Ức chế sự sinh trưởng và sự chết tế bào theo chương trình bởi kaempferol được điều hòa bởi sự hoạt hóa của mek-mapk ở tế bào ung thư phổi A549

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 10 ỨC CHẾ SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SỰ CHẾT TẾ BÀO THEO CHƯƠNG TRÌNH BỞI KAEMPFEROL ĐƯỢC ĐIỀU HÒA BỞI SỰ HOẠT HÓA CỦA MEK-MAPK Ở TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI A549 Nguyễn Thị Thanh Tuyền* ; Huỳnh Hùng* TÓM TẮT Một số lượng lớn các chất khác nhau có trong thiên nhiên cho thấy có tính đề kháng ở ung thư thực nghiệm và nhiều bằng chứng gợi ý Kaempferol có những đặc tính ngăn ngừa hóa trị của ung thư. Tuy nhiên, các cơ chế bảo vệ chính xác thì vẫn còn được hiểu một cách nghèo nàn. Để làm sáng tỏ các cơ chế này,chúng tôi đã thử nghiệm tế bào ung thư phổi ở người -A549 với Kaempferol và nghiên cứu những ảnh hưởng của nó trên những biểu đồ về sự tăng trưởng và sự dẫn truyền tín hiệu. Điều trị các tế bào A549 với Kaempferol cho kết quả ức chế khả năng sống của tế bào va sự tổng hợp DNA phụ thuộc vào thời gian và liều lượng thuốc. Cùng lúc đó, điều trị Kaempferol cũng làm tăng hàm lượng của những protein pro-apoptosis (Bax va Bad) và làm giảm hàm lượng của những protein anti- apoptosis (Bcl-xL va Bcl-2). Trong khi Akt và phospho hóa Akt bị ức chế thì MAPK lại được hoạt hóa.Sự chết tế bào do Kaempferol được kết hợp với sự tách ra (cleavage) của Caspase-7 và PARP.Sự ức chế MEK1/2 nhưng không phải PI-3K đã ngăn chặn Kaempferol gây hoạt hóa cleave Capsae-7, PARP và sự chết của tế bào.Những kết quả trên cho thấy rằng sự bất hoạt của Akt và sự thay đổi các protein của gia đình Bcl-2 không đủ để Kaempferol gây ra sự chết tế bào mà sự hoạt hóa của MEK- MAPK là điều kiện tất yếu để Kaempferol gây ra cơ chế chết ở tế bào A549. ABSTRACT KAEMPFEROL-INDUCED GROWTH INHIBITION AND APOPTOSIS IN A549 LUNG CANCER CELLS IS MEDIATED BY ACTIVATION OF MEK-MAPK. Nguyen Thi Thanh Tuyen, Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 * 2004: 72 – 80. A vast variety of naturally occurring substances have been shown to protect against experimental carcinogenesis and an increasing amount of evidence suggests that kaempferol may have cancer chemopreventative properties. However, the precise underlying protective mechanisms are poorly understood. To elucidate these mechanisms, we challenged human lung cancer cell line A549 with kaempferol and investigated its effects upon cellular growth and signal transduction pathways. Treatment of A549 cells with kaempferol resulted in a dose- and time-dependent reduction in cell viability and DNA synthesis with the rate of apoptosis equivalent to 0.9 ± 0.5, 5.2± 1.5, 16.8± 2.0, 25.4± 2.6, and 37.8 ± 4.5 % on treatment with 0, 17.5, 35.0, 52.5 and 70.0 μM kaempferol, respectively. Concomitantly, kaempferol treatments led to a 1.2-, 2.7-, 3.3- and 3.4-fold increase in Bax. Similar elevations were also observed in Bad which increased 1.2-, 3.3-, 3.7- and 4.7-fold respectively as compared to control. Bcl-2 and Bcl-xL expression were inhibited in a dose-dependent fashion. While the Akt-1 and phosphorylated Akt-1 were inhibited, the mitogen-activated protein kinase (MAPK) was activated upon kaempferol treatment. Activation of MAPK and c-Jun was peaked at 6 h and MAPK activity was sustained over 96 h. In addition, MEK1/2 phosphorylation was observed in concordance with MAPK activation. Kaempferol induced apoptosis was associated with the cleavage of caspase-7 and PARP * Laboratory of Molecular Endocrinology-National Cancer center of Singapore Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 72 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học (poly ADP-ribose polymerase). Inhibition of MEK1/2 but not PI-3 kinase blocked kaempferol-induced cleavage of caspase-7, PARP cleavage, and apoptosis. The results suggest that inactivation of Akt-1 and alteration of Bcl- 2 family of proteins are not sufficient for kaempferol to induce apoptosis and activation of MEK-MAPK is a requirement for kaempferol-induced cell death machinery in A549 cells. MỞ ĐẦU Ung thư phổi là một trong các ung thư thông thường nhất trên thế giới và ước tính khoảng 28% so với tổng số tử vong do ung thư gây ra.Khoảng 75% ung thư phổi là ung thư tề bào phổi không nhỏ (NSCLC-non-small cell lung cancer) và phần còn lại là tế bào ung thư phổi nhỏ (SCLC-small cell lung cancer) (Midthun va Jett, 1997). Hiệu quả điều trị của ung thư phổi vẫn còn nghèo nàn. Trung bình tỉ lệ sống 5 năm đối với ung thư phổi khu trú là 48% và di căn là 2.5% (Feng et al., 2001). Tỉ lệ sống 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi ở giai đoạn I với phẫu thuật cắt bỏ từng phần có thể đạt tới 60% (Feng et al., 2001). Đa số bệnh nhân bị ung thư phổi là bệnh không thể mổ được và có tiên lượng rất xấu. Chỉ có 15% bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và khu trú bởi vì phần lớn ung thư phổi bắt đầu tăng trưởng một cách yên lặng mà không kèm theo bất kì những triệu chứng nào cho đến khi ung thư đã ở giai đoạn tiến triển (Gargiullo et al., 2002). Hiện tại chúng ta có những phương thức điều trị phụ và tạm thời có thể chấp nhận để mà kéo dài cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Do đó việc khám phá ra phương thức mới để chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị ung thư phổi thì rất cần thiết và cấp bách. Một trong những mục tiêu dưới dòng (downstream targets) thông thường của các tyrosine kinase có hoặc không có thụ thể và các protein Ras kết nối với GTP là biểu đồ dẫn truyền tín hiệu của MEK-MAPK (Lewis et al., 1998; Ballif và Blenis, 2001). Các mức độ tăng cao hoạt hóa của MEK1 chủ yếu được thấy thường xuyên ở các dòng tế bào sinh ung (Amundadottir và Leder, 1998; Hoshino et al., 1999). Sự hoạt hóa MEK1 chủ yếu góp phần cho sự sinh trưởng của tế bào (Gupta et al, 1999; Blaif và Blenis, 2001), sự di chuyển (Krueger et al., 2001), sự biến nạp của nguyên bào sợi và tế bào biểu mô (Mansour et al., 1994; Greulich và Erikson, 1998; Montesano et al., 1999). Các nghiên cứu với các ức chế phân tử nhỏ hoạt động của MEK (Dudley et al., 1995; Favata et al., 1998) đã chứng minh vai trò của MEK trong việc điều hòa biểu hiện của các proteinase trong sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư (Reddy et al., 1999; Liu et al., 2000) và sự gián đoạn hình thái học của lớp biểu mô (Lu et al., 1998; Chen et al., 2000). Không có các chất dưới dòng của MEK nào được xác định khác hơn ngoài p44/42 MAPK (reviewed in Anderson et al.,1990). Điều trị các tế bào với các yếu tố tăng trưởng hoặc tác nhân hóa trị liệu khác nhau gây ra sự hoạt hóa của MEK1/2 và các mục tiêu dưới dòng của nó. MAPK điều hòa sự tăng sinh,biệt hóa và sự sống của tế bào (reviewed in Bllaif và Blenis, 2001). Sự hoạt hóa của MAPK điều hòa hoạt động của một số chất dưới dòng (substrates) bao gồm nhân tố phiên mã (Transcription factor) p62TCF (ELK1), c-myc, ATF2, và các thành phần AP- 1: c-Jun và c-Fos (Favataet al., 1998). MAPK cũng liên quan trong việc vận chuyển thuộc nhân (nuclear transport), tập hợp các tiểu đơn vị cấu trúc nhiễm sắc chất (nucleosome assembly) và sự điều hòa bộ xương tế bào (Lewis et al., 2000). Sự hoạt hóa MAPK có thể ảnh hưởng mạnh hoặc là đề kháng lại sự chết tế bào (reviewed in Walter, 2002) hay pro-apoptotic (Moos và Fitzpatrick, 1998; Bhat và Zhang, 1999). Những ảnh hưởng này phụ thuộc vào bản chất của từng loại tế bào. Điều hòa sự chết tế bào là một tiến trình phức tạp và liên quan đến một số lượng lớn các gen của tế bào bao gồm Bcl-2 (Fisher et al., 1993) và các thành viên liên quan đến Bcl-2 chẳng hạn như Bcl-xL, Bcl-xS, Bad và Bax (Boise et el., 1993). Ức chế Bcl-2 làm cho thúc đẩy sự chết của tế bào đáp ứng với một số chất kích thích bao gồm những thuốc chống ung thư (Hickman., 1992; Fisher et al., 1993). Bcl-2 và Bcl- xL, góp phần chống lại sự chết tế bào. Chúng cũng ngăn ngừa Bax và các protein pro-apoptotic gây ra Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 73 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 phóng thích của cytochrome c và sự hoạt hóa của caspase 9. Nghiên cứu gần đây về sự chết tế bào đã chứng minh tầm quan trọng của PI-3kinase và protein dưới dòng của nó Akt (Franke et al., 1995; Kulik et al., 1997). Akt đóng vai trò là chất đề kháng sự chết tế bào bằng cách chống lại với các chất kích thích khác nhau (Franke et al., 1995). Một sự kết nối trực tiếp giữa PI-3 kinase và các protein điều hòa sự chết tế bào đã được thiết lập thông qua Akt phospho hóa Bad (Zha et al., 1996; Datta et al., 1997). Một số các nghiên cứu về dịch tễ học đã dẫn chứng mối quan hệ giữa chế độ ăn và ung thư và các bằng chứng cho rằng chế độ ăn nhiều trái cây và rau quả đưa đến nguy cơ mắc bệnh thấp ở một số loại ung thư (Steinmetz va Potter, 1991; Block et al., 1992). Flavonoides là thành phần polyphenolic mà nó được phân bố một cách rộng rãi ở nhiều loại rau quả và trái cây (Leighton et al., 1992; Messinaet al., 1994; Stavric., 1994). Glycone flavonoids thông thường nhất được tìm thấy trong chế độ ăn là Quercetin, Kaempferol, Rutin và Robinin (Anton et al., 1988). Trong số đó Quercetin đã được nghiên cứu một cách rộng rãi (Constantinou et al., 1995; Leeet al., 1998; Aligiannis et al., 2001. Hoạt động của Flavonoids chẳng hạn như Kaempferol và quercetin được điều hoà bởi sự tác động qua lại với các vị trí kết nối với estrogen loại II đã được đề cập tới (Ranelletti et al., 1992). Trong in vitro, Kaempferol ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư máu ở người (Dimas et al., 2000) và tế bào NIH3T3 biên nạp với v-H-ras (Kuo et al., 1994), nhưng lại bảo vệ tế bào PC12 và T47D khỏi độc tố gây ra bởi β-amyloid (Roth et al., 1999.) Để hiểu sâu hơn về cơ chế phân tử cơ bản của Kaempferol, trong tài liệu này chúng tôi chứng minh rằng Kaempferol đã ức chế sự sinh trưởng và gây chết tế bào ở tế bào ung thư phổi A549 thông qua hàng loạt sự thay đổi ở mức độ phân tử như ức chế hoạt hóa Akt, gia tăng các protein pro-apoptosis (Bax va Bad), giảm sút protein anti-apoptosis (Bcl-2 va Bcl-xL) và sự hoạt hóa và kéo dài của MAPK là chủ yếu.Mặt khác dùng chất ức chế của MAPK –U0126 đã ngăn chặn hoạt hóa của MEK-MAPK và làm mất đi độc tố tế bào của Kaempferol. Điều này khẳng định thêm MEK-MAPK đóng vai trò then chốt trong sự chết tế bào do Kaempferol ở tế bào A549. VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tế bào và điều trị Các tế bào biểu mô phổi A549 được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung với 10% FCS, 1% kháng sinh PN ở nhiệt độ 37°C và 5% CO2. Để nghiên cứu những ảnh hưởng của Kaempferol, tế bào A549 được nuôi cấy với những mật độ khác nhau và để chúng qua 24 giờ. Sau đó các tế bào được điều trị với những nồng độ gia tăng khác nhau của Kaempferol từ 17.5 cho tới 70 μM trong môi trường nuôi cấy không có huyết thanh (Serum free media). Khi đạt được thời gian thích hợp, các tế bào sẽ được thu thập và xử lí với những phương pháp khác nhau. Kĩ thuật hình thái học Để quan sát hình ảnh của các tế bào chết. Sau 24 giờ điều trị với những nồng độ khác nhau các tế bào được cố định với dung môi formadehyde 4% khoảng 1 giờ, sau đó được rửa với dung dịch phosphate buffer saline. Sự chết tế bào được phát hiện bằng xét nghiệm với bộ kit TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling). Kỉ thuật đo lường tỉ lệ tế bào sinh trưởng và tế bào có khả năng sống Bằng cách sủ dụng bộ kit ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) cho việc phát hiện tế bào sinh trưởng và xét nghiệm MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) cho các tế bào có khả năng sống. Kỉ thuật thấm western Dùng để quan sát ở mức độ phân tử. Các tế bào điều trị sau 24 giờ, được thu nạp và chiết xuất phân tử protein với dung dịch tan(lysis buffer) và sử dụng kỉ thuật thấm western (Western Blot). Sau đó các màng lai được ủ với những kháng thể thích hợp. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 74 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học Phân tích thống kê KẾT QUẢ Bằng những kỉ thuật trên chúng tôi đã xác định được ảnh hưởng của Kaempferol trên sự sinh trưởng của tế bào trong in vitro.Kaempferol kiềm hãm sự tăng sinh của tế bào phụ thuộc vào thời gian và liều lượng. Hình 1 Ảnh hưởng của Kaempferol trên sự sinh trưởng và khả năng sống của tế bào. Sau 48 giờ điều trị cho thấy mật độ tế bào giảm xuống tùy thuộc vào liều lượng thuốc được quan sát hình 1B. Hình 2 A cho thấy sự thay đổi hình thái học của tế bào và màng tế bào bị bóng nước (blebbing) là những đặc tính của tế bào chết. Tế bào chết được xác định bằng xét nghiệm TUNEL cho thấy sự vỡ ra từng mãnh DNA và kết tụ của nhân tế bào ở hình 2B Do sự chết của tế bào ở những tế bào động vật có vú cho thấy được điều hòa bởI các protein Bax, Bad, Bcl-2 va Bcl-xL. Để thử nghiệm khả năng này chúng tôi dùng kỉ thuật thấm western và kết quả đạt được cho thấy Kaempferol gây gia tăng đối với biểu hiện của những protein pro-apoptosis Bax và Bad (hình 3B và 3C). Sự gia tăng được quan sát rỏ nhất ở nồng đồ 52.5 và 70μM. A bs or ba nc e ( 5 70 n m ) K a e m p f e r o l ( µ M / m l ) 0 1 7 . 5 3 5 5 2 . 5 7 0 0 . 5 0 . 8 1 . 1 1 . 4 a a b c c a b c d d 2 4 H 4 8 H B Th e ra te o fB rd U In co rp or at io n (4 50 n m ) 0 0 . 5 1 1 . 5 a b c c d a b c d e 2 4 H 4 8 H A K a e m p f e r o l ( µ M / m l ) 0 1 7 . 5 3 5 5 2 . 5 7 0 Hình 2 Sự gây ra tế bào chết do Kaempferol bằng xét nghiệm hình ảnh học α-tubulin Bax Bad Bcl-2 Bcl-xL 0 17.5 35 52.5 70Kaempferol (µM/ml) A B C D E Fold changed (Bax) Fold changed (Bad) Fold changed (Bcl-2) Fold changed (Bcl-xL) 1 1.15 2.7 3.29 3.41 1 1.25 3.36 3.78 4.73 1 0.52 0.31 0.27 0.19 1 0.46 0.24 0.2 0.12 Hình 3 Ảnh hưởng của kaempferol trên biểu hiện protein Bcl-2, Bax, Bad và Bcl-xL ở tế bào A549 bằng kỉ thuật western blot. Với số lần là 3.29- và 3.41- đối với Bax, 3.78- và 4.73 -lần đối với Bad khi được so sánh với chất kiểm soát (control). Ngược lại các protein chống lại sự chết tế bào như Bcl-2 và Bcl-xL được cho thấy giảm đi theo nồng độ của thuốc (hình 3D và 3E). Biểu đồ PI-3 kinase được hoạt hóa bởi một số các chất tăng trưởng khác nhau đã được làm sáng tỏ. Các xét nghiệm gần đây trên tín hiệu chết của tế bào đã chứng minh sự quan trọng của PI-3 kinase và chất dưới dòng của nó Akt. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 75 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 A B C D α-tubulin Phospho-Akt Akt PI-3K 0 17.5 35 52.5 70Kaempferol (µM/ml) Fold changed (pAkt) Fold changed (Akt) 1 0.92 0.65 0.42 0.33 1 0.75 0.18 0.14 0.076 Hình 4 Những ảnh hưởng của Kaempferol lên các phân tử protein p85 PI-3K và phospho Akt ở tế bào A549 bằng kỉ thuật western blot. Từ hình 4B và 4C kết quả cho thấy biểu hiện của p85 PI-3 kinase và chất dưới dòng của nó Akt giảm.Điều này chứng tỏ Kaempferol có ảnh hưởng đến sự ức chế của những protein này. α-tubulin Cleaved PARP Cleaved caspase 7 0 17.5 35 52.5 70Kaempferol (µM/ml) 89kD A B C Fold changed (Cleaved caspase 7) Fold changed (Cleaved PARP) 1 2.1 5.98 9.57 11.5 1 1.25 2.51 3.71 5.61 Hình 5 Những ảnh hưởng của Kaempferol lên các phân tử protein cleavage caspase 7 và PARP ở tế bào A549 bằng kỉ thuật western blot. Một điều cũng được chứng minh là sự tách ra của protein PARP (poly ADP-ribo polymerase) là sự kiện sinh hóa xảy ra sớm trong quá trình tế bào chết. Do bởi cleaved PARP là dấu xác nhận tiêu chuẩn (hallmark) của sự hoạt hóa hệ caspase, chúng tôi xác định xem cơ chế của tế bào chết có được hoạt hóa khi điều trị với Kaempferol hay không,các kháng thể được xét nghiệm sau đó và kết quả cho thấy sự tách rời của phân tử protein 89 kDa (cleaved PARP) và sự hoạt hóa của caspase 7 được quan sát ở nồng độ thấp và tăng dần theo với nồng độ ở hình 5B và 5C. Hình 6. Ảnh hưởng của kaempferol trên các phân tử protein phosphorylated MEK1/2, MAPK, và phosphorylated p44/42 MAP kinase (Thr202/Tyr204) và phospho C-Jun (Ser63) ở tế bào A549 bằng kỉ thuật western blot. MAPK có thể gây sự chết tế bào và dự đoán độ nhạy hóa trị của khối u (Akata et al., 1995; Sabsbury et al., 1997; Lieu et al., 1998; Chen et al., 1999; Koo et al., 1999; Petrache et al., 1999; Alechman et al., 2000). Để nghiên cứu ức chế sự tăng trưởng và tế bào chết có phải do Kaempferol hay không,kỉ thuật thấm western cùng với kháng thể kháng phospho-MAPK và MAPK được thực hiện.Kết quả cho thấy điều trị tế bào A549 với những nồng độ khác nhau của Kaempferol sau 48 giờ dẩn đến sự phospho hóa của MAPK tùy thuộc vào nồng độ (hình 6B). MEK1/2 cũng được phospho hóa giống như MAPK (hình 6D). Bởi vì c- Jun là đích hoạt động của MAPK,nên mức độ phospho của c-Jun cũng được xác định. Kết quả cho thấy c-Jun cũng phospho giống như sự hoạt hóa của MAPK (hình 6F), điều này cho thấy sự phospho của MAPK do MEK1/2 làm gia tăng hoạt động của MAPK. Do sự hoạt hóa của JNK và p38 cũng được cho là Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 76 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học yếu tố quyết định trong sự gián đọan của chu kỳ tế bào và sự chết của tế bào (Sanchez et al., 1994; MacKeigan et al., 2000). Kháng thể kháng phospho- JNK và p38 được thực hiện.Kết quả cho thấy mức độ phospho hóa của chúng hơi thay đổi, nhưng chúng không có khuynh hướng đóng vai trò quan trọng gây ra tế bào chết ở tế bào A549. (hình 6G&H). Hình 7 Ảnh hưởng của chất ức chế MEK1/2 -U0126 và PI-3 kinase -LY294002 lên sự chết của tế bào A549 do Kaempferol bằng các xét nghiệm hình thái học. Từ các kết quả trên cho thấy hoạt hóa MEK- MAPK có thể dẫn đến sự chết tế bào. Để làm sáng tỏ,chất ức chế của MEK1/2 được dùng để thử nghiệm xem chất này có ức chế sự hoạt hóa của MEK-MAPK hay không,U0126-là chất ức chế của MEK1/2 được sử dụng kết hợp với chất ức chế PI-3kinase -LY294002. Kết quả cho thấy khi kết hợp điều trị hai chất Kaempferol và chất ức chế U0126 đã ngăn chặn được bào tương co rút và màng tế bào bị bong nước qua xét nghiệm hình ảnh học (hình 7E). Và bằng kỉ thuật thấm western cho thấy sự kết hợp hai chất đã ngăn ngừa Kaempferol phospho của MAPK(hình 8B), c-Jun (hình 8D), cleave capase 7 (hình 8E), và PARP (hình 8F). Cùng lúc đó,Kaempferol kết hợp với chất ức chế PI-3kinase đã không ngăn chận được sự chết của tế bào (hình 7F)..Một lần nữa các kết quả khẳng định rằng hoạt hóa của MEK-MAPK đóng vai trò chủ yếu trong việc gây te tế bào do Kaempferol và MEK- MAPK họat động tren dòng (upstream) cũa caspase 7 để đưa đến tế bào chết. Cleaved PARP Kaempferol (70 µM/ml) U0126 (10 µM) LY294002 (10 µM) _ _ _ _ _ __ + + + + + + _ _ _ _ + α-tubulin Cleaved Caspase 7 Phospho-MAPK Phospho c-Jun MAPK A B C D E F89 kD 20 kD 19 kD Hinh 8 Ảnh hưởng của Kaempferol và chất ức Chế MEK1/2 -U0126 và PI-3 kinase LY294002 lên các phân tử protein gây nên phospho hóa MAPK, c-Jun, và cleavage của caspase 7 và PARP ở tế bào A549 bằng kỉ thuật Western blot. BÀN LUẬN Mối quan hệ giữa chế độ ăn và ung thư đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu về dịch tể học (Block et al.,1992). Xuất độ mắc bệnh ung thư giảm đáng kể ở nhóm người có chế độ ăn bao gồm một số lượng lớn rau quả và trái cây hơn là nhóm người có chế độ ăn phần lớn là thực phẩm của động vật (Steinmetz and potter et al., 1991; Block et al., 1992). Nhiều kết quả cho thấy rau quả và trái cây có chứa những thành phần có những đặc tính chống lại sự sinh trưởng và sự hình thành khối u (Leighton et al., 1992; Messina et al., 1994; Stavric et al., 1994). Kaempferol là thành phần trong thiên nhiên có ở trong nhiều loại trái cây và rau quả khác nhau và cho thấy có những ảnh hưởng chống lại sự sinh trưởng cuả tế bào. Trong nghiên cứu này,chúng tôi đã chứng minh Kaempferol ức chế sinh trưởng và sự chết ở tế bào ung thư phổi A549. Về phương diện hình ảnh học, tế Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 77 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 bào A549 biểu hiện với hình ảnh xếp nếp (ruffling), bóng nước (blebbing), kết tụ bào tương và màng của nhân (condensation of cytoplasm and nuclear membranes), sự tập hợp nhiểm sắc chất của nhân (aggregation of nuclear chromatin),và sự vở ra từng mảnh của DNA. Về khía cạnh mức độ phân tử, những thay đổi của gia đình Bcl-2 và sự bất hoạt của phospho Akt, kết hợp với sự họat hoá cuả MEK-MAPK được đòi hỏi cho Kaempferol gây tế bào chết. Bên cạnh đó, Kaempferol gây ra hoạt hoá của MEK-MAPK phụ thuộc vào thời gian và liều lượng. Hoạt động gia tăng của MAPK góp phần gây tế bào chết được chứng minh bằng cách quan sát chất ức chế U0126 làm giảm đi sự chết tế bào khi kết hợp với Kaempferol thông qua cleaved capase –7 va PARP đã bị ngăn chặn. Kết quả chứng minh chức năng của MEK- MAPK trên dòng của sự hoạt hoá caspase để gây nên tín hiệu chết của tế bào. Có hai biểu đồ chính gây nên sự chết tế bào khác nhau được mô tả ở tế bào của động vật có vú. Biểu đồ thứ nhât liên quan đến caspase 8. Biểu đồ thứ hai liên quan đến một lọat các phần tử protein sau đây. Tế bào A549 trị liệu với Kaempferol đưa đến gia tăng biểu hiện của những protein pro-apoptosis như Bax và Bad, song song với làm giảm biểu hiện của protein anti-apoptosis như Bcl-2 và Bcl-xL, đưa đến sự mất cân bằng giữa số lượng protein pro-apoptosis và anti- apoptosis. Hậu quả này gây sự mở ra các lổ chuyển tiếp có thể thấm được ở thể hạt, gây ra hàng lọat sự hoạt hóa của các phân tử protein và cuối cùng dẫn đến tế bào chết. Chức năng chống lại tế bào chết của PI-3kinase là do sự hoạt hóa của protein kinase Akt. Kaempferol được chứng minh ức chế hoạt hóa của protein này. Chứng tỏ Kaempferol gây tế bào chết thông qua nhiều cơ chế. Biểu đồ của JNK và p38 cũng kết hợp làm tăng thêm tế bào chết. (Sanchez et al., 1994; Amato et al., 1998; Lee at al., 1998a; Jujiri et al., 1998; Mackeigan et al., 2000) ngược lại MAPK cho thấy ức chế tế bào chết (Xia et al.,1995). Kết quả nghiên cứu cho thấy JNK và p38 không có khuynh hướng dự phần và gây tế bào chết của Kaempferol ở tế bào A549. Sự khác nhau trong điều hòa của hai protein này có thể do sự khác nhau giữa cac loại tế bào hoặc là do sự kích thích môi trường bên ngoài tế bào khác nhau. Trái ngược lại,điều trị Kaempferol dẫn đến sự gia tăng và kéo dài hoạt hóa của MEK-MAPK. Dùng chất ức chế U0126 để điều hòa hoạt động của MEK- MAPK, lại càng chứng minh thêm hoạt hóa của MEK-MAPK đóng vai trò quan trọng trong tế bào chết ở A549. Kết quả của chúng tôi được hổ trợ với một vài kết quả nghiên cứu của họat động MEK-MAPK mà có thể gây sự chết tế bào và dự đóan độ nhạy của hóa trị (Sakata et al., 1995; Sansbury et al., 199; Lieu et al., 1998; Chen et al., 1999; Koo et al., 1999; Petrache et al., 1999; Kalechman et al., 2000). GLOSSARY Apoptosis: The term 'apoptosis' describes the molecular and morphological processes leading to fragmentated of nuclear DNA. Frequently, the terms 'apoptosis' and 'programmed cell death' are used as synonyms.This process triggered by pathological conditions such as inflammation, cancer, viral infections, or exposure to a wide variety of chemical and physical stimuli. Adjuvant chemotherapy: Chemotherapy designed to eradicate microscopic foci of metastatic disease following local control with surgery or radiotherapy or both. Caspases: Cystein Aspartate-specific Proteases: Caspases form a proteolytic network that is of central importance in the initiation and execution of the apoptotic program Chemoprevention: Chemoprevention is the use of pharmacologic or natural agents that inhibit the development of invasive cancer either by blocking the DNA damage that initiates carcinogenesis or by arresting or reversing the progression of premalignant cells in which such damage has already occurred (for Review see Hong and Sporn, Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 78 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học 1997, Science, 278: 1073). Downstream: Sequences that are located futher in the direction of expression. Inhibitors: A chemical substance that retards or stops enzyme activity. MAP kinase (mitogen-activated protein kinase, MAPK): A protein kinase that performs a crucial step in relaying signal from the plasma membrane to the nucleus.Turned on by the wide range of proliferation – or differentiation –inducing signals. Phosphorylation: A reaction in which a phosphate group is attached to a protein. Phosphorylation is a common way of regulating the activity of protein which play major role in signal transduction. Signal transduction: The mechanism through which message are sent from one cell to another,passing through the target cell wall and into the nucleus,where the signal molecule activates various cellular events. Target: A molecule (often a protein). Trancription: The normal cellular process of turning a DNA gene copy into messenger RNA (mRNA). Transcriptional factors Any protein required to initiate or regulate transcription in eukaryotes. Western blotting: This technique is designed to detect specific protein.After separation of the proteins by gel eletrophoresis,proteins are blotted to a filter paper and specific ones detected by labeled antibodies. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Midthun DE et al,.(1997) Postgrad. Med 101: 187-194 2. Feng G et al., (2001) Cancer Res. 61: 7999-8004 3. Gargiullo P et al., (2002) MMWR 51: 49-53 4. Steinmetz KA et al., (1991) Cancer Causes Control 2: 325-357 5. Block G et al., (1992) Nutr. Cancer 18: 1-29 6. Leighton T et al., (1992) (Washington: American Chemical Society) pp. 229-238 7. Messina MJ et al., (1994) Nutr. Cancer 21: 113-131 8. Stavric B (1994) Clin. Biochem. 27: 245-248 9. Anton R (1988) (eds.) (New York: Alan R. Liss, Inc.) volume 280 pp. 423-439 10. Aligiannis N et al., (2001) Planta Med. 67: 468-470 11. Constantinou A et al., (1995J Nat. Prod. 58: 217-225 12. Lee SC et al., (1998) Anticancer Res. 18: 1117-1121 13. Bokkenheuser VD et al., (1988) (New York: Alan R. Liss, Inc.) 14. Whitten P et al., (1991 (New York: Raven Press) 15. Kostrzewska A et al., (1993) Eur. J Pharmacol. 233: 127-134 16. Oliveira EJ et al., (2000) FEBS Lett. 471: 1-6 17. Ferrell JE Jr et al., (1979) Mol. Pharmacol. 16: 556-568 18. Landolfi R et al., (1984) Biochem. Pharmacol. 33: 1525- 1530 19. Rogers JC et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 419-425 20. Dimas K et al., (2000) Pharmacol. Res. 41: 85-88 21. Kuo ML et al., (1994) Cancer Lett. 87: 91-97 22. Roth A et al., (1999) J. Neurosci. Res. 57: 399-404 23. Ranelletti FO et al., (1992) Int. J. Cancer 50: 486-492 24. McCawley LJ et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 4347- 4353 25. Foey AD et al., (1998) J Immunol. 160: 920-928 26. Moos PJ et al., (1998) Cell Growth Differ. 9: 687-697 27. Warne PH et al., (1993) Nature 364: 352-355 28. Crews CM et al., (1992) Science 258: 478-480 29. Her JH et al., (1993) Biochem. J 296: 25-31 30. Anderson NG et al., (1990) Nature 343: 651-653 31. Marais R et al., (1993) Cell 73: 381-393 32. Bueno OF et al., (2000) EMBO J 19: 6341-6350 33. Remacle-Bonnet MM et al., (2000) Cancer Res. 60: 2007- 2017 34. Bhat NR et al., (1999) J Neurochem. 72: 112-119 35. Kulik G et al., (1997) Mol. Cell Biol. 17: 1595-1606 36. Franke TF et al., (1995) Cell 81: 727-736 37. Page C et al., (2000) Anticancer Res. 20: 407-416 38. Datta SR et al., (1997) Cell 91: 231-41 39. Zha J et al., (1996) Cell 87: 619-628 40. Fisher TC et al., (1993) Cancer Res. 53: 3321-3326 41. Boise LH et al., (1993) Cell 74: 597-608 42. Hockenbery D et al., (1990) Nature 348: 334-336 43. Hickman JA (1992) Cancer Metastasis Rev. 11: 121-139 44. Lim IJ et al., (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107: 797-808 45. Huynh H et al., (2002) Cell Growth Differ. 13: 115-122 46. Cai J et al., (1998) Acta 1366: 139-149 47. Zou H et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 11549-11556 48. Germain M et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 28379- 28384 49. Lotem J et al., (1995) Cell Growth Differ. 6: 647-653 50. Downward J (1999) Nat. Cell Biol. 1: E33-E35 51. He H et al., (1999) Cell Growth Differ. 10: 307-315 52. Guyton KZ et al., (1996) J Biol. Chem. 271: 4138-4142 53. Aikawa R et al., (1997) J Clin. Invest 100: 1813-1821 54. Favata MF et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 18623- 18632 55. Sanchez I et al., (1994) Nature 372: 794-798 56. MacKeigan JP et al., (2000) J Biol. Chem. 275: 38953- 38956 57. Amato SF et al., (1998) Cancer Res. 58: 241-247 58. Wei H et al., (1990) Cancer Res. 50: 499-502 59. Zhou JR et al., (1998) Cancer Res. 58: 5231-5238 60. Shao ZM et al., (1998) Cancer Res. 58: 4851-4857 Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 79 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 61. Muzio M et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 2926-2930 66. Wang CY et al., (1999) Mol. Cell Biol. 19: 5923-5929 62. Vander Heiden MG et al., (1999) Nat. Cell Biol. 1: E209-E216 67. Lee LF et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 28253-28260 68. Yujiri T et al., (1998) Science 282: 1911-1914 63. Chao DT et al., (1998) 16: 395-419 69. Lieu CH et al., (1998) Cell Growth Differ. 9: 767-776 64. Reed JC (1998) Oncogene 17: 3225-3236 70. Kalechman Y et al.,(2000) Int J Cancer 86: 281-288 71. Qiao, L et al., (2002) In press 65. Khwaja A (1999) Nature 401: 33-34 Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 80