Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể bc1f1 (tổ hợp lai kd18/ kc25) mang qtl/gen tăng số hạt trên bông và có nền di truyền cao nhất giống nhận gen

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai  1 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC CÁ THỂ BC1F1 (TỔ HỢP LAI KD18/ KC25) MANG QTL/GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG VÀ CÓ NỀN DI TRUYỀN CAO NHẤT GIỐNG NHẬN GEN Nguyễn Thị Thúy Anh1, Trần Trung1, Khuất Hữu Trung2, Lê Hùng Lĩnh2, Tạ Hồng Lĩnh2, Hoàng Kim Thành2, Thân Thị Thành2, Nguyễn Như Toản3, Nguyễn Thị Loan2, Trần Đăng Khánh2 (1)Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên, (3)Trường Đại học Sư phạm 2, (2)Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Lúa (Oryza sativa L) là cây lương thực quan trọng của nước ta và là nguồn lương thực chính của nhiều nước trên thế giới. Trước những ảnh hưởng cực đoan từ biến đổi khí hậu, áp lực dân số ngày một tăng cùng với quỹ đất trồng lúa bị thu hẹp do quá trình đô thị hóa đã ảnh hưởng đáng kể đến năng suất lúa. Do vậy, việc nghiên cứu chọn tạo ra các dòng/giống lúa năng suất là việc làm cấp bách và cần thiết. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC) là phương pháp hữu hiệu để lai chuyển các QTL hoặc gen vào dòng/giống ưu tú. Trong nghiên cứu này, nhờ ứng dụng MABC, đã lai chuyển thành công QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông từ dòng cho gen (KC25) vào giống nhận gen (Khang dân 18). Ở thế hệ BC1F1 đã chọn được cá thể số 74 mang gen và có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen đạt 83,4%. Từ khóa: Chọn giống phân tử kết hợp lai trở lại (MABC), QTL/gen, KD18, KC25 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa (oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời cũng là nguồn cung cấp thức ăn chính cho hơn một nửa dân số thế giới. Từ một nước thiếu lương thực, Việt Nam đã trở thành một trong những quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Những năm gần đây do quá trình đô thị hóa và công nghiệp hóa diễn ra nhanh chóng, bên cạnh việc chuyển dịch cơ cấu sản xuất nông nghiệp làm đất trồng lúa bị giảm nhanh. Thêm vào đó là biến đổi khí hậu ngày càng phức tạp với mức độ ngày càng nghiêm trọng và xảy ra trên diện rộng. Chính vì vậy, đã làm giảm đáng kể sản lượng lúa gạo, ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực và ổn định xã hội. Dân số thế giới liên tục tăng dẫn đến nhu cầu về lương thực của con người tăng. Đảm bảo an ninh lương thực và ổn định xã hội của thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng ở hiện tại và tương lai thì năng suất lúa luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Để năng suất lúa vượt trần, thì một trong những chiến lược quan trọng nhất là ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống mới. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (Marker assisted backcrossing MABC) được ứng dụng khá phổ biến, nhằm giảm bớt thời gian, chi phí, mang lại độ tin cậy cao. MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới. Việc nhận dạng đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC1F1 của tổ hợp lai KD18/KC25 nhằm chọn lọc chính xác cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông được chuyển vào. Vì vậy, giảm đáng kể số lượng cá thể cần gieo trồng để theo dõi trên đồng ruộng, tích kiệm thời gian, công sức cho các nhà chọn giống. Chính vì những vấn đề nêu trên, việc ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc cá thể trong quần thể BC1F1 là một vấn đề cần thiết. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Gồm hạt lai BC1F1 của tổ hợp lai KD18/KC25 (KD18 là tên viết tắt của giống Khang dân18 được trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Hồng của Việt Nam được chọn làm giống nhận QTL/genvà giống KC25 có nguồn gốc nhập nội mang QTL/gen tăng số hạt trên bông sử dụng làm giống cho QTL/gen). - 61 chỉ thị SSR được sử dụng liệt kê trong bảng 1 và một số hóa chất chuyên dụng dùng trong sinh học phân tử. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai  2 Bảng 1. Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18/KC25 TT Tên mồi NST Kích thước (bp) TT Tên mồi NST Kích thước (bp) 1 RM10115 1 245 31 RM3 6 145 2 RM11504 1 281 32 RM527 6 233 3 RM3412b 1 110 33 RM528 6 232 4 RM493 1 211 34 RM345 6 167 5 RM7075 1 155 35 RM3628 6 126 6 RM10800 1 143 36 RM494 6 203 7 RM10815 1 207 37 RM19238 6 169 8 RM10916 1 296 38 RM7434 6 143 9 RM5365 1 180 39 RM248 7 102 10 RM5356 2 134 40 RM11 7 140 11 RM6 2 163 41 RM445 7 251 12 RM526 2 240 42 RM500 7 259 13 RM7355 2 191 43 RM21615 7 130 14 RM3297 3 163 44 RM21539 7 394 15 RM14795 3 160 45 RM21769 7 337 16 RM14820 3 189 46 RM7338 7 164 17 RM282 3 136 47 RM447 8 111 18 RM3654 3 112 48 RM22825 8 160 19 RM5480 3 186 49 RM331 8 176 20 RM7389 3 111 50 RM296 9 123 21 RM514 3 259 51 RM1208 9 187 22 RM551 4 192 52 RM7175 9 105 23 RM16589 4 195 53 RM25181 10 162 24 RM280 4 155 54 RM25271 10 185 25 RM16820 4 173 55 RM24865 10 195 26 RM3333 4 201 56 RM206 11 147 27 RM349 4 136 57 RM7283 11 183 28 RM31 5 140 58 RM341 11 172 29 RM19199 5 158 59 RM247 12 131 30 RM7027. 5 85 60 RM1194 12 170 61 RM7102 12 169 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số dựa trên phương pháp CTAB cải tiến của Shagai - Maroof và cs (1984) - Kỹ thuật PCR. - Kỹ thuật điện di trên gel Agarose và kỹ thuật điện di trên gel Polyacrylamid. - Phương pháp phân tích số liệu thống kê: Số liệu được xử lý thống kê trên chương trình Excel 2007 và phần mền Graphical Genotyper 2 (GGT2). VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  2 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen ở thế hệ BC1F1 Để xác định những cá thể BC1F1 mang gen đích, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị phân tử đa hình: RM445, RM500 liên kết chặt với QTL/gen tăng số hạt trên bông tại các vị trí 17,46Mb và 15,91Mb trên nhiễm sắc thể số 7 (NST) (Trần Đăng Khánh và cs 2012) được thể hiện ở hình 1. Hình 1. Vị trí chỉ thị phân tử liên kết chặt với QT/gen tăng số hạt trên bông Kết quả sàng lọc 312 cá thể BC1F1 với hai chỉ thị đa hình liên kết chặt với QTL/gen được minh họa ở hình 2. Kết quả sàng lọc với chỉ thị RM445 chọn lọc các cá thể BC1F1 mang kiểu gen dị hợp tử, trong khi đó các cá thể không đủ tiêu chuẩn sẽ bị loại bỏ. Hình 2. Một số hình ảnh điện di trên polyacrylamide 4,5% với chỉ thị RM445 Ghi chú: 1-42: các cá thể BC1F1,; M: KD18 ; B: KC25; L: Ladder 50bp Chúng tôi đã thu được 84/312 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử gồm các cá thể số: 20, 22, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 42, 43, 44, 48, 50, 53, 57, 59, 63, 66, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 79, 81, 82, 86, 88, 89, 91, 94, 96, 103, 105, 109, 112, 115, 119, 125, 126, 127, 130, 132, 140, 145, 147, 150, 153, 154, 158, 161, 163, 164, 167, 172, 175, 177, 179, 184, 193, 195, 200, 204, 209, 210, 211, 212, 219, 222, 227, 236, 245, 246, 295, 296, 297 và 304.Tám tư cá thể BC1F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 được đánh số thứ tự từ 1 - 84 và tiếp tục sàng lọc với chỉ thị phân tử RM500. Tổng số 32/84 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử gồm các cá thể có số thứ tự số: 57, 63, 72, 73, 74, 77, 79, 82, 86, 88, 89, 91, 103, 109, 112, 115, 127, 140, 153, 163, 172, 175, 184, 195, 210, 212, 222, 227, 236, 245, 295, 297 và 52/84 cá thể đồng hợp tử với KD18. Các cá thể BC1F1 dị hợp tử ở cả 2 vị trí chỉ thị RM445, RM500 đủ điều kiện được chúng tôi chọn kiểm tra nền di truyền với các chỉ thị trên 12 NST. 2. Xác định cá thể con lai BC1F1 mang QTL/gen có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen Kế thừa kết quả nghiên cứu: Xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống KD18 và dòng cho QTL tăng số hạt trên bông (donor) trên 12 NST phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen (Trần Đăng Khánh và cs 2012). Đã xác định được 62 chỉ thị cho đa hình giữa KD18 và KC25. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng lần lượt 58 chỉ thị đa hình trên 12 NST, ngoại trừ NST số 7 mang gen mục tiêu để kiểm tra nền di truyền các cá thể con lai mang QTL/gen. Kết quả kiểm tra với từng chỉ thị được đánh giá và cho điểm, điểm A - đồng hợp tử với KD18, điểm B - đồng hợp tử với KC25, điểm H - dị hợp tử, điểm U - mẫu không biểu hiện. Sau khi sàng lọc với tất cả các chỉ thị RM445 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  4 (bảng 1) cho đa hình trên 12 NST để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen. Số liệu của từng cây được đưa vào phân tích trên chương trình GGT2 để lựa chọn cá thể BC1F1. Kết quả được nêu ở bảng 2. Bảng 2. Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 32 cá thể BC1F1 mang QTL/gen TT Cá thể số A (%) B (%) H (%) U (%) Tổng (cM) TT Cá thể số A (%) B (%) H (%) U (%) Tổng (cM) 1 57 74,8 7,8 17,4 0 265,8 17 127 69,2 10 20,2 0 265,8 2 63 67,9 10,3 21,8 0 265,8 18 140 74,9 12,5 11,5 1 265,8 3 72 70,4 9,3 20 0,3 265,8 19 153 73,3 5,1 20,7 1 265,8 4 73 77,9 6,4 15,6 0 265,8 20 163 74,4 8,4 17,2 0 265,8 5 74 83,3 4,9 11,8 0 265,8 21 172 78,6 13,4 8 0 265,8 6 77 71,4 6,7 21,5 0,3 265,8 22 175 70,2 1,4 28,4 0 265,8 7 79 71 10,4 18,6 0 265,8 23 184 75,9 8,6 15,5 0 265,8 8 82 67,9 20,7 11,4 0 265,8 24 195 74,7 4,3 21 0 265,8 9 86 70,8 6,2 23 0 265,8 25 210 63,7 4,4 32 0 265,8 10 88 62,2 6,8 31 0 265,8 26 212 61,5 7,8 30,7 0 265,8 11 89 70,1 15,2 14,7 0 265,8 27 222 68,8 5,4 25,8 0 265,8 12 91 72 13,3 14,7 0 265,8 28 227 75,8 16,3 7,9 0 265,8 13 103 72,8 6,2 20,9 0 265,8 29 236 70,6 14,4 15 0 265,8 14 109 80,2 7,9 11,9 0 265,8 30 245 79,8 4,1 15,7 0,3 265,8 15 112 67,1 11,8 21 0 265,8 31 295 71,5 15,3 12,8 0,3 265,8 16 115 66,7 15 18,3 0 265,8 32 297 70,3 5,1 24,4 0,3 265,8 Ghi chú: A%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KD18; B%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KC25;H%: Phần trăm cá thể dị hợp tử; U%: Phần trăm cá thể có mẫu không biểu hiện. Thế hệ BC1F1 đã chọn lọc được 32 cá thể mang QTL/gen. Phân tích trên chương trình GGT2 đã xác định được các cá thể có nền di truyền giống mẹ ở các mức khác nhau. Biểu đồ 1 thể hiện tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ. Kết quả cho thấy số cá thể có nền di truyền từ 70-75% chiếm tỷ cao nhất đạt 50%. Thấp nhất là nhóm cá thể có nền di truyền giống mẹ ≥ 80% (chiếm tỷ lệ 6,25%). Nhóm cá thể có nền di truyền giống mẹ ở mức 60-65% chiếm tỷ lệ 9,38%. Tương tự số cá thể có nền di truyền ở mức 65-70% và 75%-80% chiếm tỷ lệ lần lượt là 18,75% và 15,62%. Dưới đây là biểu đồ của cá thể số 74 chạy với phần mềm GGT 2.0 trên 12 NST. Biểu đồ 1. Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ ở thế hệ BC1F1 Ghi chú: Trục Y: Số cá thể, Trục X: Tỷ lệ % nền di truyền giống mẹ Thông qua phần mềm Graphical genotyper 2 (GGT2) trong phân tích di truyền đã chọn được cá thể số 74 có nền di truyền gần nhất với mẹ là 83,4%. Cá thể BC1F1 này được chọn để lai tạo quần thể BC2F1. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai  1 Biểu đồ 2: Biểu đồ của cá thể số 74 thế hệ BC1F1 quần thể KD18/KC25 Kết quả trên được lý giải theo như công thức tính của Bert Collard, 1998, với n là số thế hệ hồi giao, là tỷ lệ kiểu gen của cây nhận gen có trong các thế hệ con lai BCnF1. Số lần hồi giao càng nhiều thì tỷ lệ này càng cao. Sự tương quan này được thể hiện trong Bảng 3. Bảng 3. Sự tương quan giữa số thế hệ với tỷ lệ kiểu gen của giống nhận gen được chuyển vào con lai BCnF1 Số thế hệ hồi giao (n) Tỷ lệ 1 0,75 2 0,875 3 0,938 4 0,969 5 0,984 6 0,992 Theo như công thức trên thì thế hệ BC1F1 cá thể mang nền di truyền cây nhận gen trung bình đạt 75%. Tuy nhiên, điều này không có nghĩa tất cả các cá thể BC1F1 đều chứa 75% nền di truyền cây nhận gen mà nó có thể cao hơn hoặc thấp hơn mức bình quân đó. Nghiên cứu này chúng tôi đã xác định được cá thể số 74 mang nền di truyền gần nhất với mẹ đạt 83,4%. IV. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này đã xác định được: + 32 cá thể trong quần thể BC1F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông; + Cá thể số 74 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và có nền di truyền gần nhất với KD18 là 83,4%. Cá thể này được gieo trồng và phát triển quần thể BC2F1, BC3F1 và tiếp tục ứng dụng MABC để chọn lọc cá thể mang gen và nền di truyền cao nhất. LỜI CẢM ƠN Công trình này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài mã số: ĐT.ĐL.G36-2012 và đề tài KC06.12/11-15. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Đăng Khánh, Nguyễn Mạnh Cường, Lê Hùng Lĩnh, Lê Huy Hàm. 2012. Nghiên cứu khảo sát đa hình giữa giống cho và nhận QTL/gen tăng số hạt trên bông trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa thuần cao sản, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2:15. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai  7  Bert Collard and David Makill., 1998. Conserver DNA-Derived polymorphism (CDDP): A simple and novel menthod for genrating DNA marker in plant. Journal Plant Biology (27):558-562. Saqhai-Maroof, M.A., Soliman, K.M., Jorgensen, R.A., Allard, R.W. 1984. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proceedings of the National Academy of Science USA, 81:8014-8018. ABSTRACT Marker-assisted backcrossing to develop elite rice lines from KD18/KC25 concerning high grains / panicle Marker-assisted selection (MAS) and marker-assisted backcrossing (MABC) were applied to introgress the important quatitative traits from donors into recurrent parents. The QTLs relating to high grains / panicle (HGP) from KC25 were detected in the BC1F1 of Khang Dan x KC25 via microsatellite marekers RM445 and RM500 on chromosome 7. Accordingly, 74 progenies from the BC1F1 population were identified. The selected progenies were notice to express their direction of phenotypic effect (DPE) of HGP from donor KC85 as 83.4%. The populations of BC2F1 and BC3F1 have been developed due to MABC to obtain further promising genotypes with good genetics background from recurrent parent and HGP from donor. Keywords: marker-assisted backcrossing (MABC), QTL