Ứng dụng kỹ thuật chuỗi polymerase (pcr) phát hiện một số loài bifidobacterium trong thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung - Ngô Thanh Phong

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 625 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN MỘT SỐ LOÀI BIFIDOBACTERIUM TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG VÀ THỰC PHẨM BỔ SUNG Ngô Thanh Phong* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Hiện nay, việc định danh một số loài Bifidobacterium spp. trong thực phẩm chức năng và bổ sung bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống còn hạn chế. Phương pháp PCR được đề xuất để nghiên cứu triển khai định danh một số loài Bifidobacterium spp. trong thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung. Mục tiêu: Khảo sát các thông số của qui trình PCR để phát hiện 4 loài Bifidobacterium trong thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát quy trình tách chiết; khảo sát độ đặc hiệu của mồi; tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR; khảo sát mức phát hiện LOD50 ; ứng dụng quy trình phân tích một số mẫu thực tế. Kết quả: Chúng tôi đã lựa chọn được 5 cặp mồi đặc hiệu trong đó có 4 cặp mồi phát hiện 4 loài Bifidobacterium bao gồm B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. lactis LOD50 của các qui trình PCR để phát hiện các loài Bifidobacterium spp. đều ở mức thấp (dưới 2 CFU/g) bao gồm: mẫu thực phẩm chức năng từ 1 CFU/g (B. bifidum, B. lactis) đến 1,4 CFU/g (B. breve, B. animalis); từ 1 CFU/g (B. animalis, B. breve) đến 1,3 CFU/g (B. lactis, B. bifidum) trong nền mẫu thực phẩm bổ sung. Phương pháp có độ chọn lọc tốt, chỉ phát hiện đặc hiệu trên chủng mục tiêu. Kết luận: quy trình PCR này có thể áp dụng để phát hiện 4 loài vi khuẩn Bifidobacterium trong thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung. Từ khóa: bifidobacterium, phản ứng PCR, probiotic ABSTRACT APPLICATION OF POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD TO IDENTIFY SOME BIFIDOBACTERIUM SPECIES IN FUNCTIONAL FOODS AND DIETARY SUPPLEMENTS Ngo Thanh Phong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 625 – 632 Background: Currently, traditional methods to identify Bifidobacterium species are limited and methods based on molecular biology are considered potential solutions. PCR method was proposed to study and identify some Bifidobacterium species in dietary supplements and function foods. Objectives: Develop PCR method to identify 4 Bifidobacterium species in functional foods and dietary supplements. Methods: Select the extraction procedures; assess the primers’ specificity; optimize PCR conditions; survey the detection level (LOD50) of the method; apply method to analyse samples. Results: 5 specific primers were selected for identification 4 Bifidobacterium species, including: B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. lactis. The detection levels (LOD50) of these PCR methods are low (below <2 CFU/g): in powdered funtional food: LOD50 ranges from 1 CFU / g (B. bifidum, B. lactis) to 1,4 CFU/g (B. breve, B. animalis); In the form of dietary supplements, LOD50 ranges from 1 CFU/g (B. animalis, B. breve) to 1,3 CFU/g *Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: KS. Ngô Thanh Phong ĐT: 0834001666 Email: ngothanhphong@iph.org.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 626 (B. lactis, B. bifidum). The methods had good selectivity, and could be applied to analyse on actual samples. Conclusions: The PCR methods can be applied to detect 4 Bifidobacterium species in functional foods and dietary supplements in our microbiological laboratory. Keywords: bifidobacterium, polymerase chain reaction, probiotic ĐẶT VẤN ĐỀ Bifidobacterium spp. chiếm tới 3% trong tổng số vi khuẩn đường ruột của người lớn và đặc biệt ở trẻ nhỏ thì vi khuẩn Bifidobacterium spp. chiếm tỉ lệ đa số trong tổng số vi khuẩn đường ruột. Một số loài Bifidobacterium spp. theo tiêu chuẩn GRAS được FDA công bố các chủng được phép bổ sung vào thực phẩm chức năng như B. longum, B. breve, B. lactis, B. bifidum, B. animalis(7). Hiện nay, các phương pháp vi sinh truyền thống nhằm xác định sự hiện diện Bifidobacterium spp. còn hạn chế, trong đó phương pháp ISO 29981:2010 chỉ có thể xác định được tổng số Bifidobacterium spp. trong mẫu thực phẩm nhưng không thể xác định được tên loài Bifidobacterium sp. Ngoài ra, việc xác định các chủng Bifidobacterium spp. bằng nuôi cấy truyền thống (lên men carbohydrate và hoạt động enzyme) giữa các loài Bifidobacteria như B. longum, B. infantis, B. animalis hoặc B. lactis có độ tin cậy tương đối thấp(1). Bên cạnh đó, phương pháp sinh học phân tử phát hiện bằng kiểu gen có độ chính xác cao ngày càng được ứng dụng rộng rãi để định danh các loài Bifidobacteria bao gồm: PCR, mulitiplex-PCR, giải trình tự. Tuy nhiên, PCR là phương pháp sinh học phân tử phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại nhiều phòng thí nghiệm vi sinh tại Việt Nam. Nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm xác định các loài Bifidobacterium thường bổ sung vào thực phẩm chức năng cũng như thực phẩm bổ sung, chúng tôi thực hiện nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR để phát hiện một số loài Bifidobacterium thường gặp trong thực phẩm chức năng và bổ sung. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát qui trình phát hiện bốn loài Bifidobacterium bao gồm B. animalis, B. breve, B. bifidum và B. lactis thông qua việc khảo sát và lựa chọn cặp mồi đặc hiệu cho từng loài Bifidobacterium. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp với hai thông số: giới hạn phát hiện LOD50 và độ chọn lọc. Ứng dụng quy trình để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung bán trên thị trường tại TP. Hồ Chí Minh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu này tiến hành trên các chủng vi khuẩn Bifidobacterium mục tiêu và chủng không mục tiêu được liệt kê trong Bảng 1. Bảng 1: Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu Chủng vi sinh vật mục tiêu Chủng vi sinh vật không mục tiêu Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 Bifidobacterium animalis subsp. animalis ATCC 25527 Bifidobacterium breve ATCC 15700 Bifidobacterium longum NCTC 11818 Bifidobacterium animalis ssp. lactis ATCC 27536 Lactobacillus fermentum ATCC 9338 Lactobacillus casei ATCC 334 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ATCC 11842 Lactobacillus sakei ssp. sakei ATCC 15521 Lactobacillus reuteri Lactobacillus pentosus Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC BAA-52 Lactococcus lactis ATCC 19435 Bacillus cereus ATCC 10876 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 627 Chủng vi sinh vật mục tiêu Chủng vi sinh vật không mục tiêu Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia coli ATCC 11775 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Listeria monocytogenes ATCC 19115 Salmonella Typhimurium ATCC 13311 Shigella sonnei ATCC 9290 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vibrio parahaemolyticus ATCC 1780 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Cronobacter sakazakii BCRC 13988 Citrobacter freundii ATCC 8090 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA vi khuẩn Thực hiện trên 3 quy trình: Quy trình tách chiết bằng nhiệt Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ở 10.000g/5 phút/20 – 250C. Sau khi ly tâm, đổ bỏ dịch nổi và rửa sinh khối trong 1mL NaCl 0,85%. Vortex hỗn dịch và ly tâm ở 10.000g/10 phút ở 20 – 250C. Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối trong 0,5ml TE 1X. Đun sôi 95oC/15 phút, sau đó đặt ống trong đá 5 phút. Ly tâm 10.000g/5 phút/200C – 250C. Chuyển 400µl dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang tube 1,5mL mới. Dịch DNA được bảo quản ở -200C. Quy trình tách chiết A(1) Phương pháp tách chiết này sử dụng lysozyme, SDS, proteinase K và RNase A để tách DNA từ vi khuẩn Gram dương. Ly tâm 1 mL dịch vi khuẩn ở 12.000 rpm trong 3 phút ở 10°C. Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa 3 lần với 2ml NaCl-EDTA. Huyền phù tủa với 100 µl NaCl- EDTA. Thêm 100µL dung dịch lysozyme (10mg/ml) trộn đều. Ủ 37 o C/1,5 giờ. Thêm 240 µL NaCl-EDTA, 50µL dung dịch SDS 10%, 10µL dung dịch proteinase K (20 mg/mL). Ủ 55°C/1 giờ. Thêm 200 µL dung dịch tủa protein (6 ml potassium acetate 5M, 1,15mL acid acetic lạnh và 2,85 mL nước cất) và vortex 20 giây ở tốc độ cao. Cho vào khay đá 5 phút. Ly tâm ở tốc độ 12.000 g trong 3 phút. Thu dịch nổi chuyển qua tube 1,5ml mới Ly tâm 12.000 g trong 10 phút, loại bỏ protein dư, thu dịch nổi. Tủa DNA với 600 µl isopropanol lạnh, ly tâm 12.000 g trong 3 phút. Loại bỏ dịch nổi, rửa sạch tủa với ethanol 70% và để hong khô trong 15 phút ở 65oC. Thêm 100 µL đệm TE và giữ ở 65°C trong 15 phút. Trữ DNA ở -20°C. Phương pháp tách chiết bằng bộ kit SureFast®PREP Bacteria (Congen,Germany) Huyền dịch sau tách chiết được đo độ hấp thụ ánh sáng với máy đo OD (Quawell Q5000, nước sản xuất) tại các bước sóng 230, 260, 280 nm, thu được các giá trị A230, A260, A280. Độ tinh sạch và lượng DNA thu được được đánh giá như sau: Tỉ lệ 260/280 nằm trong khoảng 1,8–2,0: DNA tinh sạch. Tỉ lệ 260/230 nằm trong khoảng 2,0–2,2: các tạp chất đã tách hết ra khỏi sản phẩm DNA. Lựa chọn mồi Dựa vào một số các công bố của một số tác giả trước đây, chúng tôi tiến hành lựa chon một số cặp mồi cho từng loài Bifidobacterium. Sau đó, các trình tự mồi được kiểm tra trên phần mềm BLAST trên NCBI. Các mồi phù hợp được lựa chọn vào trong nghiên cứu (Bảng 2). Bảng 2: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR được sử dụng trong nghiên cứu Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham khảo B. bifidum BiBIF-1 CCACATGATCGCATGTGATTG 94 o C/5p; 30 x (94 o C/20s, 65 o C/20s, 72 o C/30s); 72 o C/5 p 278 (4) BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 628 Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham khảo B. breve B_bre-std-f CCACCGAGGTCATCGTC 94 o C/3p; 30 x (94 o C/30s, 58 o C/30s, 72 o C/30s), 72C o /10p 322 (2) B_bre-std-r TGCTGGGAGGAGACCTTG B. animalis 16S to 23S -F GGATGCTCCGCTCCATCG 94 o C/3p; 30 x (94 o C/30s, 58 o C/30s, 72 o C/30S), 72 C o /10p 104 (6) 16S to 23S-R GGGAAACCGTGTCTCCAC B. lactis Bflac2 GTGGAGACACGGTTTCCC 95 o C/5p;30 x (95 o C/30s, 64 o C/30s, 72 o C/1p), 72 C o /7 p 680 (6) Bflac5 CACACCACACAATCCAATAC Bifidobacterium spp. g-Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG 94 o C/5p; 30x (94 o C/20s,55 o C/20s, 72 o C/30s); 72 o C/5p 549–563 (3) g-Bifid-R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Lactobacillus được nuôi trong môi trường canh thang MRS (de MAN, ROGOSA and SHARPE, Merck) ở 37oC trong 48 giờ ở điều kiện kỵ khí. Chủng Bifidobacterium spp. được nuôi trong môi trường canh thang MRS có bổ sung 0,05% L-cystein ở 37oC trong 48 giờ ở điều kiện kỵ khí. Chủng vi khuẩn khác được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng được nuôi cấy trên môi trường TSB (Tryptic Soy Broth, Merck) ở 37oC trong 24 giờ. Phản ứng PCR và diễn giải kết quả Mỗi chủng được tiến hành phân tích một lần theo quy trình được trình bày trong Bảng 2. Thành phần các phản ứng PCR được chuẩn bị theo Bảng 3. PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Eppendorf Nexus. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, chạy ở điện thế 100V trong 30 phút; cuối cùng, gel được nhuộm với thuốc nhuộm Diamond Nucleic Acid Dye (Promega) và quan sát dưới đèn UV. Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR của master mix G2 Green Go Taq (Promega) Stt Thành phần Nồng độ cuối cùng Thể tích hút (µl) 1 2X G2 Green Go Taq buffer 1X 10 2 Primer xuôi (10µM) 0,5 µM 1 3 Primer ngược (10µM) 0,5 µM 1 4 Nước không nuclease 7,5 5 DNA khuôn 10 - 50ng 0,5 Tổng cộng 20 Độ đặc hiệu của mồi được đánh giá là đạt khi kết quả dương tính với các chủng mục tiêu và âm tính với các chủng không mục tiêu (Bảng 1). Xác định giá trị sử dụng của phương pháp Chuẩn bị mẫu Nghiên cứu được tiến hành trên nền mẫu thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung, chúng tôi chọn nền mẫu dạng bột làm vật liệu trong nghiên cứu. Các mẫu thực phẩm chức năng đã được kiểm tra trước cho thấy không có bổ sung vi khuẩn Bifidobacterium. Cân 1g (hoặc 1mL) mẫu vào túi vô trùng, sau đó bổ sung 9 mL dung dịch MRS broth bổ sung 0,05% L-cystein. Xác định mức phát hiện LOD50 Chuẩn bị một dãy pha loãng các chủng mục tiêu (20, 2-1, 2-2, 2-3) từ ống huyền dịch chứa khoảng 10 CFU /mL. Tiến hành nhiễm 1 mL từ các ống chủng này vào mẫu, mỗi mức làm lặp lại 20 lần – riêng mức nhiễm 0 CFU /mL và 10 CFU /mL chỉ tiến hành 5 lần. Lượng vi khuẩn bổ sung vào mẫu sẽ được trải và kiểm tra trên đĩa thạch MRS bổ sung 0,05% L-cystein. Các mẫu được ủ ở 37oC trong 72 ± 2 h ở điều kiện kỵ khí. Hút 1 mL dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5mL sạch, ly tâm 13.000 g trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi và thu tủa. Sau đó, tiến hành tách chiết DNA vi khuẩn. Thực hiện phản ứng PCR. Xác định độ chọn lọc Các chủng vi khuẩn mục tiêu được chuẩn bị với lượng gấp 10 lần mức phát hiện trong 1 ml huyền dịch mẫu. Chọn các chủng vi khuẩn không mục tiêu thường được bổ sung trong thực phẩm chức năng có khả năng gây phản ứng chéo với chủng mục tiêu. Các chủng này được chuẩn bị với lượng gấp 100 lần mức phát hiện trong 1 ml Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 629 huyền dịch. Bổ sung 1ml huyền dịch vi khuẩn được cho vào 9 ml canh thang MRS bổ sung 0,05% L- cystein, đồng thời được trải và kiểm tra trên đĩa thạch TOS. Mẫu sẽ được tiến hành phân tích 1 lần theo quy trình nghiên cứu và ghi nhận kết quả. Quy trình được xem như đạt về độ chọn lọc nếu chỉ cho kết quả dương tính trên các chủng vi sinh vật mục tiêu và âm tính trên chủng vi khuẩn không mục tiêu. Áp dụng quy trình để phân tích trên một số mẫu thực phẩm chức năng thực tế Chúng tôi tiến hành thu thập một số mẫu thực phẩm chức năng được bày bán tại các nhà thuốc và siêu thị tại thành phố Hồ Chí Minh, ghi nhận thông tin trên bao bì và tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng. KẾT QUẢ Lựa chọn quy trình tách chiết DNA Chúng tôi đã thực hiện khảo sát ba quy trình tách chiết khác nhau nhằm lựa chọn một phương pháp tách chiết DNA có thể thu nhận được DNA tinh sạch dùng phân tích PCR từ vi khuẩn Bifidobacterium. Kết quả đánh giá hiệu quả của các phương pháp tách chiết thông qua các tỷ số độ hấp thụ A260/A280, A260/A230 được thể hiện ở Bảng 4. Kết quả Bảng 4 cho thấy trong 3 phương pháp tách chiết, phương pháp tách bằng nhiệt thấy hiệu quả thấp nhất. Quy trình A cho kết quả tương đương với phương pháp tách bằng bộ kit thương mại về 2 chỉ số: tỷ lệ A260/A280, A260/A230 và thu được hàm lượng DNA cao nhất. Bảng 4: So sánh kết quả tách chiết DNA từ 3 phương pháp khác nhau Loài Nhiệt Thử nghiệm A Bộ kit SureFast®PREP Bacteria 260/280 260/230 Lượng DNA 260/280 260/230 Lượng DNA 260/280 260/230 Lượng DNA B.animalis 1,5 0,6 25640 1,98 1,85 2500 1,87 2,12 1000 B.bifidum 1,57 0,85 71160 2,02 1,79 2580 2,07 1,89 4020 B. breve 2,11 0,53 15360 2,03 1,93 8600 2,02 1,86 2600 B. lactis 1,68 0,9 1680 1,82 1,75 2100 1,84 1,9 1400 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi Dựa vào một số công bố của các tác giả trước đây đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài Bifidobacterium(5), dựa trên kết quả kiểm tra bằng chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), chúng tôi lựa chọn 5 cặp mồi cho 4 loài vi khuẩn Bifidobacterium (trong đó có 1 cặp mồi chung cho cả 4 loài Bifidobacterium spp. được sử dụng như chứng nội tại). Các cặp mồi này đều cho kết quả phát hiện chủng vi sinh vật mục tiêu và âm tính trên các chủng vi sinh vật không mục tiêu (Bảng 2). Hình 1: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi 16S to 23S -F và 16S to 23S -R phát hiện B. animalis Khảo sát độ đặc hiệu mồi B. animalis: 1: Salmonella typhi; 2: Shigella sonnei; 3: E. sakazakii; 4: E. feacalis; 5: S. thermophilus; 6: B. cereus; 7: B. subtilis; 8: S. aureus; 9: V. parahaemolyticus; 10: P. aeruginosa; Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 630 11: L. monocytogenes; 12: L.fermentum; 13: L. pentosus; 14: L. rhamnosus; 15: L. reuteri; 16: L. bulgaricus; 17: L. plantarum; 18: L. casei; 19: L. acidophilus; 20: L. paracasei; 21: L. sakei; 22: L. lactis; 23: S. paratyphi a; 24: Cronobacter sakazakii; 25: Citrobacter freundii; 26: E. coli; 27: B.lactis; 28: B. bifidum; 29: B. longum, 30: B. breve; 31: B. animalis (104 bp); 32: Chứng âm; M: Thang 100 bp Xác định giá trị sử dụng của phương pháp Trước khi đưa vào áp dụng phương pháp để xác định 4 loài vi khuẩn Bifidobacterium tại phòng thí nghiệm, chúng tôi cần phải xác định giá trị sử dụng của phương pháp này trên nền mẫu nghiên cứu với 2 thông số: mức phát hiện LOD50 và độ chọn lọc. Mức phát hiện Mức phát hiện (LOD) của một phương pháp định tính là nồng độ vi sinh vật thấp nhất có thể được phát hiện bằng phương pháp này với xác suất phát hiện được biết trước - thông thường xác suất phát hiện này có thể là 50% (gọi là LOD50) hoặc 95% (LOD95)(2). Phương pháp được xem có độ nhạy càng cao khi có mức phát hiện càng thấp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện việc xác định mức phát hiện LOD50 của phương pháp, Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 được thể hiện trong Bảng 5. Bảng 5: Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của phương pháp PCR trên nền mẫu thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung (Đơn vị: CFU/g) STT Vi khuẩn Thực phẩm chức năng Thực phẩm bổ sung 1 B. bifidum 1 1,3 2 B. breve 1,4 1 3 B. animalis 1,4 1 4 B. lactis 1 1,3 Độ chọn lọc Phương pháp được kiểm tra khả năng phát hiện chọn lọc các chủng vi khuẩn mục tiêu và không phát hiện đối với các chủng vi khuẩn không mục tiêu (Bảng 1). Theo đó, các quy trình đều cho thấy có độ chọn lọc tốt: chỉ cho kết quả dương tính trên chủng vi khuẩn mục tiêu và âm tính trên chủng vi khuẩn không mục tiêu. Hình 2: Kết quả điện di độ chọn lọc với các chủng mục tiêu và không mục tiêu. 1: L.fermentum; 2: L. pentosus; 3: L. rhamnosus; 4: L. reuteri; 5: L. bulgaricus; 6: L. plantarum; 7: L. casei; 8: L. acidophilus; M: thang 100 (bp); 9: L. paracasei; 10: L. sakei; 11: L. acidophilus; 12: B. animalis; 13: B. bifidum; 14: B. longum, 15: B. breve; 16: B.lactis (680bp) Như vậy, với điều kiện hóa chất, thiết bị và nhân lực của phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi có thể áp dụng phương pháp đang xây dựng để kiểm tra phân tích trên nền mẫu thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung để phát hiện các loài Bifidobacterium. Ứng dụng quy trình trên mẫu thực tế Sau khi có được các thông số về giới hạn phát hiện và độ đặc hiệu của qui trình. Chúng tôi tiến hành tiến hành phân tích một số mẫu thực tế được bán trên thị trường mua tại các chợ, siêu thị, hiệu thuốc trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh thu được kết quả so với công số nhà sản xuất được dán trên bao bì. Kết quả kiểm tra được thể hiện ở Bảng 6. Bảng 6: Kết quả phân tích mẫu thực phẩm chức năng (TPCN) và thực phẩm bổ sung (TPBS) trên thực tế Mã số mẫu Công bố nhà sản xuất Kết quả phân tích Bifidobacterium spp. B.bifidum B. breve B.lactis B. animalis TPCN-1 Bifidobacterium, B. lactis + - - + - TPCN-2 Bifidobacterium + - - - - Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 631 Mã số mẫu Công bố nhà sản xuất Kết quả phân tích Bifidobacterium spp. B.bifidum B. breve B.lactis B. animalis TPCN-3 Bifidobacterium BB12 + - - + - TPCN-4 Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPCN-5 Bifidobacterium lactis + - - + - TPCN-6 Bifidobacterium lactis + - - + - TPCN-7 B. bifidum + + - - - TPCN-8 B. bifidum + + - - - TPCN-9 B. bifidum + + - - - TPCN-10 Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPCN-11 Bifidobacterium lactis, B. breve, B. bifidum + + + + - TPCN-12 Bifidobacterium lactis, B. breve + - + + - TPBS-13 Bifidobacterium lactis + - - + - TPBS-14 Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-15 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-16 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-17 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-18 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-19 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-20 B. lactis + - - + - TPBS-21 Bifidus BL + - - + - TPBS-22 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-23 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - TPBS-24 Bifidobacterium, Bifidobacterium lactis BB12 + - - + - Kết quả phân tích 24 mẫu bằng phương pháp PCR khi sử dụng các cặp mồi phát hiện các họ Bifidobacterium spp. và từng loài riêng biệt được công bố trên bao bì sản phẩm trên bảng 6 cho thấy: tất cả các sản phẩm đều có bổ sung Bifidobacterium spp. (24/24 mẫu), 4 mẫu phát hiện loài B. bifidum, 2 mẫu phát hiện loài B. breve, 20 mẫu phát hiện loài B. lactis, không có mẫu nào phát hiện loài B. animalis - kết quả phân tích này đều đúng với các công bố của nhà sản xuất đưa ra trên bao bì sản phẩm. BÀN LUẬN Phương pháp tách chiết DNA bằng nhiệt là phương pháp đơn giản,ít tốn kém và thường được sử dụng tách vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Gram dương có hàm lượng peptidoglycan gây trở ngại chính trong việc phân tách DNA. Do thiếu các bước phân hủy thành tế bào cũng như loại bỏ các chất tạp nhiễm, dịch chiết DNA bằng phương pháp nhiệt cho kết quả DNA chưa đủ tinh sạch. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng sử dụng lysozyme kết hợp với các chất tẩy rửa như SDS tăng hiệu quả của quá trình tách chiết DNA từ tế bào Gram dương. Việc sử dụng các enzyme có khả năng phân cắt các liên kết cộng hóa trị trong peptidoglycan có thể giúp phá vỡ thành tế bào. Trong số các enzyme được phát hiện qua nhiều năm và được sử dụng với tỷ lệ thành công khác nhau bởi các nhà nghiên cứu khác nhau thì lysozyme là enzyme thích hợp và kinh tế nhất được sử dụng trong các quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Gram dương(5) Sau khi xác định độ đặc hiệu của 5 cặp mồi kết quả cho thấy cả 5 cặp mồi đều mang độ đặc hiệu cao khi phát hiện 4 loài Bifidobacterium trong nghiên cứu bằng phương pháp PCR. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu trước đây bằng kỹ thuật PCR xác định một số loài Bifidobacterium(3,4,8). KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng quy Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 632 trình PCR phát hiện 4 loài vi khuẩn Bifidobacterium thường gặp trong thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung với mức phát hiện LOD50 đều dưới 2 CFU/g đối với cả 2 nền mẫu thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung. Phương pháp cũng đồng thời có độ chọn lọc tốt vì không cho kết quả dương tính giả trên các chủng vi khuẩn không mục tiêu. Như vậy, quy trình có thể đưa vào ứng dụng tại phòng thí nghiệm vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm khu vực phía Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alimolaei M, Golchin M, Abshenas J, Ezatkhah M, Bafti MS (2018). A Recombinant Probiotic, Lactobacillus casei, Expressing the Clostridium perfringens α-toxoid, as an Orally Vaccine Candidate Against Gas Gangrene and Necrotic Enteritis. Probiotics Antimicrob Proteins, 10(2):251–257. 2. Junick J, Blaut M (2012). Quantification of human fecal Bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene. Appl Environ Microbiol, 78(8):2613–2622. 3. Matsuki T, et al (2002). Development of 16S rRNA-Gene- Targeted Group-Specific Primers for the Detection and Identification of Predominant Bacteria in Human Feces. AEM, 68(11):5445–5451. 4. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Fukuda M, Oyaizu H (1999). Distribution of Bidobacterial Species in Human Intestinal Micro ora Examined with 16S rRNA-Gene-Targeted Species-Specific Primers. Appl Environ Microbiol, 65(10):4506–4512. 5. Somkuti GA, Steinberg DH (1986). General method for plasmid DNA isolation from thermophilic lactic acid bacteria. J Biotechnol, 3(5–6):323–332. 6. Ventura M, Reniero R, Zink R (2001). Specific Identification and Targeted Characterization of. Appl Environ Microbiol, 67(6):2760– 2765. 7. Ward P (2005). Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria. Brazilian J Chem Eng, 19(4):23–32. Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019