đồng thời đỉnh An cũng thấp hơn đỉnh Et. Ở bệnh nhân thiếu 5α- reductase type 2 còn có thể có tỷ lệ An/Et, 5α- THB/THB thấp tuy nhiên chúng tôi chưa định lượng được THB và 5 α-THB. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 451 Bảng 2 cho thấy nồng độ THF bình thường và 5α-THF rất thấp ở 12/12 bệnh nhân. Nồng độ androsterone và etiocholanolone rất thấp dưới giới hạn phát hiện ở 6 bệnh nhân từ 1 đến 6 do bệnh nhân còn nhỏ có nồng độ testosterone máu thấp nên sản phẩm chuyển hóa của testosterone trong nước tiểu rất thấp. Bệnh nhân 4, 5, 6, 7 có nồng độ androsterone thấp và etiocholanolone cao hơn androsterone. Tỷ lệ 5α-THF/THF thấp ở các bệnh nhân phù hợp với tiêu chuẩn chẩn đoán mà Angle On Kie Chan và cộng sự mô tả(3,4). Tỷ lệ An/Et thấp ở 6 bệnh nhân từ 6-13 tuổi, tỷ lệ An/Et thấp được các tác giả thấy ở bệnh nhân thiếu 5α-reductase type 2, tuy nhiên OK Chan nhận thấy ở trẻ < 3 tháng tuổi khi các sản phẩm chuyển hóa steroid rất thấp thì không sử dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu trong chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2. Có thể sử dụng tỷ lệ An/Et, 5α-THF/THF và 5α-THB/THB để chẩn đoán thiếu hụt 5α-reductase type 2 tuy nhiên tỷ lệ 5α-THF/THF thường được sử dụng nhiều nhất và giúp phân biệt rối loạn phát triển giới tính do không nhạy cảm với androgen. Tại Hồng Kông từ 2003-2011 có 16 bệnh nhân được chẩn đoán thiếu 5α-reductase type 2 bằng kỹ thuật GC-MS và phân tích gen(4). Tại Indonesia, năm 2003 một ca lâm sàng thiếu 5α- reductase type 2 đầu tiên được công bố dựa vào đo nồng độ testosterone và 5α-DHT trước và sau test kích thích bằng hCG(8). Tại Việt Nam, đây là 12 trường hợp thiếu 5α-reductase type 2 đầu tiên được công bố dựa vào kết quả định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật GC-MS. Việc chẩn đoán 5α-reductase type 2 sẽ giúp các bác sỹ tiên lượng và điều trị hiệu quả hơn. KẾT LUẬN 12 bệnh nhân nghi ngờ mắc thiếu enzym 5α- reductase type 2 có đặc điểm: Lâm sàng: bệnh nhân nam, nhiễm sắc thể 46, XY. Bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng với dương vật nhỏ, lỗ đái thấp ở gốc dương vật, bìu chẻ đôi. Nồng độ hormon testosterone, FSH, LH bình thường ở 11/12 bệnh nhân, một bệnh nhân có nồng độ testosterone và LH cao. Định lượng steroid niệu bằng GC-MS có tỷ lệ 5α-THF/THF thấp ở 12/12 bệnh nhân và tỷ lệ An/Et thấp ở 6 bệnh nhân > 6 tuổi so với khoảng tham chiếu. Lời cảm ơn: Chúng tôi xin cảm ơn Ban giám đốc bệnh viện Nhi trung ương, khoa xét nghiệm Hóa sinh, khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền bệnh viện Nhi. Xin cảm ơn khoa phẫu thuật Nhi – bệnh viện HN Việt Đức, tổ chức Thiện Nhân và những người bạn đã cùng thực hiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển (2017). Thẩm định quy trình định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ. Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 21: 73-78. 2. Trần Thị Ngọc Anh, Trần Thị Chi Mai, Trần Minh Điển, Vũ Chí Dũng (2017). Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ trong chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tạp chí Y học Việt Nam, tập 458: 75- 84. 3. Angela K Lucas-Herald (2015). The pitfalls associated with urinary steroid metabolite ratios in children undergoing investigations for suspected disorders of steroid synthesis, Int J Pediatr Endocrinol: 1-10. 4. Chan AO, Shek CC (2012). Urinary steroid profiling in the diagnosis of congenital adrenal hyperplasia and disorders of sex development: Experience of a urinary steroid referral centre in Hong Kong. Clinical Biochemistry 46: 327-334. 5. Chan AO, But BW, Lee CY, Lam YY, Ng KL, Tung JY, Kwan EY, Chan YK, Tsui TK, Lam AL, Tse WY, Cheung PT, Shek CC (2013). Diagnosis of 5α-reductase type 2 deficiency: is measurement of dihydrotestosterone essential? Clinical Chemistry 59:798-806. 6. Clinical Guidelines for the Management of Disorders of sex development in childhood. Copyright 2006 Intersex society of North America. 7. Imperato McGinley J, Gautier T, Peterson RE, Shackleton C (1986). The prevalance of 5 α-reductase deficiency in children with ambiguous genitalia in the Domenican Republic. J Urol 136:867. 8. Odame I, Donaldson MDC, Wallace AM, Cochran W, Smith PJ (1992). Early diagnosis and management of 5α-reductase deficiency. Archives of Disease Childhood: 67: 720-723. 9. Krone N, Beverly AH, Gareth GL, Paul MS, Arlt W and Shackleton CHL (2010). Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) remains a preeminent discovery tool in clinical steroid investigations even in the era of fast liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). J Steroid Biochem Mol Biol 121, 496-504. Ngày nhận bài báo: 08/11/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 04/12/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019