Ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 251 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền, Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY (Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing) This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil, India..., walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing purpose. Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice. I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về Bảo vệ Giống cây trồng mới (International Union for the Protection of New Varieties of Plants), các cây trồng mới được chọn tạo phải trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS (bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt - distinctness, tính đồng nhất - uniformity và tính ổn định - stability). Trong 10 năm gần đây, mỗi năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia thường gặp phải tình trạng (5 - 10 trường hợp mỗi năm) các giống đưa ra khảo nghiệm có các đặc điểm hình thái (thỉnh thoảng cả đặc điểm hóa sinh) khó phân biệt. Trong một số trường hợp, giống cây trồng của các tác giả khác nhau hoặc được nhập nội có tên gọi khác nhau, nhưng về mặt hình thái lại rất giống nhau, gây ra những tranh cãi khó giải quyết. Câu hỏi đặt ra là thực chất chúng thuộc một giống hay các giống khác nhau? Các tiêu chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa trên 62 đặc điểm hình thái và hóa sinh cho thấy chưa đủ Người phản biện: TS. Lã Tuấn Nghĩa cơ sở để phân biệt các giống với nhau. Điều này gây nhiều khó khăn và cản trở trong việc xác minh bản quyền về giống cây trồng. Những tiến bộ gầy đây trong công nghệ sinh học nói chung và sinh học phân tử thực vật nói riêng đã có nhiều đóng góp tích cực không chỉ trong việc chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ giống mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội. Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám định giống chính xác ở mức độ phân tử là một việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 252 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Tập đoàn 261 giống lúa thu thập - 40 giống lúa để đánh giá DUS - 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu - 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo nghiệm. - 19 giống lúa giống nhau theo cặp trong khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012 - Tổng số 557 chỉ thị phân tử đã dùng để khảo sát lập bộ chỉ thị tham chiếu - Các vật tư hoá chất sinh học phân tử chuyên dụng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB cải tiến (của Phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường Đại học Gent, Bỉ). - Phương pháp PCR (Michael and Simon 2006). - Điện di gel polyacrylamide biến tính và không biến tính (PTN IRRI-Phillipine). - Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của giống lúa 10TCN 554-2002. - Các biện pháp kỹ thuật khác được tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002. - Xử lý số liệu thu được bằng phân tích trên phần mềm POPGEN 1.31 và NTSYS 2.1, Power Marker 3.0. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu và thiết lập bộ chỉ thị tham chiếu Đề tài đã thu thập được tập đoàn 261 dòng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các giống lúa đối với các chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu. Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát 261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau đối với 100 chỉ thị gồm 81 chỉ thị SSR rải rác trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các promoter tập trung vào các cis-element hay chính là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa. Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen của giống lúa Indica 93-11 và giống lúa Japonica Nipponbare, có thể xác định được sự đa hình từ các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình cao và hoạt động tốt được sàng lọc từ 756 chỉ thị STS nằm trên toàn bộ hệ gen lúa với khoảng cách 2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối đều trên 12 NST của lúa. Sản phẩm nhân bản của đoạn ADN từ các chỉ thị này có thể chứa ít nhất 5% đoạn chèn-xóa khác nhau của kích thước các băng nhận được (trong khoảng từ 100-400bp). Những chỉ thị này có thể phân biệt rất tốt những sự khác biệt giữa các giống lúa mới được tạo ra bằng lai tạo, đột biến, phân biệt giữa các giống lúa thuộc loài phụ Indica và Japonica... Để thực hiện tốt hơn công việc sàng lọc tìm kiếm chỉ thị của đề tài, chúng tôi đã tìm kiếm, tiếp cận thêm các thông tin về chỉ thị phân tử, chọn lọc thông tin, tiến hành thu thập và lọc cơ sở dữ liệu, từ đó đề tài đã sử dụng thêm các chỉ thị trên 12 NST, dọc theo bản đồ genome của lúa, đã chọn được thêm hơn 300 chỉ thị SSR đã cho kết quả hoạt động tốt từ các nghiên cứu được tham khảo, đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu sự khác biệt, lập bản đồ, đánh giá DUS... trên các nghiên cứu trong và ngoài nước, cho băng ADN rõ ràng để sàng lọc chỉ thị đa hình cao cho bộ chỉ thị tham chiếu. Nghiên cứu được tiến hành trên tổng số 557 chỉ thị SSR với 261giống để sàng lọc tìm chỉ thị cho đa hình cao trên tập đoàn giống lúa phong phú. Chỉ những chỉ thị cho băng vạch rõ ràng và có dấu hiệu cho đa hình sẽ được chọn cho bước sàng lọc tiếp theo. Kích thước của các alen đối với những chỉ thị cho băng vạch ADN rõ nét và kích thước băng phù hợp được ghi nhận lại để chọn lựa, loại bỏ dần những chỉ thị không phù hợp. Các locus SSR được sử dụng cho mục đích xác định cá thể phải thoả mãn được một số yêu cầu nhất định. Thứ nhất, các locus SSR đó phải có mức độ đa hình cao (nhiều alen), điều này giúp các nhà phân tích chỉ cần sử dụng số lượng locus tối thiểu đã đạt được độ tin cậy cao trong mỗi lần giám định. Thứ hai, các locus SSR đó phải có độ dài trung bình từ 85 - 400 bp, để có thể dễ dàng thực hiện phản ứng PCR và thao tác nhuộm phát hiện băng ADN trên gel Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 253 polyacrylamide. Thứ ba, các locus SSR được sử dụng để phân tích phải nằm trên các NST khác nhau để đảm bảo cho tính độc lập của từng locus. Thứ tư, các locus SSR nằm trên những vùng liên quan đến hoạt động sống của cơ thể. Thứ năm, các chỉ thị cho kết quả tốt, rõ nét, thuận lợi cho sử dụng, dễ phân biệt trên gel polyacrylamide. Bộ chỉ thị tham chiếu được chọn lựa khi hội tụ đầy đủ các đặc điểm như yêu cầu ở trên. Cơ sở khoa học để tính toán sự khác biệt trong việc xác định số lượng và chỉ thị cho bộ chỉ thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) cây nhị bội mang 2 alen đối với từng locus. Giả sử tần suất xuất hiện tất cả các alen trong 1 quần thể ngẫu nhiên là bằng nhau, đối với cây lúa là cây tự thụ phấn (mỗi cặp alen là đồng hợp tử), số tổ hợp các cặp alen sẽ bằng tích của số alen của từng locut khảo sát (Riêng đối với cây thụ phấn chéo là cây dị hợp tử, số tổ hợp các cặp alen sẽ lớn hơn gấp nhiều lần so với cây tự thụ phấn). Bộ chỉ thị sơ bộ gồm 5 locus: RM11: 5 alen; RM21: 6 alen; RM163: 6alen; RM 481: 12 alen; RM3412:11 alen. Nếu sử dụng cả 5 locus trên thì số tổ hợp cặp alen sẽ bằng 5  6  6  12  11 = 23.760 tổ hợp. Hay nói một cách khác, nếu sử dụng bộ chỉ thị bao gồm 5 locus trên, ta có thể phân biệt được 23.760 mẫu lúa, khác nhau ít nhất bởi 1 cặp alen. Bảng 1. Danh sách các chỉ thị trong bộ chỉ thị tham chiếu TT Chỉ thị NST Số alen Kích thước alen (số bp) A Bộ chỉ thị sơ bộ 1 RM11 7 5 120-125-132-136-140 2 RM21 11 6 125-128-132-137-150-156 3 RM163 5 6 130-135-140-153-160-170 4 RM481 7 12 124-132-139-149-154-158-172-177-182-192-210-224 5 RM3412 1 11 148-150-154-155-160-163-165-167-168-182-190 B Bộ chỉ thị tham chiếu chính thức: bao gồm 5 chỉ thị của bộ chỉ thị sơ bộ và 15 chỉ thị khác (từ 6-20) 6 RM1 1 6 80-89-92-105-122-125 7 RM5 1 5 105-110-115-118-122 8 RM6 2 4 142-150-156-165 9 RM17 12 6 150-154-160-175-180-185 10 RM25 8 6 128-132-134-140-142-145 11 RM206 5 8 125-127-130-135-145-152-160-178 12 RM215 9 5 96-100-103-106-109 13 RM333 10 6 170-175-178-180-189-200 14 RM3252 1 7 162-165-167-170-174-200-205 15 RM3843 4 4 165-170-175-182 16 RM7097 3 5 165-167-172-176-179 17 R4M13 4 4 172-188-200-218 18 MADS3 6 4 192-222-238-246 19 SO1160 1 4 170-175-187-210 20 S11033 11 6 162-165-170-175-178-180 C Bộ chỉ thị mở rộng: 10 chỉ thị 21 RM19 12 5 190-202-210-225-227 22 RM223 8 5 152-154-160-165-172 23 RM341 2 7 156-160-166-166-175-192-206 24 RM3486 5 6 215-221-225-230-250-253 25 RM5758 10 5 96-100-103-106-109 26 RM10825 1 4 82-87-92-100 27 RM17954 5 7 150-162-167-170-175-180-184-195-200 28 RM26063 11 6 112-122-130-134-138-143 29 MADS8 1 3 150-175-200 30 EST20 11 4 187-196-213-218 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 254 Tổng số các alen của chỉ thị tham chiếu chính thức là 120 alen. Nếu sử dụng 20 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức, ta sẽ phân biệt được 1,32434  1015 mẫu giống khác nhau bởi ít nhất 1 cặp alen. Nếu tính thêm cả bộ chỉ thị mở rộng ta sẽ có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp. Khi đó nếu sử dụng cả 30 chỉ thị trên thì sẽ phân biệt được 1,40169  1022 mẫu giống khác nhau bởi ít nhất 1 cặp alen. Số lượng các alen đối với từng locut sẽ thay đổi tùy thuộc vào tập đoàn giống nghiên cứu. Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi đã tìm và xác định được các alen như bảng 1. Các đồng nghiệp, tác giả khác khi sử dụng bộ chỉ thị này có thể tự cập nhật thêm số liệu. 3.2. Thiết lập và thử nghiệm qui trình Quy trình được nghiên cứu xây dựng dựa trên nguyên tắc về sự phù hợp giữa chỉ tiêu DUS với sự kiểm tra chỉ thị ADN như sau: - Chỉ tiêu khác biệt: Phân tích một số lượng nhất định các locus chỉ thị ADN cho phép thử nghiệm kiểu gen quan tâm có khác với các kiểu gen đã biết trước hay không và đồng thời xác định khoảng cách di truyền giữa chúng. - Chỉ tiêu đồng nhất: Kiểu gen đồng nhất di truyền cần phải có phổ ADN giống nhau đối với từng locus chỉ thị ADN. - Chỉ tiêu ổn định: Hạt giống của một kiểu gen cụ thể thu được ở các năm khác nhau thì phải có phổ ADN của các locus chỉ thị ADN giống hệt nhau và ổn định. Việc thử nghiệm, xây dựng quy trình khảo nghiệm DUS bằng chỉ thị phân tử cũng phải phù hợp với các tiêu chí của khảo nghiệm DUS bằng hình thái và hóa sinh hiện hành, bao gồm đánh giá tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định. Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hiện hành, phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng nhất căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng của tất cả cây trên ô thí nghiệm. Căn cứ vào báo cáo kết quả khảo nghiệm DUS tại Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống khảo nghiệm được xem là đồng nhất nếu có từ 1- 3 cây khác dạng trong số 1000 cây thí nghiệm. Như vậy khi phân tích 300-500 cây của một giống đối với bộ chỉ thị tham chiếu, nếu chỉ phát hiện thấy từ 1-2 sự khác biệt về alen thì có nghĩa là biến động về alen trong cùng một giống tương đương với biến động kiểu hình. Để kiểm chứng và hài hòa giữa phân tích ADN và phân tích các tính trạng hình thái, chỉ tiêu sinh hóa, trong quá trình lập quy trình, đề tài đã tiến hành khảo sát các nhóm giống bao gồm: nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 cây, nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây; nhóm giống không có cây khác dạng nào. Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích sự khác biệt về alen đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. Khảo sát từ 2-5 giống trong mỗi nhóm, mỗi giống phân tích 480 cây khác nhau để kiểm chứng cơ sở khoa học và phân tích bằng xác suất thống kê, tìm sự phù hợp giữa kiểm tra bằng kiểu hình và đánh giá bằng kiểu gen. Các giống lúa được gieo trồng theo đúng kỹ thuật đánh giá DUS theo thí nghiệm hàng-bông tại Trung tâm Khảo nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 50 bông trong số 100 bông tác giả gửi đến. Mỗi bông cấy 2 hàng (2 lần nhắc lại), hàng cách hàng 20cm, cây cách cây 15cm, mỗi hàng 25 cây. Kết quả khảo sát 480 cây của mỗi giống cho thấy, nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 cây có sự sai khác về alen rất lớn khi khảo sát với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu (từ 30-60 cây đối với 5-10 chỉ thị). Điều này được ghi nhận trên 480 cây của giống Nếp Nhiệt đới và giống Hương thơm số 1. Phân tích các chỉ tiêu DUS năm 2012 cũng cho thấy hai giống này có trên 3 cây khác dạng/1000 cây quan sát. Bảng 2. Danh sách các giống dùng trong thử nghiệm ADN để lập quy trình Nhóm Tên giống Số cây có sai khác về alen Basmati 370 60 HT8 10 Nhóm 1: Giống có nhiều hơn 3 cây khác dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng hình thái Hương thơm số 1 40 Việt thơm 8 10 Nhóm 2: Giống có ít hơn 3 cây khác dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng hình thái Nếp Nhiệt đới 15 Nếp Lang Liêu 3 NH92 5 TB2 3 Thảo dược Vĩnh Hòa 2 Nhóm 3: Giống không có cây khác dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng hình thái RS 0 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 255 Hình 1. Đánh giá các cây lúa của giống Nếp Nhiệt đới đối với chỉ thị RM3412, có 10 cây cho alen khác biệt với những cây khác A. Cây số 1-96; B. Cây số 97-192; C. Cây số 193-288; D. Cây số 289-384. E. Cây số 385-480. Kết quả phân tích 480 cây của từng giống trong nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây cho thấy có sự sai khác về alen của 10-15 cây đối với 3-7 chỉ thị. Nhóm giống không có cây khác dạng nào cũng vẫn có từ 1-5 cây có sự sai khác về alen đối với 1-3 chỉ thị trong bộ chỉ thị đem phân tích. Như vậy là biến động về alen chỉ thị phân tử lớn hơn biến động kiểu hình của giống. Điều này có thể được giải thích như sau: Các chỉ thị ADN là trung tính, không nhất thiết liên quan đến biểu hiện kiểu hình, vì thế biến động alen trong cùng 1 giống lớn hơn biến động kiểu hình. Từ những kết quả trên, để phù hợp với tiêu chuẩn khảo nghiệm tính đồng nhất trong khảo nghiệm DUS, với độ nhậy = 0,80 đến 0,90 và α = 0,05; nghiên cứu cần tối thiểu 50 đối tượng để ước tính R2 ≥ 0,23; hay tối thiểu 100 để ước tính R2 ≥ 0,12. Khi khảo sát các giống trong quá trình thử nghiệm phương pháp, từ kết quả 261 giống thử nghiệm ban đầu, đến những giống có từ nhiều đến không có cây khác dạng trong phân tích ADN đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu, kết quả thực nghiệm đã chứng tỏ mức độ khác biệt bên trong của cùng một giống tối đa là 5 nhóm. Đối với 5 chỉ thị chọn ra dùng cho bộ chỉ thị sơ bộ, kết luận này đạt độ tin cậy ở mức α = 0,05 tương ứng với quy định trong quy phạm khảo nghiệm. Kết luận này cũng tương tự như kết luận của các nhà khoa học Ucraina khi đưa ra các nguyên tắc để xác định tính đồng nhất và độ khác biệt bên trong của một giống đối với cây lúa mì. 3.3. Quy trình xác định giống lúa thuần bằng sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS * Phạm vi áp dụng Áp dụng tại các cơ sở có điều kiện về cơ sở vật chất, nguồn nhân lực và được sự cho phép của Nhà nước. * Đối tượng áp dụng Quy trình này áp dụng cho các giống lúa thuần nhằm hỗ trợ cho công tác khảo nghiệm DUS một cách chính xác và hiệu quả hơn. * Các bước của quy trình Bước 1: Xác định độ đồng nhất của giống 1. Tách chiết ADN tổng số của 50 cây/giống 2. Làm phản ứng PCR với 5 chỉ thị của bộ chỉ thị đánh giá sơ bộ RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412. 3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo 4. Ghi nhận kết quả. 5. Phân tích kết quả: Giống đồng nhất khi các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5 chỉ thị nghiên cứu. Bước 2. Kiểm tra độ khác biệt bên trong của giống 1. Khi giống không đồng nhất về alen ở bước 1, chia mẫu thành các nhóm có các thành phần alen khác nhau. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 256 2. Phân tích ADN của một mẫu đối với từng nhóm, sử dụng 15 chỉ thị còn lại của bộ chỉ thị tham chiếu (RM1, RM5, RM6, RM17, RM25, RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033). 3. Phân tích kết quả: Tổng hợp kết quả khảo sát đối với cả 20 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu, số nhóm tối đa chỉ có thể là 5. Nếu nhiều hơn 5 nhóm thì được xem là không đồng nhất. Bước 3. Kiểm tra độ ổn định của giống 1. Tách chiết ADN tổng số của 30 cây đối với cây lúa gieo từ hạt giống của ba vụ liên tiếp 2. Làm phản ứng PCR với ADN của 30 cây trên đối với 5 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. 3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo 4. Ghi nhận kết quả. 5. Phân tích kết quả: Giống ổn định: các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. Bước 4. Kiểm tra sự khác biệt của giống 1. Phân tích thành phần alen của giống mới được tiến hành với 1 trong số 50 cây đã kiểm tra ở bước 1, chọn ngẫu nhiên 1 cây. 2. Làm phản ứng PCR với ADN của 1 cây/giống trên đối với toàn bộ các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức (20 chỉ thị). 3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo. 4. Ghi nhận kết quả. 5. Phân tích kết quả: - So sánh thành phần alen của giống mới với các giống đã có trong phần mềm DUS-DFP. Nếu giống mới có nhận dạng ADN (DNA fingerprint) không tương đồng với bất kỳ một giống nào đã có trong thư viện quá 95% có thể xem đó là giống mới. - Nếu giống có nhận dạng ADN tương đồng với bất kỳ một giống nào đã có trong thư viện quá 95% cần phải so sánh hai giống đó với nhau sử dụng cả 30 chỉ thị của bộ chỉ thị chính thức và mở rộng (RM19, RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825, RM17954, RM26063, MADS8, EST20). Giống mới là giống có phổ ADN khác hoàn toàn với các giống đã được lưu giữ trong thư viện bởi ít nhất một trong số các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức và một trong số các chỉ thị của bộ chỉ thị mở rộng. Bước 5. Kết luận chung Giống mới được công nhận khi đạt tất cả các yêu cầu trong các bước kiểm tra nêu ở trên. Kết luận cuối cùng phải đi kèm với kết quả đánh giá so sánh về mặt hình thái (65 tính trạng) theo quy định của Nhà nước. * Trường hợp đặc biệt: A - Đánh giá từ 2 giống giống nhau về các chỉ tiêu DUS hình thái 1. Lấy mẫu lá 5 cây của giống cần kiểm tra theo phương pháp đánh dấu đường chéo 5 điểm trên ruộng, mỗi cây lấy 1 lá. 2. Tách chiết ADN tổng số của 5 cây/mẫu giống. Trộn mẫu lá của 5 cây theo tỉ lệ cân bằng về nồng độ để được một mẫu ADN. 3. Làm phản ứng PCR của ADN các mẫu giống trên đối với tất cả các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức (20 chỉ thị) và mở rộng (10 chỉ thị). 4. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo. 5. Ghi nhận kết quả. 6. Phân tích kết quả: Nếu nhận dạng ADN của các giống được kiểm tra khác biệt hoàn toàn đối với 3/30 chỉ thị đã sử dụng (khác biệt về alen và nhiễm sắc thể). Có thể xem các giống đó có sự khác biệt hoàn toàn. B - Một giống khác biệt với giống gốc bởi 1- 2 tính trạng đặc biệt 1. Đánh giá DUS giống gốc và giống mới 2. Phân tích hai giống bằng 30 chỉ thị của bộ chỉ thị chính thức và mở rộng. 3. Xác định tính trạng mới bằng phân tích kiểu hình. 4. Xác định tính trạng mới bằng phân tích kiểu gen thông qua chỉ thị phân tử đặc thù cho tính trạng mới. 5. Phân tích kết quả: Giống mới được công nhận khi có sự khác biệt cả về kiểu gen lẫn kiểu hình đối với tính trạng mới. 3.4. Lập ngân hàng dữ liệu cho các giống lúa trồng phổ biến và giống địa phương Phiên bản phần mềm DUS-DFP để quản lý ngân hàng dữ liệu sinh học phân tử và phân biệt giống cây trồng dưới dạng ký hiệu hiển thị ở kích thước alen đối với mỗi locus của chỉ thị/giống đã Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 257 được xây dựng. Khi phân tích ADN của một giống mới, dữ liệu về ADN truy vấn sẽ được nhập vào thư viện cơ sở dữ liệu ADN đã lập sẵn của 180 giống lúa với tất cả các chỉ thị trong bộ chỉ thị tham chiếu có sẵn trong phần mềm DUS- DFP. Phương pháp thống kê đa chiều sẽ được sử dụng trong phần mềm để phân tích cho ra ma trận khoảng cách di truyền hoặc độ tương đồng giữa các giống. Đề tài đã sử dụng bộ chỉ thị tham chiếu để lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa. Cơ sở dữ liệu đã được ký hiệu hóa và nhập vào phần mềm DUS-DFP để sử dụng. Hình 2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide 8% của 48 giống lúa với locus RM6 (L): ladder chuẩn 25bp; trên ảnh là các băng tương ứng kích thước 150bp, 175bp và 200bp Dòng cuối ký hiệu alen 1: 142bp; alen 2: 150bp; alen 3: 156p; alen 4: 160bp. Tất cả kết quả điện di của 180 giống với từng chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức và mở rộng đã được nhập vào phần mềm DUS- DFP 4.1. IV. KẾT LUẬN 4.1. Kết luận - Đã thu thập được 261 dòng/giống lúa. - Đã sử dụng 557 chỉ thị ADN để khảo sát lựa chọn ra bộ chỉ thị tham chiếu bao gồm các chỉ thị sau: 1). Bộ chỉ thị đánh giá sơ bộ (5 chỉ thị): RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412 2). Bộ chỉ thị chuẩn (20 chỉ thị): Gồm 5 chỉ thị trên: RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412 và 15 chỉ thị khác: RM1, RM5, RM6, RM17, RM25, RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033. 3). Bộ chỉ thị mở rộng (10 chỉ thị): RM19, RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825, RM17954, RM26063, MADS8, EST20. - Đã nghiên cứu, xây dựng quy trình “Xác định giống lúa thuần bằng sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS” phù hợp với các tiêu chí và tiêu chuẩn đánh giá trong công tác khảo nghiệm DUS hiện hành. - Đã nghiên cứu xây dựng phần mềm DUS-DFP để lưu trữ thư viện nhận dạng ADN (DNA fingerprinting), phân tích và hỗ trợ trong khảo nghiệm DUS. - Đã lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. 4.2. Đề nghị “Quy trình xác định giống lúa thuần bằng sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS” với mục đích cung cấp phương tiện để phục vụ cho công tác quản lý giống trong thực tại hiện nay. Đề nghị đưa quy trình vào áp dụng như một bước trong cho công tác khảo nghiệm giống lúa ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bonow S., Von Pinho E.V.R., Vieira M.G.C., Vosman B. (2009). Microsatellite markers in and around rice genes: applications in variety identification and DUS testing. Crop Sci., vol. 49, pp.880-886. 2. Сиволап Ю.М., Волкодав В.В., Бальвинская М.С., Кожухова Н.Е., Солоденко А.С. (2004). Идентификация и регистрация генотипов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), ячменя (Ноrdеum vulgаrе L.), кукурузы (Zеа mауs L.), подсолнечника (Неlіапthus аnnuus L.) с помощью анализа микросателитных маркepов. Методические рекомендации - Pешения Ученых Советов Южного биотехнологического центра в растениеводстве УААН и МОНУ; Селекционно- генетического института Национального центра семеноводчества и сортоизучения УААН; Института экспертизы сортов растений Госслужбы по охране прав на сорта растений Минагрополитики Украины. 17 trang. 3. Deniken (2005). Molecular markers and DUS testing, UPOV current situation. Report of Proc. of Seminar on the Use of Molecular Techniques for Plant Variety Protection, Ottawa, ON, Canada, 16- 17 June 2005. Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, ON, Canada. 4. Michael and Simon (2006). PCR- Second Edition. MPG BOOKS Limited, Bodmin, Cornwall, UK. 305pages.