Tổng quan về cây cacao

Phần 2 Tổng quan tài liệu šv› 2.1.Giới thiệu tổng quan về cây cacao Cây cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L. (2n = 20), thuộc họ Sterculiacea, là cây duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma được trồng sản xuất. Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng cacao: - Nam Mỹ: Brazil, Ecuador. - Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria. - Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam. 2.1.1.Nguồn gốc cây cacao Cacao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được người Maya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt. Từ “cacao” từ tiếng Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này. Cacao xuất hiện lần đầu tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605. 2.1.2.Đặc điểm hình thái Hình 2.1: Theobroma cacao Rễ: rễ cacao có dạng trụ, dài khoảng 1.5-2 m. Trên suốt chiều dài của rễ trụ có nhiều rễ ngang phân nhánh và rất nhiều rễ con tập trung chủ yếu dưới cổ rễ khoảng 20 cm. Thân: Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao từ 10-20 m nếu mọc tự nhiên. Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây cacao khoảng 5-7 m, đường kính khoảng 10-18 cm. Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4-5 tầng cành. Lá: Lá cacao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống. Màu sắc lá thay đổi tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Trong quá trình trưởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thể nằm ngang. Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng. Khí khổng chỉ có mặt ở dưới phiến lá. Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào và chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh. Lá tồn tại được từ 4-5 tháng, sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng. Hoa: Hoa cacao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành. Hằng năm, hoa xuất hiện trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa. Hoa có cuống dài 1-3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài. Hoa nở từ 3 giờ chiều đến 9 giờ sáng hôm sau. Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào giống. + Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ tím…Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển qua màu da cam. + Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơi dài, nhọn hoặc hình trứng. Thường quả có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm. Hạt: Hạt cacao không có nhân, mập, dài 2-3 cm và có cùi nhớt màu trắng, có vị hơi chua bao bên ngoài. Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấy hạt ở bên trong. Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối với giống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men. Kích thước hạt có thể thay đổi tùy theo giống và mùa vụ. Mỗi quả cacao có từ 30-40 hạt. 2.1.3.Yêu cầu sinh thái Khí hậu: Cacao thường được trồng ở các vùng có độ cao 800 m so với mực nước biển, trên các vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm. Cây cacao thích nghi tốt ở nhiệt độ tối đa là 30-32oC và nhiệt độ tối thiểu là 18-21oC. Cây bị thiệt hại nghiêm trọng ở nhiệt độ nhỏ hơn 10oC. Ẩm độ thích hợp cho cây khoảng 70-80%. Cacao đặc biệt sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện che bóng (chỉ cho 70% lượng ánh sáng lọt qua). Đất: Cacao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau, đất cát, đất phù sa ven sông, đất trên các triền dốc và cả trên đất nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và gần nguồn nước. Cacao sinh trưởng và phát triển tốt nhất với đất có độ pH trong khoảng 5.5-6.7. Đất phải đảm bảo khả năng thoát nước tốt nhưng đồng thời cũng giữ nước tốt. Vì thế, ở nước ta, cacao thường được trồng ở Tây Nguyên, Duyên Hải Miền Trung, Đông Nam Bộ và một số tỉnh miền Tây Nam Bộ. 2.1.4.Các giống cacao Trên thế giới, cacao có nhiều dòng, nhóm. Mỗi dòng, nhóm đều mang những đặc tính khác nhau, thích hợp trên những vùng sinh thái khác nhau. Hiện nay giống cacao được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm Criollo: Hoa có nhị màu vàng nhạt, trước khi chín quả có màu xanh hoặc đỏ, quả dài, chóp nhọn và có 10 khía đều nhau, vỏ quả sần sùi, mỏng, dễ cắt, hạt có tiết diện tròn, phôi nhũ có màu trắng ngà. - Nhóm Forastero – Amazone: Hoa có nhị màu tím, quả màu xanh, sau chuyển sang màu vàng, đuôi quả tròn, vỏ dày, khó cắt, ít hoặc không có khía, hạt có phôi nhũ màu đỏ tím. - Nhóm Trinitario: Có đặc tính trung gian giữa 2 nhóm Forastero và Criollo. Ở Việt Nam, giống cacao hiện có là con lai giữa nhóm Forastero và nhóm Trinitario. Tuy nhiên, trước đây, giống được trồng ở các địa phương là thế hệ con cháu của sự tạp giao giữa 3 nhóm trên. 2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất cao, có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt trong quá trình lai tạo giống. 13 dòng cacao thương mại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một số dòng như sau: Tên dòng Đời bố mẹ TD1 PA 35 x NA 32 TD3 Con lai của Trinitario TD5 UAWA 18 x T.S.15/43.352 TD10 NA 31 x PA 15 TD13 UIT 1 x NA 33 TD14 PA 173 x SCA 9 TD12 (PA 76 x SCA 20) x (UIT 1 x SCA 6) 2.2.Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng lớn nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-Dnase và Ribonuclease-Rnase) Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bước cơ bản: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào. Thông thường người ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các protein. Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng. Loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau. Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích. Mặc dù phenol làm biến tính protein nhưng nó có thể làm ức chế hình dạng của Rnase và làm dung môi cho phân tử Rnase có chứa những chuỗi dài polyA (Brawerman và ctv,1972). Do đó, có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid. Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại. Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol. Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại (Hồ Huỳnh Thùy Dương,1998). Phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế. Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, chúng ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế. Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích được. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50ng/μl cho dung dịch chứa DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD280nm. Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 đối với DNA tinh khiết. Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh, 2003) 2.3.Giới thiệu về kỹ thuật PCR 2.3.1.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau : Bước 1: Biến tính Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử DNA mới. Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70o C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai. Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m : là số bản sao của chuỗi mã hóa. n : là số chu kỳ. Hình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit. Do dó, người ta hy vọng có khoảng 105 lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp. Những phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đoạn biến tính và giai đoạn bắt cặp. Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA. Khả năng “chọn lọc” này được thực hiện thông qua sự hợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản ứng. Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và cho nó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA. Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kí hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, kí hiệu là R. Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase. 2.3.2.Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 2.3.2.1.DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003). Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch. Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2-5 phút. 2.3.2.2.Taq polmerase Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Với enzyme này, PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80oC, đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (C.R Newton và A.Graham, 1997). Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác. 2.3.2.3.Primer Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, việc thiết kế primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Vincent R. Prezioso, 2004): Chiều dài primer Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu và nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer. Thông thường primer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đặc hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợp phục vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp. Nhiệt độ nóng chảy Tm Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA. Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nói ở trên. Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại một trình tự đặc trưng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ. Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp của primer để đảm bảo tính đặc hiệu. Trình tự bổ sung trên primer Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình tự bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer với DNA. Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau để tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn. Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999). Thông thường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1μM tương đương với 2.5pmol trong 25 μl dung dịch phản ứng. Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không được quá lớn. Phản ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb (Hoàng Thị Liễu, 2004). Hàm lượng GC và AG Thành phần nucleotide của các primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lại nhiều lần. Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50% (Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắc của Wallace). Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vì điều này sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu. Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine Agcũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại. Trình tự đầu 3’ Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng “mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G-C mạnh hơn A-T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu. 2.3.2.4.Nhiệt độ bắt cặp Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào của phản ứng cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ nóng chảy Tm của primer , mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 18-24 base, trong đó hàm lượng GC chiếm khoảng 50%: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide. Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base Tms = 81.5 + 16.6(log10[J+]) + 0.41(%G+C) - (600/l) + [J+] : nồng độ mol các cation hoá trị I + (%G+C) : % nucleotide loại G và C Khi chiều dài primer từ 20 - 35 base Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T)) Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại. Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp Ta và đoán nhiệt độ nóng chảy Tm của primer là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu. Thông thường, nhiệt độ bắt cặp thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2-5oC. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm được nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm. Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5oC. Thông thường, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ bắt cặp 50-55oC. Nếu chuỗi dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp có thể đến 55-65oC. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và kéo dài có thể được kết hợp và thực hiện ở 68-72oC (Hoàng Thị Liễu, 2004). 2.3.2.5.Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như trường hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5μM (12.5 pmol/25 μL phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tượng primer-dimer. 2.3.2.6.Các thành phần khác Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20-200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp. Chất ổn định hoạt động enzyme Những hoạt chất ổn định hoạt động enzyme cũng được chú ý. Nhiều nhà sản xuất hoá chất đã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn trữ enzyme. Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm. Nhằm bảo quản và ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0.01% và Triston X-100 ở nồng độ 0.1%. Dung dịch đệm Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trường 16.6 mM ammoniumsulfate 67.7 mM TRIS-HCl, pH 8.89 10 mM beta-mercaptoethanol 170 microgams/ml BSA 1.5-3mMMgCl2 2.3.2.7.Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40. Sở dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn : Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu. Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặc các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu. Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25-30 chu kỳ . Nếu số lượng mẫu ban đầu là 102-10 3 thì số chu kỳ phải là 35-40 chu kỳ. 2.3.2.8.Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR Thực chất, một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào. Tuy nhiên, mỗi thiết bị đều có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị. Hơn nữa, ống nghiệm (eppendorf) dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng kiểu vì tính đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như nhiệt độ tiếp xúc giữa các ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị khuếch đại có ảnh hướng lớn đến kết quả PCR. 2.3.3.Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 1. Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thước dài hơn Giảm thời gian bắt cặp Tăng nhiệt độ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài đến: 62 – 68oC Tăng nồng độ KCl trong dung dịch đệm đến 1.2X – 2X nhưng vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở 1.5 – 2mM Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4.5mM nhưng vẫn giữ nồng độ dNTP không đổi Giảm nồng độ primer Giảm nồng độ DNA khuôn mẫu Giảm nồng độ Taq polymerase xuống Nếu không phải từng lý do trên thì phải kiểm tra lại trình tự primer bằng cách Blast để đối chiếu với giữ liệu trên ngân hàng gene Nếu không được thì có thể kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 2. Có nhiều sản phẩm không đặt hiệu với kích thước ngắn hơn Tăng nhiệt độ bắt cặp Tăng thời gian bắt cặp Tăng thời gian kéo dài Tăng nhiệt độ kéo dài: 74- 78oC Giảm nồng độ muối KCl xuống còn 0.7 - 0.8X nhưng vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở 1.5 – 2mM Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4.5mM nhưng vẫn giữ nồng độ dNTP không đổi Giảm nồng độ DNA khuôn mẫu Giảm nồng độ Taq polymerase xuống Nếu không phải từng lý do trên thì phải kiểm tra lại trình tự primer bằng cách Blast để đối chiếu với giữ liệu trên ngân hàng gene Nếu không được thì có thể kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 3. Không thu được bất kỳ sản phẩm nào Đảm bảo chắc chắn các thành phần PCR đã được cho vào Thay đổi dung dịch dNTP Nếu mới mua primer mới thì phải kiểm tra lại để đảm bảo độ tin cậy Tăng nồng độ primer Tăng lượng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10oC Nếu làm như vậy mà thu được sản phẩm (kể cả không đặc hiệu) thì thực hiện như đã trình bày ở trên Sản phẩm quá yếu Giảm dần dần nhiệt độ bắt cặp xuống thấp nhất đến có thể Tăng nồng độ primer Tăng lượng DNA khuôn mẫu Tăng nồng độ Taq polymerase Thay đổi nồng độ KCl (cao hơn nếu sản phẩm thấp hơn 1000bp và thấp hơn nếu sản phẩm lớn hơn 1000bp) Thêm chất bổ trợ. Tốt nhất là sử dụng BSA nồng độ cuối 0.1 – 0.8 µg/µL. Có thể thử với DMSO hoặc glycerol nồng độ cuối 5% (v/v) Kiểm tra lại trình tự primer xem có lỗi không và/hoặc tăng chiều dài primer lên 5 nucleotide Kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 2.3.4.Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do các ưu điểm sau: - Độ nhạy rất cao - Thao tác đơn giản. - Thời gian thực hiện nhanh. - Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. - Lượng mẫu cần ít. Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể có ba vấn đề lớn khi sử dụng kỹ thuật PCR: Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR với các độ dài dưới 1.5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Khi mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại, các phân tử khuếch đại sẽ thoát ra khỏi ống nghiệm và lơ lửng trong không gian phòng thí nghiệm rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau: - Các công đoạn thao tác khác nhau phải tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dụng cụ dùng để thực hiện phản ứng (micropipet không sử dụng vào các thao tác khác. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Tất cả mọi thành phần phản ứng đều chia thành những lượng nhỏ đủ với 1,2 lần thao tác. Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotid thì enzyme gắn sai một nucleotid). Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể gảm bớt. 2.4.Giới thiệu phương pháp phân tích trình tự DNA Việc phân tích trình tự được thực hiện bởi máy ABI. Máy ABI có thể phát hiện cùng một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau, tạo một kết hợp cho phép truyền đi bốn màu huỳnh quang khác nhau. Sự phát hiện cùng một lúc như vậy là nhờ một camera phân biệt rõ ánh sáng với nhiều độ dài sóng khác nhau được dẫn truyền qua một lưới nhiễu xạ. Đó là camera có tên kỹ thuật CCD, viết tắt từ chữ “chatge-couple-device” (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2000). Có hai hóa chất trong máy ABI, đó là primer nhuộm màu (dye primer) và terminator nhuộm màu. Ở đề tài này chúng tôi sử dụng dye primer, màu nhuộm huỳnh quang gắn dính trong primer (Smith và ctv,1986). Phương pháp dye primer có ưu điểm là tín hiệu ghi nhận được rất đồng nhất. Máy ABI sẽ phân tích trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR. Kỹ thuật phân tích trình tự trực tiếp đối với sản phẩm PCR là một cải tiến kỹ thuật rất quan trọng trong phân tích genome. Theo phương pháp này, chúng ta có thể biết được đặc điểm của sequence mà mình nghiên cứu một cách nhanh chóng, không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone, hoặc thanh lọc các clone. Hình 2.3: Cấu trúc của máy ABI 2.5.Giới thiệu về microsatellite 2.5.1.Khái niệm về microsatellite Microsatellite ngày nay đã trở thành thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats, Edward,1991) hay VNTR (variable number of tandem repeats). Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20-100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao (đa hình theo chiều dài), là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, nó tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng. 2.5.2.Các loại microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). Những đoạn lặp lại của poly A /poly T là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau. Tuy nhiên nó không phù hợp để sử dụng trong lập bản đồ, phân tích quần thể vì nó không ổn định và bền vững trong quá trình phân tích bằng PCR. Trong quá trình này, dưới tác động của enzyme Taq polymerase nó có thể làm cho kích thước al bị thay đổi bằng cách thêm một nucleotide A vào cuối đoạn hoặc chèn vào vùng lặp lại của al (Smith và ctv., 1996). Những phân tích gần đây trong số liệu của những đoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT là loại thường gặp hơn cả ở động vật có vú, gấp đôi so với AT và gấp 3 so với AG/TC. Loại dinucleotide thường gặp ở thực vật là AA/TT và AT/TA. Chúng có thể phân ra ba loại sau: Hoàn hảo: không có sự ngắt quãng CACACACACACA Phối hợp: kết hợp nhiều loại lặp lại CACACACAGAGAGA Ngắt quãng: bị chèn bởi một hoặc nhiều bởi một hoặc nhiều base CACATTCACACATTCATT Loại có tính đa hình cao nhất là loại không bị ngắt quãng, nhưng trong thực tế các microsatellite thường bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các trình tự lặp lại. Trong số 3 nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất hiện các kiểu này tùy thuộc vào chủng loại genome. 2.5.3.Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.4: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân Quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.5: Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã 2.5.4. Vai trò của microsatellite Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hướng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv.,1990,1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997, 1998). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 2.5.5. Các phương pháp phát hiện microsatellite Có 2 phương pháp để phát hiện microsatllite: phương pháp lai và phương pháp PCR. 2.5.5.1.Phương pháp lai Phương pháp lai ghép phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc. Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lý chất thải tốn kém. Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) Phương pháp này rẻ, không hại nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 2.5.5.2.Phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Đây cũng chính là phương pháp được chúng tôi áp dụng. Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10000 phản ứng PCR. Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Người ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A,… 2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế primer PCR đặc trưng cho một locus trong genome. Vì vậy 1 cặp primer PCR có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite. Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. Hai primer PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116bp). Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. Hình 2.7 : Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite. Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel hoặc trên capillary, bằng cách nào thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi al. Thông thường sản phẩm PCR có 2 band, 1 band chính và 1 band phụ nhỏ hơn band chính 2bp (Murray và ctv., 1993). Sự xuất hiện của band phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA polymerase (Tautz,1989), band phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của band chính, nhưng band phụ cũng có thể được xem như 1 dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel với band chính màu đen và band phụ màu xám. MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR. Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên cappilary của máy giải trình tự DNA. Vị trí của các peak trên trục ngang tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR và chiều cao của peak biểu thị tổng lượng sản phẩm PCR. Band chính tạo ra các peak cao hơn band phụ. MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR. 2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài Rất nhiều microsatellite được tìm thấy ở các vùng tương ứng ở cùng gen ở các loài khác nhau. Rất nhiều tài liệu đã công bố sự bảo tồn của microsatellite ở các bộ gene của các loài động vật có vú như ở trâu, bò, hươu, cừu, dê. Do đó có thể áp dụng kết quả nghiên cứu từ trâu sang bò hay các loài khác và ngược lại. Khả năng sử dụng cùng loại primer microsatellite giữa các loài khác nhau phụ thuộc vào sự di truyền ổn định của trình tự microsatellite và mức độ bảo tồn (hay giống nhau) của vùng flanking (nằm ở 2 bên trình tự microsatellite) trong quá trình tiến hóa của loài. Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài khác nhau sẽ làm tăng giá trị của những primer đó, tuy nhiên số loài có khả năng chuyển đổi primer microsatellite cũng rất giới hạn (Roder và ctv., 1995). Khi áp dụng những cặp primer microsatellite của loài này cho loài khác, chu trình PCR thường phải được biến đổi để thu được kết quả tốt. Thông thường nhiệt độ bắt cặp sẽ giảm xuống từ 2-5oC tùy theo mức độ xa hay gần trong quan hệ tiến hóa của những loài đó. Dayanadan và ctv.(1997) đã phát hiện ra rằng những primer có số lượng GC cao sẽ dễ áp dụng từ loài này sang loài khác mà không cần biến đổi chu trình PCR và ngược lại. 2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite Nếu chúng ta muốn áp dụng phương pháp microsatellite để nghiên cứu di truyền ở một loài nào đó thì trước tiên hãy thử áp dụng phân tích với primer microsatellite của những loài có quan hệ di truyền gần gũi với loài đó. Trong trường hợp không tìm được primer microsatellite của những loài thân thuộc, chúng ta có thể tự thiết kế primer microsatellite, bằng các bước sau: 1- Ly trích để thu DNA tổng số. 2- Phân cắt toàn bộ genome thành những đoạn DNA có kích thước trung bình từ 300-600bp bằng enzyme cắt giới hạn. 3- Chèn những đoạn DNA được cắt ở trên vào plasmid để tạo nhiều bản sao DNA, loại plasmid thường được sử dụng ở đây là PUC19 vì vị trí cắt của plasmid này đã được xác định rõ. 4- Chuyển các plasmid lên màng nylon. 5- Dùng các probe để lai với màng, probe là những oligonucleotide chứa trình tự microsatellite quan tâm (VD: (AC)10), và đã được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang. 6- Phát hiện và nuôi cấy những dòng vi khuẩn chứa plasmid cho kết quả dương tính khi lai với probe. 7- Dùng enzyme cắt giới hạn để thu lại các đoạn DNA được chèn trong plasmid, tiến hành phân tích các đoạn DNA này trên agarose gel 1%. 8- Dùng phương pháp lai Southern với các probe như trên để phát hiện lại một lần nữa các đoạn DNA chứa trình tự microsatellite quan tâm. 9- Đem giải trình tự và xác định microsatellite cũng như trình tự vùng flanking nằm ở 2 bên trình tự microsatellite, đây là vùng để thiết kế primer. 10- Chọn ra những trình tự microsatellite phù hợp nhất để thiết kế primer (thông thường phải có ít nhất 8 lần lặp lại) tùy theo mục đích nghiên cứu. 11- Tổng hợp cặp primer đặc hiệu cho từng locus, thông thường từ 20-30 bp nằm trong vùng flanking và không được nằm ngay sát với trình tự microsatellite. Primer forward được đánh dấu huỳnh quang, và màu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại bởi primer sẽ được phát hiện bằng tia laser khi đưa vào phân tích trình tự.  2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so với các phương pháp khác - Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó là khả năng phân tích tự động bằng máy giải trình tự. - Primer microsatellite có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nhà nghiên cứu vì mỗi locus có mang trình tự microsatellite đều được phát hiện bởi những cặp primer thích hợp. Primer microsatellite cũng dễ áp dụng từ loài này sang loài khác hơn phương pháp AFLP. - Phương pháp microsatellite cho kết quả phân tích tính đa hình chính xác hơn, với mức độ đa hình cao gấp 7 lần so với phương pháp RAPD (Kraic và ctv., 1998). - Hiện nay, microsatellite là công cụ chủ yếu và đang thay thế phương pháp RFLP trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền ở thực vật. Ngoài ra, sự kết hợp giữa phương pháp microsatellite và phương pháp AFLP sẽ giúp cho việc xây dựng bản đồ di truyền một cách chi tiết. - Đặc tính đồng trội (co-dominant) của microsatellite là một ưu điểm trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền, trong khi RAPD và AFLP không có đặc tính này. - Powell và ctv., (1996) đã tiến hành thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của các loại marker di truyền RFLP, RAPD, AFLP và Microsatellite trong phân tích di truyền trên cây đậu tương thông qua 2 chỉ tiêu: phân tích mức độ dị hợp và tỉ số multiplex (số loci phân tích được trong một lần thí nghiệm). Kết quả là marker microsatellite phân tích được mức độ dị hợp cao nhất (0.60), và marker AFLP cho tỉ số multiplex cao nhất. - Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại. Thứ nhất, trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellite của loài này cho loài khác. Thứ hai, do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19. 2.5.8.Ứng dụng của microsatellite Microsatellite được phát hiện và mô tả lần đầu ở người (Litt và Luty, 1989; Weber và May, 1989). Những phát hiện tương tự nhanh chóng được tìm thấy ở các loài động vật có vú như: chuột (Love và ctv.,1990), heo (Johansson và ctv., 1992) và gia súc (Kemp và ctv., 1993). Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao hơn bất kỳ marker phân tử nào khác (Saghai Maroof và ctv.,1994; Powell và ctv., 1996). Do đó, microsatellite là một công cụ rất đắc lực trong nghiên cứu đa dạng di truyền của cây trồng ( Yang và ctv., 1994; Xiao và ctv., 1996). Những cây trồng được nghiên cứu dựa trên microsatellite gần đây nhất bao gồm: gạo (Wu và Tanksley,1993), lúa mì (Saghai Maroof và ctv.,1994), lúa mạch (Roder và ctv.,1995), thông (Karhu và ctv., 2000) và cacao (Juan Carlos Motamayor và ctv., 2002). Người ta nghiên cứu được rằng tần số xuất hiện của những vùng microsatellite ở thực vật thấp hơn động vật từ 5 đến 10 lần (Lagercrantz và ctv., 1993; Powell và ctv., 1996). Mặc dù tần số microsatellite trên DNA tế bào thực vật thấp hơn động vật (Wang và ctv., 1994) nhưng các trình tự microsatellite có trong DNA lục lạp là nguồn marker rất hữu ích trong nghiên cứu tính đa hình, được áp dụng để phân loại 13 dòng Glycine (Powell và ctv., 1995). Những marker microsatellite trong lục lạp được đánh giá là công cụ đắc lực trong nghiên cứu sự phát sinh giống, loài và phân loại theo nguồn gốc địa lý (Doyle và ctv., 1998). Microsatellite cũng được phát hiện trong DNA của ti thể và đã được áp dụng nghiên cứu chuyển đổi giữa 15 loài (Soranzo và ctv., 1999). Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như: lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm ra bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt là áp dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL)…Các thông tin về microsatellite đa al của một locus cũng như trên nhiều locus có thể được phân tích bằng các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, phả hệ, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh,v.v. Người ta đã phát triển và sử dụng phương pháp xác định microsatellite trong việc đánh giá mức độ cận huyết của các cá thể và các quần thể, đồng thời áp dụng trong việc nghiên cứu cấu trúc quần thể. Trước tiên là việc đánh giá giá trị trung bình dị hợp tử cho mỗi cá thể thông qua dữ liệu microsatellite. Tiếp theo là việc xác định các kiểu đột biến của microsatellite. Nghiên cứu quá trình đột biến của microsatellite nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp xác định mức độ thân cận của các quần thể. Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể, phản ánh thời gian từ khi 2 quần thể tách nhau ra. Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có thể giúp chúng ta tính tương quan về thời gian kể từ khi 2 quần thể còn tồn tại là một. Khi 2 quần thể tách biệt nhau về mặt di truyền, 2 quá trình đột biến và phân ly dẫn đến tần số các al khác nhau rõ rệt. 2.6.Các công trình nghiên cứu có liên quan 2.6.1.Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao L. bằng microsatellite marker Trong những nghiên cứu của tổ chức USDA về DNA cacao , người ta đã xác định được 15 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR40, mTcCbIR33, mTcCIR1, mTcCIR60, mTcCIR22, mTcCIR24, mTcCIR15, mTcCIR11, mTcCIR12, mTcCIR26, mTcCIR37, mTcCIR6, mTcCIR8 có hiệu quả trong việc nhận dạng di truyền các cá thể cacao thu nhận từ ngân hàng gen cacao Quốc tế ở Trinidad. Lượng thông tin về tính đa hình thay đổi trong khoảng 0.42 đến 0.82 với giá trị trung bình là 0.67 trong số 15 loci. Tính dị hợp thay đổi trong khoảng từ 0.51 đến 0.79. Xác suất đồng nhất tích lũy của 15 loci thay đổi từ 7.87x10-5 và 1.485x10-9, phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền của quần thể. Kết quả này cho thấy xác suất phù hợp ngẫu nhiên giữa 2 kiểu gen thì không đáng kể. Vì vậy, sự phối hợp 15 cặp primer SSR trên đủ cho việc nhận diện các cá thể cacao. Sử dụng 15 cặp primer này người ta đánh giá được mức độ nhầm lẫn tên của 3 quần thể cacao thu nhận từ rừng mưa nhiệt đới Amazone vào thập niên 50. Kết quả cho thấy chỉ 2-3% tổng số cây bị đặt tên sai. Hơn nữa, người ta cũng xác minh lại nguồn gốc của những cây này bằng cách so sánh dữ liệu SSR của cây với những cây lân cận trong khu vực. Do vậy, SSR marker là phương pháp hiệu quả và tin cậy trong việc nhận diện cá thể cacao bằng đặc trưng phân tử. (Tham khảo tại: 2.6.2.Nghiên cứu fingerprinting DNA cacao sử dụng microsatellite marker Tại Đại Học Penn State của Mỹ, các tác giả J-D Swanson, A.C.Lee và J.Guiltinan đã sử dụng 15 microsatellite primer trên (trong đó, 6 primer đầu tiên có nhiệt độ bắt cặp 51oC, 9 primer còn lại có nhiệt độ bắt cặp 46oC) trong nghiên cứu fingerprinting 8 giống cacao từ trung tâm nghiên cứu cacao ở Trinidad, bao gồm: PA30 T1, LX31, PA30 T10, GU114P, PA T5, GS4/4A, LCTEEN 68-1 và IMC47. DNA được ly trích bằng Quiagen DNeasy kit. Sản phẩm PCR được phân tích trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100. Mỗi mẫu được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Kết quả 11 primer cho kết quả khuếch đại tốt, chỉ 4 primer (mTcCIR40, mTcCIR33, mTcCIR12, mTcCIR6) không cho kết quả sau nhiều lần thí nghiệm. Kết quả phân tích fingerprinting cho dữ liệu nhị phân được trình bày trong bảng 2.1. (Tham khảo tại: USDA Cacao DNA Fingerprinting- Ring Test Results from Penn State Iniversity) Bảng 2.1: Kết quả phân tích fingerprinting Primer Kích thướcđoạn DNA (bp) 1 2 3 4 5 6 7 8 mTcCIR7 118-120 0 1 1 0 1 1 1 1 mTcCIR7 132-133 1* 1 0 0 0 0 1 0 mTcCIR7 134 1* 0 1 1 1 1 1 1 mTcCIR7 138-139 0 1 0 0 0 0 1* 0 mTcCIR7 143-144 0 1* 0 0 0 0 1* 0 mTcCIR7 153-155 1* 1 1 1 0 0 0 1 mTcCIR7 156-158 1 1 1 0 1 1 0 1 mTcCIR7 162-163 0 0 0 0 0 1 0 0 mTcCIR7 168 0 0 0 1* 0 0 0 0 mTcCIR7 190 1* 0 1 1* 1 1 0 0 mTcCIR37 144 1* 0 0 0 0 1* 0 1 mTcCIR37 159-160 1* 0 0 0 0 0 0 1* mTcCIR37 163 0 0 0 1 0 0 1 0 mTcCIR37 165 0 0 0 1* 0 0 1 1* mTcCIR60 190-191 0 0 1* 0 1 1 0 1* mTcCIR60 193 0 0 0 0 0 0 1 0 mTcCIR60 208-210 1 1 1 1* 1 1 0 1 mTcCIR60 211-213 1 1 1 1 0 0 1 1 mTcCIR60 221 0 1 0 1* 1* 1* 1* 1 mTcCIR1 127 0 0 1 1 0 0 0 0 mTcCIR1 129-131 1 1 1* 1 1 0 1 1* mTcCIR1 143 0 1* 0 1 1 1 1* 1* mTcCIR1 150 0 1 1 1 1 1* 1* 1* mTcCIR11 129-130 0 1 1* 0 0 0 0 0 mTcCIR11 141 0 1 1* 1* 0 1* 0 0 mTcCIR11 253-254 1 1* 1* 0 1 1 1 0 mTcCIR11 272 0 0 0 0 0 1* 0 0 mTcCIR11 288 0 0 0 0 1 0 0 0 mTcCIR11 298-300 0 0 1 1 0 1* 1* 0 mTcCIR11 308 1 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR11 314 0 1* 0 1 0 0 1 1 mTcCIR11 324 0 0 1* 0 1 1* 0 1 Primer Kích thướcđoạn DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 mTcCIR18 320 0 1* 1* 0 0 0 0 0 mTcCIR18 330 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR18 332 0 0 0 0 1 1 0 0 mTcCIR18 334 0 0 1 0 1 0 0 0 mTcCIR18 342 1 1 0 1 0 0 1 1 mTcCIR18 344 1 1 0 1 0 0 1 1 mTcCIR18 354 0 0 0 0 0 1 0 0 mTcCIR22 120 1* 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR22 290 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR22 307-308 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR22 314 1* 1 0 0 1 1 1* 0 mTcCIR24 182 0 0 0 0 1* 0 0 0 mTcCIR8 239 0 1 0 0 0 1* 0 0 mTcCIR8 257-258 1* 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR8 264-266 1* 0 1 0 1 1 0 1 mTcCIR8 274-175 0 0 1 1 0 0 0 0 mTcCIR8 282-283 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR8 292 0 0 0 0 1 0 0 0 mTcCIR15 203 0 0 1 0 0 1 1* 0 mTcCIR15 221 0 0 1 0 0 0 1* 0 mTcCIR15 233 0 0 1 0 0 0 0 0 mTcCIR15 239 0 1 0 0 0 0 0 1 mTcCIR15 249-251 0 0 1 1 1* 0 1 1 mTcCIR15 284-285 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR15 300 1 0 0 0 0 0 0 0 mTcCIR26 292 0 0 0 1 0 0 0 0 mTcCIR26 294-296 0 1* 1 0 1* 1 mTcCIR26 301 1 1 0 0 0 1 1 1 mTcCIR26 303 0 0 1 0 0 0 0 0 Trong đó: 1: kết quả điện di có hiện diện một band. 0: kết quả điện di không có band nào. *: primer chỉ cho kết quả khuếch đại 2 trong 3 lần lặp lại thí nghiệm. Kí hiệu của 8 giống phân tích microsatellite theo thứ tự từ 1 đến 8: PA30 T1, PA30 T10, LCTEEN 68-1, LX31, IMC47, GU114P, GS4/4A và PA T5. Trên cơ sở tham khảo kết quả trên, chúng tôi chọn các cặp primer: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15, mTcCIR18 vì năm cặp primer này cho các đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giữa các giống cacao phù hợp với mục đích định danh và phân tích đa dạng di truyền.