Tổng quan nhuộm soi AFB, cấy vi khuẩn lao và kháng sinh đồ kháng lao

Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 TỔNG QUAN NHUỘM SOI AFB, CẤY VI KHUẨN LAO VÀ KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO Ngô Thanh Bình* PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỬ, BẢO nghiệm trong vòng một tuần nhưng tốt nhất là QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN chuyển ngay trong ngày. Để khử trùng mẫu thử, người ta dùng một số dd để loại bỏ VK ngoại Mẫu thử được nhuộm soi trực tiếp tìm nhiễm như: dung dịch (dd) Zepharin gồm AFB (acid fast bacilli) và cấy tìm vi khuẩn (VK) Benzalkonium + Trisodium phosphate hoặc lao được đựng trong những dụng cụ vô trùng NaOH2%, NaOH4%; dd NaOH2% + nhanh chóng đem đến phòng xét nghiệm và xử dithiothreitol; dd NaOH2% + N-Acetyl-L- lý ngay. Mẫu thử thường được lấy để tìm VK lao Cysteise (NALC); dd NaOH4% + Dithiothreitol; là đàm (nếu có nghi ngờ lao phổi). Đàm được lấy dd NaOH4% + NALC (NALC và Dithiothreitol làm 3 mẫu liên tục vào sáng sớm khi mới ngủ dùng ly giải chất nhầy). Mẫu thử sau khi được dậy. Bệnh nhân (BN) được hướng dẫn để khạc xử lý bằng dd khử trùng sẽ được quay ly tâm với ra đàm nhớt từ đường hô hấp dưới hoặc cho BN vận tốc 3.000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, các chất thở khí dung với nước muối sinh lý ưu trương, lipids thành tế bào nổi lên sẽ được loại bỏ, chỉ lấy sau đó lấy mẫu đàm. BN hít sâu 2 - 3 lần, cố gắng phần cặn lắng chứa các Mycobacteria(2,3,7,34). ho khạc sâu từ trong lồng ngực. Mở lọ đàm, đưa PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOI AFB TRỰC lại gần miệng và nhổ đàm vào lọ (chú ý không TIẾP lấy nước bọt hoặc nước mũi). Đóng nắp lọ lại Quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi (KHV) một cách chắc chắn. Chất lượng mẫu đàm tốt là sau khi mẫu thử đã nhuộm acid nhanh (AFB) là đàm đặc, được khạc sâu từ trong phổi, đàm nhầy phương pháp (PP) nhanh nhất để tìm VK lao. mủ, ít nhất là 2 ml đàm. Mẫu đàm có chất lượng Nếu AFB (+) sẽ hỗ trợ cho bằng chứng bị bệnh tốt sẽ làm tăng khả năng phát hiện AFB. Trong lao trước khi có kết quả xác định VK lao bằng PP trường hợp BN không khạc ra đàm được, nhất là cấy mẫu thử. Chất lipid cao ở thành tế bào trẻ nhỏ hoặc BN hôn mê, thì có thể lấy dịch dạ Mycobacterium ngăn cản sự thấm thuốc nhuộm dày; nếu BN thở máy có đặt ống nội khí quản thì anilin. Do đó, VK lao không nhuộm được bằng có thể lấy đàm qua ống nội khí phế quản. Dịch kỹ thuật nhuộm Gram mà chỉ có thể nhuộm với dạ dày được xử lý trong 4 giờ, nên cho thêm phương pháp (PP) nhuộm acid nhanh. Có 2 PP Sodium Carbonate hoặc một muối đệm khác nhuộm acid nhanh thường dùng: (1) Nhuộm trung hòa acid dịch vị để bảo vệ VK lao hiện Carbol-fuchsin gồm kỹ thuật Ziehl-Neelsen và diện trong mẫu thử. Có thể lấy mẫu thử là dịch kỹ thuật Kinyoun; và (2) Nhuộm Fluorochrome rửa qua soi rửa phế quản. Các mẫu thử khác dùng thuốc nhuộm Auramin – cũng được lấy để soi cấy tìm VK lao (tùy trường Rhodamine(2,3,7,10,14,23,34). hợp bệnh lý cụ thể) như: máu, dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch khớp, nước tiểu, tủy Phương pháp nhuộm Carbol-fuchsin xương, dịch não tủy, mủ, mô bệnh Tất cả các Nhuộm Ziehl-Neelsen và nhuộm Kinyoun mẫu thử nếu không xử lý ngay được nên bảo khác nhau trong kỹ thuật nhuộm là chủ yếu. Kỹ quản ở 4 – 100C, tốt nhất là để ngăn mát tủ lạnh, thuật Ziehl-Neelsen đòi hỏi hâm nóng Cabol- cho đến khi chuyển đi. Tránh nhiệt độ cao và fuchsin để thấm vào thành tế bào Mycobacteria. ánh sáng mặt trời. Chuyển đến phòng xét Kỹ thuật Kinyoun là PP nhuộm “lạnh” bằng * Bộ môn Lao và Bệnh phổi - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Ngô Thanh Bình ĐT: 0908955945, Email: bsthanhbinh@yahoo.com 26 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan cách cho nhiều phenol vào dd nhuộm để tăng mặt tiêu bản hầu như hoàn toàn biến mất tính thấm vào thành tế bào Mycobacteria. Cả 2 PP đi. nhuộm đều cho kết quả VK lao bắt màu đỏ nổi (8) Rửa tiêu bản nhẹ nhàng với nước sạch để bật trên nền xanh methylene. Kính phết được tẩy hết dd thuốc nhuộm, và nghiêng tiêu quan sát dưới KHV vật kính 100 có ngâm dầu. bản cho chảy hết nước khỏi tiêu bản. Nếu Kỹ thuật Ziehl-Neelsen tìm AFB trực tiếp trong bề mặt tiêu bản còn màu hồng phải tiến đàm vẫn được đánh giá là một PP nhanh nhất hành tẩy màu lần thứ hai (từ 1–3 phút), sau (chỉ sau vài chục phút), dễ làm và rẻ tiền nên đó rửa lại với nước sạch và nghiêng tiêu được sử dụng rộng rãi. Nhược điểm của PP này bản để nước chảy ra hết. chỉ cho kết quả soi AFB (+) khi có ít nhất 105 VK (9) Nhỏ Bleu methylen 0,3% phủ kín bề mặt lao trên một lam kính. tiêu bản và để trong một phút. Quy trình tiến hành kỹ thuật Ziehl-Neelsen (10) Rửa tiêu bản nhẹ nhàng với nước sạch và nghiêng tiêu bản cho chảy hết nước khỏi để nhuộm soi tìm AFB trong đàm tiêu bản, rồi để khô tự nhiên trong không (1) Ghi số lên tiêu bản vào bên trái lam kính, khí. Không làm khô lam bằng giấy thấm. đảm bảo số tên mỗi tiêu bản tương ứng với (11) Soi lam dưới KHV với vật kính dầu x100 số ghi trên thành lọ đàm. (trong khoảng 5 phút) và đọc kết quả. Bắt (2) Dàn tiêu bản: dùng que lấy mẫu đàm tươi đầu đọc từ phần giữa đầu trái tiêu bản qua phết trực tiếp trên lam kính với kích thước phải, chuyển dòng khác từ phải qua trái. 1 x 2 cm. Dàn đàm trải đều, mịn ra trên lam VK lao có hình que, thanh mảnh, hơi cong, kính, theo đường xoáy ốc liên tục từ trong bắt màu đỏ đứng riêng biệt hay xếp đôi ra ngoài. Vết dàn cân đối ở giữa lam, với độ hoặc từng đám dễ nhận biết trên nền xanh. dày vừa phải. Để tiêu bản khô tự nhiên Đếm số lượng AFB và ghi kết quả. Kết quả trong 15 – 30 phút. Không dùng ngọn lửa (+) tính phải ghi bằng mực đỏ. để làm khô. (3) Cố định tiêu bản: đưa tiêu bản nhanh qua Bảng 1: Cách đọc kết quả của PP nhuộm Carbol- phía bên trên ngọn lửa đèn cồn từ 3 – 5 lần, Fuchsin mỗi lần 3 – 4 giây, mặt lam kính có chứa Kết quả soi Kết quả đọc Phân loại > 10 AFB/1 vi trường Dương tính (+++) mẫu thử được đặt hướng lên phía trên. 1-10 AFB/1 vi trường Dương tính (++) (4) Các tiêu bản được xếp theo thứ tự lên giá 10-99 AFB/100 vi Dương tính (+) nhuộm, cách nhau mỗi 0,5 cm. Sau đó, trường nhuộm tiêu bản bằng cách nhỏ dd carbol 4-9 AFB/100 vi trường Dương tính Ghi số VK cụ thể fuchsin 0,3% lên phủ kín toàn bộ bề mặt 1-3 AFB/100 vi trường Âm tính Xin thử lại tiêu bản và để trong 5 phút. Mỗi lần nhuộm 0 AFB/ 100 vi trường Âm tính 0 không quá 12 tiêu bản. Phương pháp nhuộm Fluorchrome (5) Hơ nóng tiêu bản từ phía dưới cho tới lúc Nhuộm Auramine 0, VK lao có màu vàng Fuchsin bắt đầu bốc hơi khoảng 5 phút sáng trên nền đen và dễ dàng thấy dưới vật kính (không để ngọn lửa lâu và Fuchsin sôi). 25. Nhuộm Auramine - Rhodamine bằng cách (6) Rửa tiêu bản với nước sạch, nhẹ nhàng dưới vòi nước máy để loại bỏ Fuchsin thừa cho thêm Rhodamine vào sẽ cho kết quả màu và nghiêng tiêu bản cho chảy hết nước khỏi hơi vàng của VK lao. Kỹ thuật này dùng nhuộm tiêu bản. Lúc này tiêu bản có màu hồng. những mặt cắt mô để tìm VK lao. Đếm số lượng (7) Tẩy màu tiêu bản đã nhuộm bằng cách nhỏ AFB trên những lam nhuộm Fluorochrome dưới dd H2SO4 25% (hoặc dd HCL 3%) lên tiêu KHV vật kính 25. bản và để trong 3 phút. Màu hồng trên bề Chuyên Đề Nội Khoa I 27 Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Bảng 2: Cách đọc kết quả của PP nhuộm Dàn tiêu bản không quá dày hoặc quá mỏng. Fluorochrome Cố định tiêu bản đủ thời gian. Nhuộm Carbol Số lượng VK thấy được Kết quả Fuchsin đủ trong 5 phút và phải đọc đủ 100 vi 0 AFB / lam kính âm tính trường. 1-2 AFB /lam (+) Lọ đàm, tiêu bản và phiếu xét nghiệm phải 3-9 AFB /lam (++) ghi chính xác. Đối chiếu sổ xét nghiệm chính xác 10 AFB /lam (+++) 1 AFB /quang trường (++++) trước khi ghi kết quả. Ghi và báo cáo kết quả chính xác. PP nhuộm Fluorochrome nhạy hơn PP nhuộm Carbol-fuchsin. Kính phết nhuộm PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH DANH VI Fluorochrome có thể được quan sát dưới KHV KHUẨN LAO vật kính 25. Trong khi vật kính dầu dùng để Mẫu thử sau khi được nhuộm soi AFB trực quan sát kính nhuộm Carbol-fuchsin. PP nhuộm tiếp, cho dù kết quả dương hay âm, cũng đều Fluorochrome là PP nhuộm không phân biệt nên cấy để xác định VK lao. Xác định sớm tình được những vi sinh vật chết. trạng VK lao kháng thuốc là một trong những Ngoài ra, VK lao đã được điều trị bằng hóa ưu tiên của chương trình chống lao nhằm giúp trị liệu có thể nhuộm bằng PP huỳnh quang. đề ra chiến lược điều trị lao thích hợp và giám Tuy nhiên, thầy thuốc lâm sàng nên chú ý sát chặc chẽ sự kháng thuốc. Xác định VK lao rằng sự hiện diện của VK lao qua PP soi trực kháng thuốc được thực hiện bằng những PP tiếp không thể chắc chắn chẩn đoán bệnh lao xét nghiệm cổ điển dựa vào việc xác định sự (dương tính giả). phát triển của VK lao với sự có mặt của thuốc Phòng ngừa đọc sai kết quả nhuộm soi AFB kháng lao. Tuy nhiên, PP này đòi hỏi phải có thời gian dài cần thiết để cho kết quả. Những Phòng ngừa đọc sai kết quả dương tính năm gần đây, nhiều kỹ thuật mới đã được tiếp Đảm bảo không có thức ăn hoặc chất xơ cận bao gồm các PP dựa vào kiểu hình và PP trong mẫu đàm. Tốt nhất cho BN súc miệng dựa vào kiểu gen. Các PP xác định VK lao bằng nước sạch trước khi khạc đàm để không bị kháng thuốc(2,3,6,7,10,11,14,17,20,21,23,34): lẫn thức ăn. Môi trường nuôi cấy kinh điển Dùng tiêu bản (lam kính) mới, không có vết trầy xước. Sử dụng que phết đàm riêng cho từng Có 4 loại môi trường cấy kinh điển khác bệnh phẩm. Dùng Carbol Fuchsin đã được lọc và nhau được dùng để nuôi cấy VK lao như môi còn hạn sử dụng. Không để Carbol Fuchsin khô trường trứng, môi trường agar, môi trường trong khi nhuộm. Tẩy màu bằng cồn acid. chất lỏng và môi trường chọn lọc. Không để vật kín dầu chạm vào tiêu bản. Môi trường trứng (egg-based) Lau vật kính dầu sau mỗi lần soi tiêu bản (+). Chứa các thành phần như trứng, khoai tây, Các lọ đàm, tiêu bản và phiếu xét nghiệm muối, glycerol và malachite green (một loại phải được ghi chính xác. Đối chiếu sổ xét nghiệm thuốc nhuộm). Môi trường này được làm đặc bởi 0 chính xác trước khi ghi kết quả. Ghi và báo cáo nhiệt độ 85 - 90 C trong 30 - 45 phút, gồm: (1) kết quả chính xác. môi trường Lowenstein - Jensen thường dùng nhất; (2) môi trường Petragnani ức chế VK tạp Phòng ngừa đọc sai kết quả âm tính nhiễm mạnh nhất dùng trong những tạp khuẩn Đảm bảo bệnh phẩm là đàm, không phải mạnh; (3) môi trường American Throracic nước bọt. Chọn mẫu đàm đặc, mủ để làm tiêu Society là môi trường hữu dụng cho Mycobacteria bản. Đủ số lượng đàm cần thiết (ít nhất là 2 ml). mọc và phát triển đối với mẫu thử không bị 28 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan ngoại nhiễm. Môi trường Thành phần Tác nhân ức chế Middlebrook Muối, glycerol, albumine, Malachite-green Môi trường thạch (agar –based) 7H11 vitamines, cofactors, oleic 0,0025% Gồm Middle brook 7H10; Middle brook acid, catalase, 0,1%casein hydrolysate. 7H11; Middle brook 7H12. Các môi trường Middlebrook 7H9 broth, casein 5 loại KS. Middle brook 7H10 và 7H11 là môi trường chứa 7H12 hydrolysate, bovine serum albimine, catalase, agar, hợp chất hữu cơ, muối, glycerol, và 14 C.-palmitic acid. albumine. Môi trường Middle brook 7H11 khác Bảng 4: Các môi trường cấy tìm VK lao có chọn lọc với 7H10 vì có cho thêm 0,1% casein hydrolysate, Môi trường Tác nhân ức chế chất này làm tăng tốc độ phát triển có chọn lọc Mycobacterium. Nói chung, VK lao phát triển tốt Lowenstein-Jensen Penicilline, Nalidixic acid, và trong môi trường Middle brook 7H11 hơn là môi Gruft Malachite green. trường Lowenstein-Jensen. Middlebrook 7H11 Carbenicilline, Polymycine B, chọn lọc Trimethoprim lactate, Amphotericin Môi trường chất lỏng B, và Malachite green. MycobactoselR Lincomycine, Cycloheximide, Được dùng trong kỹ thuật MODS Lowenstein-Jensen Nalidixic acid, và Malachite green. (Microscopic observation broth-drug Middlebrook 7H12 Polymyxin, Azlocilline, Nalidixic acid, susceptibility assay) dùng để phát hiện sớm M. bức xạ Trimethoprim, và Amphotericin B. tuberculosis mọc trong môi trường chất lỏng, rút Kỹ thuật cấy tìm VK lao qui ước ngắn thời gian chẩn đoán và làm kháng sinh Sau khi quay ly tâm mẫu thử lấy 0,25 ml (KS) đồ. PP này dựa trên quá trình tạo thành lõi phần cặn lắng của mẫu thử phết trên bề mặt đặc trưng của M. tuberculosis trong môi trường môi trường cấy chứa trong ống nghiệm và hòa chất lỏng được quan sát dưới KHV với mặt thấu 0,5 ml nếu trên môi trường cấy trong đĩa. Nắp kính lồi. đậy ống nghiệm để hé mở để cung cấp đủ khí Môi trường chọn lọc CO2 cho môi trường cấy. Còn đĩa chứa môi Là môi trường cấy được cho thêm KS để ức trường cấy được đặt trong túi nhựa chế VK ngoại nhiễm. Một số môi trường chọn polyethylene có thể thấm được CO2. Tất cả lọc thường dùng gồm: Lowenstein-Jensen Gruft; môi trường cấy được ủ trong 8 tuần ở nhiệt độ Mycobactosel® (BBL Microbiology Systems, 350C, trong đó 3 - 4 tuần đầu tiên của thời gian Cockeysville, MD); Selective Middle brook 7H11 ủ nên để 5 - 10% áp lực CO2 trong môi trường (S7H11); BACTEC® Middle brook 7H12. cấy. Những mẫu thử có AFB dương tính, nhưng kết quả cấy âm tính sau 8 tuần ủ thì Bảng 3: Các môi trường cấy tìm VK lao: nên ủ thêm 8 tuần nữa. Trong 4 tuần đầu tiên Môi trường Thành phần Tác nhân ức chế Môi trường trứng (Egg based) thì phải kiểm tra hai lần mỗi tuần, và 4 tuần Lowenstein- Trứng đông lạnh, muối, Malachite-green còn lại thì tối thiểu một lần mỗi tuần. Khi Jensen glycerol, khoai tây lát. 0,025% những khúm Mycobacteria mọc quan sát được Petragnani Trứng đông lạnh, khoai Malachite-green thì các kỹ thuật khác có thể được thực hiện tây, glycerol, sữa, khoai 0,052% tây lát. dựa trên các khúm VK lao đang mọc như: lam American Lòng đỏ trứng đông lạnh, Malachite-green kính phết nhuộm acid nhanh, KS đồ, xét Thoracic glycerol, khoai tây miếng. 0,02% Society nghiệm hóa sinh, xét nghiệm khảo sát acid Môi trường thạch (Agar based) nucleic. Cấy tìm M. tuberculosis có thể được Middlebrook Muối, glycerol, dextrose, Malachite-green phát hiện 12 ngày sau khi tiêm trên môi 7H10 albumine, vitamines, 0,0025% trường trứng hoặc trên môi trường không cofactors, oleic acid, catalase. chọn lọc trong đĩa cấy. Tuy nhiên, thời gian mọc trung bình trong môi trường thuận lợi là Chuyên Đề Nội Khoa I 29 Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 3 - 4 tuần. Có những chủng đòi hỏi 6 tuần có ống đèn lọc huỳnh quang. Ống đèn lọc này trước khi những khúm VK có thể phát hiện rõ tạo ra khí Cyanogen chloride phản ứng với ràng. Tốc độ mọc thật sự của Mycobacteria Niacin tự do trong dịch chiết xuất và cho ra kết được xác định bởi nuôi cấy cấp hai trong môi quả màu vàng. Kết quả này được gọi là xét trường canh cấy Middlebrook 7H9 và ghi nghiệm Niacin dương tính chứng tỏ mẫu thử có nhận thời gian cần thiết cho sự phát triển VK chứa M. tuberculosis. Mặt khác, M. tuberculosis lao. Những khúm M. tuberculosis thì gồ ghề, không thể chuyển hoá chất niacin sản xuất ra, giống như bông cải và có màu da bò nhạt. bài xuất vào môi trường nuôi cấy. Có nhiều Các PP khác cấy tìm VK lao phương pháp phát hiện Niacin và các phương pháp này đều phải cho thêm cyanogen bromide. Phát hiện bằng đo bức xạ kế Xét nghiệm khử Nitrat Là một kỹ thuật tự động đã được phát triển trong việc phát hiện nhanh VK lao mọc Cho biết khả năng của một chủng sản xuất ra trên các mẫu thử. Hệ thống BACTEC® enzym khử nitrate thành nitrite, dùng để phân (Johnston Laboratories Inc., Cockeysville, MD) biệt M. tuberculosis với Mycobacteria tạo sắc tố dùng môi trường Middle brook 7H12 lỏng trong tối (scotochromogenic Mycobacteria) và M. chứa acid palmatíc đánh dấu C14 để phát hiện avium-intracellular complex. M. tuberculosis có VK lao mọc bằng bức xạ kế. C đánh dấu được chứa men nitroreductase và cho kết quả dương tạo ra như CO2 trong suốt quá trình mọc và tính mạnh. Một loopful Mycobacteria đang mọc trao đổi khí. Khi sự phát triển VK lao đạt đến có hoạt tính được nhũ tương hóa trong dd sự phát triển được quyết định trước là số mũ Sodium Nitrat và ủ trong 2 giờ ở 370C trong một 10, như được quyết định bởi số lượng CO2 bồn nước. Những chất phản ứng thử xét nghiệm được tạo ra, một kết quả dương tính được ghi (gồm dd Sulfanilamide và Noun- nhận bởi hệ thống BACTEC®. Thuận lợi của kỹ naphthylenediamine) được cho vào môi trường thuật này rút ngắn thời gian phát hiện sự tăng trưởng của VK lao và phân biệt M. tuberculosis sau khi ủ. Nếu xuất hiện màu đỏ thì kết quả xét với các loại Mycobacterium không điển hình nghiệm được xem là dương tính. Ngược lại, thì khác trong 4 – 6 ngày. cho thêm bột kẽm vào, nếu màu đỏ xuất hiện thì kết quả xét nghiệm âm tính thật sự. Các xét PP sinh hóa để nhận dạng VK lao nghiệm này cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và Nhận dạng M. tuberculosis đã dựa trên một là hai xét nghiệm xác định về mặt sinh hóa số tiêu chuẩn cổ điển bao gồm: nhuộm acid nhanh, tỉ lệ mọc, hình thái khúm VK, sự tiết thường dùng nhất để định danh M. tuberculosis. niacin, sự giảm tiết nitrat, bất hoạt hóa men Một chủng có phản ứng (+) với cả xét nghiệm catalase ở 680C và tính nhạy cảm với Thiophene- niacin và xét nghiệm khử nitrate có thể định 2-Carboxylic Hydrazide (TCH). danh khá chắc chắn là M. tuberculosis. Xét nghiệm Niacin Xét nghiệm P Nitro- -acetylamino-- Niacin là một chất chuyển hóa tan được hydroxypropiophenone (NAP) trong nước của các mẫu thử có chứa Dùng để phân biệt phức hợp M. tuberculosis Mycobacteria, và được sản xuất ra sau 3-4 tuần với các loại khác. Cơ chế: dựa trên sự ức chế nuôi cấy. Hầu hết các mẫu thử đều có chứa men phức hợp M. tuberculosis bởi NAP. PP này được chuyển hóa Niacin tự do thành Niacin dùng trong hệ BACTECR bức xạ kế, cho phép xác ribonucleotide. Những M. tuberculosis thiếu vắng định phức hợp M. tuberculosis trong 5 ngày sau men này thì chất Niacin tự do sẽ được chiết xuất khi đã được cấy mọc trong môi trường Middle từ môi trường nuôi cấy và cho vào ống nghiệm brook 7H12. 30 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan Xét nghiệm nhạy cảm với Thiophene -2-Carboxylic theo dõi sự phát hiện acid tuberculostearic và acid hydrazide (TCH) acid mycocerosic trong mẫu đàm được cấy 5 Dùng để phân biệt M. tuberculosis và M.bovis. ngày được báo cáo là hữu ích cho việc chẩn đoán M. bovis nhạy cảm với TCH, còn M. tuberculosis lao trong thời gian gần đây. Tuy nhiên, PP này thì đề kháng. TCH được hợp nhất vào môi không thực tiễn cho phòng xét nghiệm lâm sàng trường cấy agar 7H11 với tỉ lệ nồng độ là 1 và 5 thường quy. /ml. Môi trường được cấy VK lao và ủ trong Xác định bằng khảo sát acid Nucleic thời gian từ 14 - 21 ngày ở 370C, với áp suất CO2 Khảo sát acid nucleic đã mở ra một kỷ là 5 - 10%. Sự nhạy cảm với TCH được quyết nguyên mới đối với phòng xét nghiệm lâm định khi khúm VK lao mọc trên môi trường agar sàng trong việc xác định nhiều loại 7H11 có chứa KS tự do và không mọc trên môi Mycobacteria. Khảo sát này được thực hiện trường TCH. nhanh chóng và dễ dàng mà bất cứ phòng xét Xét nghiệm Catalase nghiệm lâm sàng nào cũng có thể dùng khảo Hầu hết các Mycobacteria bao gồm cả M. sát này để xác định môi trường cấy. Đồng thời tuberculosis đều sản xuất ra men catalase. Tuy hiện nay dùng PP PCR (Polymerase Chain nhiên, số lượng men catalase được sản xuất ra và Reaction) để tìm VK lao bằng cách phóng đại tính ổn định của nó ở 680C thì phụ thuộc tùy loại những đoạn ADN của Mycobacterium có trong Mycobarterium. (1) Xét nghiệm định lượng: cho dd mẫu thử lên gấp nhiều lần, rồi dùng những Tween-80-peroxydase (có chứa hydrogen đoạn ADN mẫu đã được sản xuất của phòng peroxide 30%) vào môi trường cấy Lowenstein- xét nghiệm đem so sánh, cho phép xác định Jensen được để nghiêng có các khúm tế bào được chủng Mycobacteria. Độ nhạy của xét Mycobacterium đang mọc. Phản ứng được quan nghiệm này khoảng 70% nhưng độ chuyên sát sau 5 phút, xuất hiện những cột khí và đo biệt thì rất cao từ 98 - 99%. Những kỹ thuật dò kích thước các cột khí này. Kết quả: nếu < 50mm tìm phóng đại trực tiếp chuỗi ADN giúp xác là M. Tuberculosis; nếu 50mm là M. Fortuitum. định sự hiện diện của M.tuberculosis trong vài (2) Tính ổn định: M. tuberculosis tiết ra men giờ. Hai xét nghiệm được sử dụng rộng rãi, đó catalase không ổn định với nhiệt. Ở nhiệt độ là xét nghiệm Gen-Probe MTD (Gen-Probe, 680C trong 20 phút thì men catalase bất hoạt. Còn Incorporated; San Diego) và xét nghiệm M. Fortuitum tiết ra men catalase ổn định với Amplicor M.tuberculosis (Roche Diagnosis nhiệt. Do đó, khi lấy một mẫu thử đun nóng ở Systems, Branchburg, NJ), có độ nhạy và độ 680C trong 20 phút và cho dd Tween 80-peroxide chuyên biệt rất cao đối với mẫu AFB (+) vào. Nếu không tạo thành bọt khí thì đó là mẫu nhưng giá trị tiên đoán dương tính thấp mẫu thử có chứa M. tuberculosis. soi AFB (-). Những xét nghiệm này chỉ có giá trị đối với mẫu đàm, dịch mà không có giá trị Xác định bằng PP sắc ký phát hiện các tổn thương lao ngoài phổi. Lipids thành tế bào Mycobacteria được chiết PP phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên xuất bằng một kỹ thuật chiết xuất ether-hexane của VK lao trong máu đòi hỏi chỉ một looful VK (0,001ml). Chất chiết xuất được ly giải bởi một sắc ký khí được trang Khi bị nhiễm lao, cơ thể sẽ tạo ra đáp ứng bị với một cột thủy tinh và một máy dò ion hóa kháng thể và đáp ứng trung gian tế bào. Để phát bằng ngọn lửa. PP đơn giản và có kết quả sau 2 hiện các kháng nguyên VK lao hoặc kháng thể giờ. Một tiêu chuẩn tham khảo được kiểm tra tương ứng trong máu, người ta đã dùng kỹ thuật hàng ngày để cung cấp cho người làm sắc ký miễn dịch hiện đại như miễn dịch huỳnh quang, một kết quả chính xác nhất. Ion được chọn lọc miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men (ELISA), Chuyên Đề Nội Khoa I 31 Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 ngưng tụ hồng cầu thụ động, ngưng kết tế bào ở những vùng có tần suất lao kháng thuốc cao. toàn bộ, điều chế kháng thể đơn dòng. Hiện nay, BN hiện là phạm nhân đang bị ở tù. những PP này không thực hiện trong các phòng Bị nhiễm từ BN lao đa kháng thuốc. thí nghiệm để chẩn đoán lao. Các phương pháp thực hiện KS đồ kháng KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO thuốc lao Định nghĩa PP dựa vào kiểu hình qui ước Kháng sinh đồ là PP đánh giá khả năng nhạy Các PP xác định VK lao kháng thuốc dựa vào cảm đối với từng loại thuốc kháng sinh (KS) của kiểu hình qui ước: PP tỉ lệ, PP tỉ số đề kháng, PP VK đã được xác định qua môi trường cấy. Về nồng độ tuyệt đối. phương diện sinh học, một dòng VK lao gọi là PP tỉ lệ kháng thuốc lao khi số lượng VK kháng thuốc lao đạt tỉ lệ 1%(1,4,9,11,13,15,22,25,34). Cho phép xác định chính xác tỉ lệ đột biến kháng thuốc của VK đối với từng loại thuốc KS. Chỉ định Nồng độ thuốc KS sử dụng trong PP tỉ lệ (µg/ml) Những BN thất bại hoặc tái điều trị với được trình bày ở bảng 5. Mẫu thử chứa VK phân AFB(+). lập pha loãng 100 lần để dễ dàng đếm số lượng Những BN đang điều trị mà AFB chuyển khúm VK mọc được cho vào môi trường có dương. thuốc KS và cả ống chứng (không có thuốc KS). Những BN mà AFB không chuyển sang Nuôi cấy trên môi trường Lowenstein-Jensen, ủ âm tính sau 2-3 tháng điều trị. ở nhiệt độ 370C và đọc kết quả sau 28 và 42 ngày. Những BN sau 4-6 tháng điều trị mà kết Nuôi cấy trên môi trường Middlebrook 7H10/11 quả cấy vẫn (+). cho kết quả sau 21 ngày hoặc thậm chí sớm hơn. Số lượng VK lao tăng qua nhuộm soi acid Kết quả dựa vào tỉ lệ phần trăm khúm VK mọc nhanh trực tiếp sau khi bệnh khởi phát. trên môi trường có KS (R) so với môi trường Những BN nghi ngờ mắc lao kháng thuốc không chứa KS. PP này được thiết lập để phát mới. hiện sự kháng thuốc ở mức 1% trở lên. Những BN nhiễm HIV và hoặc đang sống Số khuẩn lạc mọc ở ống có KS R = 100% x Trung bình cộng số khuẩn lạc mọc ở ống chứng Xác định kháng thuốc khi tỉ lệ VK lao kháng Kanamycin 20,0 5,0 6,0 thuốc có R > 1% đối với INH, RIF, PAS hoặc 10% Ethionamide 20,0 5,0 10,0 Ofloxacin 2,0 2,0 2,0 đối với các thuốc khác. Capreomycin 20,0 10,0 10,0 Bảng 5: Nồng độ thuốc KS sử dụng trong PP tỉ lệ Cycloserine 40,0 - - (µg/ml) PP tỉ số đề kháng Thuốc kháng lao Lowenstein- 7H10 7H11 agar Jensen agar Là tỉ số giữa MIC của chủng VK phân lập INH 0,2 0,2 – 1,0 0,2 – 1,0 (mẫu thử) và chủng tham khảo nhạy cảm H37Rv RIF 40,0 1,0 1,0 (dòng chuẩn của phòng xét nghiệm) tại cùng EMB 2,0 5,0 7,5 một thời điểm. Sử dụng bộ ống tương đương có SM 4,0 2,0 2,0 – 10,0 chứa thuốc KS pha loãng gấp 2 lần ủ với chủng PZA 100 - - VK phân lập và chủng tham khảo của phòng xét PAS 0,5 2,0 8,0 32 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan nghiệm H37Rv ở 370C. Đọc kết quả sau 4 tuần. kiểm soát bởi thiết bị MIGT 960. Đọc kết quả sẽ Ống có 20 khúm VK được coi là dương tính và được thực hiện bởi máy với một chương trình đã MIC được định nghĩa là nồng độ thuốc tối thiểu được cài đặt để giải thích sự nhạy cảm hay có < 20 khúm VK mọc. Mẫu thử có tỉ số đề kháng kháng thuốc của VK lao. Thuận lợi lớn nhất của 2 được coi là nhạy cảm, và kháng thuốc khi tỉ kỹ thuật này là cho kết quả sớm trong vòng 4-6 số đề kháng 8. ngày so với 21 ngày của PP qui ước. Ngoài ra, hệ PP nồng độ tuyệt đối thống BACTEC cũng có thể được sử dụng cho việc làm KS đồ. Nên tiến hành làm KS đồ sau khi Tính đề kháng của một chủng VK được biểu phân lập được M.tuberculosis. Cấy MGIT có thể hiện dựa vào MIC toàn bộ hoặc gần như toàn bộ trả lời KS đồ trong vòng 2 – 4 tuần kể từ lúc tiếp của thuốc đối với sự phát triển của VK. Nồng độ nhận mẫu thử so với 6 – 8 tuần nếu dùng môi thuốc KS tương tự như trong PP tỉ lệ nhưng trường Lowenstein-Jensen cổ điển. nồng độ thuốc KS cần thiết sẽ được xác định tùy theo phòng xét nghiệm. Đọc kết quả sau 4 tuần PP dựa vào kiểu gen và sau 5 - 6 tuần. Xác định kết quả dựa vào sự Các PP dựa vào kiểu gen để phát hiện VK phát triển của VK trên môi trường có thuốc KS lao kháng thuốc hay nhạy cảm là do dựa trên được pha loãng hai lần và môi trường không có sự khuếch đại gen của vùng chốt những gen thuốc KS (nhóm chứng). Chủng VK được coi là phối hợp với hiện tượng kháng thuốc đã biết nhạy cảm khi số khúm trên môi trường có thuốc (PCR). Sau đó, tiến hành đánh giá những sản KS < 20 và môi trường không có thuốc KS là phẩm khuếch đại để xác định tính kháng (+++) hoặc (++++). Kết quả của PP nồng độ tuyệt thuốc của VK lao. đối được xác định như sau: Giải mã trình tự gen Bảng 6: Kết quả của PP nồng độ tuyệt đối Giải mã trình tự gen của sản phẩm khuếch Môi trường nuôi cấy Kết quả đại PCR là PP chính xác và đáng tin cậy, được sử Mọc 20 - 50 khuẩn lạc (+) dụng rộng rãi nhất trong các PP dựa vào kiểu Mọc > 50 khuẩn lạc (++) gen, để xác định tính kháng thuốc của VK lao. Khuẩn lạc nhiều nhưng không mọc thành đám (+++) Mọc thành đám (++++) Đây là chuẩn tham khảo phát hiện đột biến gen. Ngày nay, PP này được thực hiện bằng hệ thống PP đo bức xạ kế BACTEC tự động và thường được dùng mô tả đột biến Hệ thống BACTEC TB-460 dùng môi trường gen rpoB trong đề kháng RIF và những đột biến 14 lỏng Middlebrook 7H9 có chứa axít palmatic C gen kháng thuốc của các thuốc lao khác. Xác là nguồn carbon duy nhất. Khi VK lao phát triển định tính kháng thuốc của VK lao cũng được mô 14 14 sẽ sử dụng axít béo đánh dấu C để tạo ra CO2 tả bằng kỹ thuật giải mã đoạn gen ngắn để tìm và được phát hiện bằng hệ thống BACTEC biểu những điểm đột biến và những điểm đa hình. hiện như là chỉ số mọc. Tính nhạy cảm của VK Kỹ thuật này dựa trên việc định lượng với thuốc KS có thể được đánh giá qua sự hạn pyrophosphate được phóng thích theo sau sự chế gia tăng chỉ số mọc hàng ngày. Mẫu thử gắn kết nucleotid vào chuỗi ADN. chứa VK phân lập được pha loãng 100 lần, ủ ở Kỹ thuật lai phân tử phase đặc (Solid-phase 370C trong ống có chứa KS và ống chứng. Kết hybridization technique) quả được giải thích tương tự như trong PP tỉ lệ với tỉ lệ mọc là 1%. Thuận lợi lớn nhất của kỹ Phát hiện nhanh sự kháng thuốc của VK lao, thuật này là cho kết quả sớm hơn PP qui ước gồm 2 kỹ thuật: (1) Line Probe Assay để phát trong môi trường thạch. BACTEC MGIT 960 dựa hiện kháng RIF (INNO-LiPA Rif TB Assay); (2) trên nguyên tắc của sự tiêu thụ oxy và dấu hiệu GenoType MTBDR Assay phát hiện đồng thời phát huỳnh quang. Mẫu thử và chứng được ủ và kháng INH và RIF. Chuyên Đề Nội Khoa I 33 Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Kỹ thuật PCR thời gian thực (Real-time PCR) VK lao kháng RIF. Chất Resazurin là thành phần Sản phẩm PCR được theo dõi ngay sau mỗi chính của alamar blue cũng được sử dụng để chu kỳ khuếch đại bằng cách gắn sản phẩm phát hiện sự đề kháng thuốc lao. Kỹ thuật khuếch đại với chất phát huỳnh quang: gồm (1) REMA (Resazurin Microtiter Assay) cho phép Chất màu gắn không đặc hiệu vào chuỗi đôi phát hiện nhanh VK lao đa kháng thuốc với độ ADN; (2) Đầu dò đặc hiệu phát huỳnh quang. chính xác là 97% so với PP tỉ lệ trong môi trường Ưu điểm: cho kết quả nhanh khoảng 1,5 - 2 giờ đặc. REMA cũng giúp phát hiện sự đề kháng sau khi ly trích đoạn ADN từ mẫu thử và giúp thuốc của các thuốc kháng lao khác như: các xác định nhanh sự đề kháng thuốc của VK lao. thuốc kháng lao hàng thứ hai, Fluoroquinolones Đồng thời, kỹ thuật này có nguy cơ ngoại nhiễm và PZA. thấp. Hạn chế: trang thiết bị, thuốc thử đắt tiền, PP khử Nitrate (Nitrate Reductase Assay-NRA) và đòi hỏi kỹ thuật viên phải có chuyên môn. Là kỹ thuật khá đơn giản dựa vào khả năng PP dựa vào kiểu hình mới khử Nitrate thành Nitrite của VK lao và được PP dựa vào giai đoạn (Phage-based) xác định bằng cách cho thêm chất phản ứng hóa học vào môi trường cấy. VK lao được cấy trong Gen luciferase của đom đóm được đưa vào môi trường Lowenstein-Jensen có KS và phản VK lao qua thể thực khuẩn. Khi VK lao phát ứng khử Nitrate được xác định sau 10 ngày ủ. triển trong môi trường nuôi cấy, lượng luciferase Đối với chủng VK lao kháng thuốc, VK lao sẽ cũng nhân lên tương ứng. Luciferase trong môi phát triển và phản ứng khử Nitrate xảy ra làm trường có ATP, Mg++ và oxy sẽ hoạt hóa cho ống môi trường có màu đỏ hồng, trong khi luciferine thành lucifenyl-adenosine đối với chủng VK lao còn nhạy cảm thì không có monophosphate, cuối cùng thành oxyluciferine. vì VK lao bị ức chế bởi KS. Đồng thời, ánh sáng sẽ phát ra và được phát hiện bằng hệ thống phát hiện ánh sáng cảm ứng. PP MODS Qua đó, có thể phát hiện sự có mặt của VK lao Là kỹ thuật phát hiện sớm sự phát triển và trong môi trường cấy, sự phát triển của VK lao nhanh KSĐ của VK lao dựa vào việc quan sát sự cũng như đánh giá hiệu quả của thuốc kháng hình thành yếu tố thừng đặc trưng của VK lao lao. Sự phát sáng sẽ bị ức chế nếu chủng VK còn trong môi trường lỏng với KHV đảo ngược. nhạy cảm với KS. Trong khi ở chủng VK lao PP cấy trong môi trường thạch 7H11 lớp mỏng (Thin kháng thuốc, sự phát sáng vẫn tiếp tục. Layer 7H11 agar method, TL7H11) PP đo chất chỉ thị màu Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường Được sử dụng để phát hiện nhanh sự kháng thạch Middlebrook 7H11 lớp mỏng và xác định thuốc của VK lao. PP này dựa vào sự thay đổi khuẩn lạc mọc bằng KHV. PP TL7H11 cũng xác của chất chỉ thị màu như alamar blue (là chất định nhanh VK lao đa kháng thuốc trực tiếp từ đầu tiên được sử dụng) hoặc muối tetrazolium các mẫu đàm với thời gian nhận biết trong được cho thêm vào trong môi trường cấy để khoảng một tuần. phát hiện VK lao mọc. Khi VK lao phát triển, QUI TRÌNH CẤY ĐÀM VÀ LÀM KS ĐỒ phản ứng oxy hóa khử xảy ra, chất alamar blue TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH(24) từ màu xanh chuyển sang màu hồng hoặc muối tetrazolium từ màu vàng thành tinh thể màu tía Mẫu đàm được khử tạp khuẩn bằng dd N- không hòa tan. Chất alamar blue được sử dụng Acetyl-L-Cystein (NALC) - NaOH để đánh giá hoạt tính của INH, RIF, EMB, SM, Dd được dùng khử tạp khuẩn đặc biệt là dùng để phát hiện VK lao kháng INH Gồm dd 1 là dd NaOH 4% (chứa 20 gr và RIF. Muối tetrazolium giúp phát hiện nhanh 34 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan NaOH và 500 ml nước cất. Dd 2 là dd Sodium Nhuộm soi AFB trong đàm bằng kỹ thuật citrat dihydrate 2,9% (chứa 14,5 gr Sodium citrat Ziehl Neelsen dihydrate và 500 ml nước cất). Dd 3 là dd Đánh giá kết quả theo hướng dẫn của NaOH-Nacitrat (chứa 500 ml dd 1 và 500 ml dd chương trình chống lao quốc gia. 2). Dd khử tạp khuẩn gồm dd 3 và NALC (pha dùng trong ngày). Mỗi mẫu đàm cần 5ml dd khử Nuôi cấy trên môi trường MGIT và theo dõi tạp khuẩn. tự động sự phát triển của VK lao trong môi trường bằng hệ thống BACTEC MGIT 960 Cách tính lượng NALC cần dùng Lượng NALC (mg) = số ml NaOH-Nacitrat Nguyên tắc x 5. Chẳng hạn, trong 10 ml NaOH-Nacitrat, Khi có VK lao mọc, sử dụng oxy, làm oxy lượng NALC cần dùng là 50 mg; tương tự, trong trong ống nghiệm giảm và sẽ phát huỳnh quang 20 ml NaOH-Nacitrat, lượng NALC cần dùng là thông báo kết quả dương tính. Ngưỡng để máy 100 mg; trong 30 ml NaOH-Nacitrat, lượng thông báo kết quả dương tính là 104 – 107. NALC cần dùng là 150 mg;... Thời gian đọc kết quả Cách tiến hành khử tạp khuẩn Từ 7 – 42 ngày (nếu có kết quả dưới 1 tuần Cho 3 – 5 ml đàm vào ống ly tâm nhựa 50 ml thường là do ngoại nhiễm hoặc do nhiễm nắp xoáy. Thêm dd khử tạp tương đương với thể Mycobacterium khác M. tuberculosis (MOTT). tích đàm, đóng chặt nắp ống ly tâm. Lắc trên Ngoại nhiễm máy Votex cho đến khi đàm nhuyễn hóa hoàn Nhiễm VK toàn (5 – 20 giây), lộn ngược các ống để toàn bộ Thường xảy ra trong 24 - 48 giờ trên cả hai bề mặt trong ống được tiếp xúc với dd khử tạp ống nuôi cấy do khử tạp khuẩn chưa đạt. Khi khuẩn. Để đứng các ống trong 15 phút ở nhiệt nhiễm trùng rầm rộ, bề mặt môi trường nhày, độ phòng thí nghiệm (thỉnh thoảng lắc nhẹ). Bổ ướt, thậm chí vữa toàn bộ môi trường. Khi sung dd đệm vô trùng tới vạch 30 – 40 ml. Đóng nhiễm VK, môi trường chuyển màu, sự chặt nắp ống ly tâm, lắc đều. Quay ly tâm 3.000 chuyển hóa của VK sinh ra acid làm pH môi vòng/15 phút (100 C nếu là máy ly tâm lạnh). Bỏ trường giảm, chất chỉ thị Malachite đổi màu hết phần nước nổi, giữ lại cặn. Thêm 0,5 – 1 ml xanh tối, đậm độ màu xanh phụ thuộc vào dd đệm vô trùng vào cặn, lắc đều, tạo thành lượng VK nhiễm trên môi trường cấy. Khi huyền dịch để nuôi cấy. nhiễm toàn bộ ống nuôi cấy, M.tuberculosis Các dung dich đệm không thể mọc trong điều kiện pH thấp, phải Có thể dùng 1 trong 2 dd sau: (1) Dd đệm hủy bỏ ống nuôi cấy. phosphate bufer 0,067M pH 6,8: gồm dd A: (2) Nhiễm nấm 9,47gr Na2HPO4 và 1.000 ml nước cất; dd B: Thường xảy ra muộn trong quá trình ủ ấm, 9,07gr K2HPO4 và 1.000 ml nước cất. Trộn dd A thường do từ ngoài vào. Nếu phát hiện sớm khi và B theo tỉ lệ 1:1 và chỉnh pH=5,6 bằng cách nấm mọc rải rác có thể phân lập được chủng VK thêm A nếu cần tăng pH và thêm B nếu cần lao mọc lẫn trên môi trường, phát hiện muộn giảm pH. Hấp ở 1210C /15 phút, bảo quản ở nhiệt thường mất chủng VK vì nấm mọc kín toàn bộ độ phòng thí nghiệm trong 1 tuần. (2) Dd đệm môi trường. Nhiễm nấm sớm thường do bệnh NaCl 0,85% gồm 8,5 g NaCl tinh thể và 1.000 ml phẩm bị nhiễm nấm hoặc do dụng cụ hay thao nước cất. Hòa tan, hấp ở 1210C/15 phút. Bảo tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến 1 quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 1 tuần. tuần, phải hủy ống nuôi cấy. Chuyên Đề Nội Khoa I 35 Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Kết quả dương tính khi có khuẩn lạc mọc Ethionamide: 40 µg/ml; Cycloserine: 30 µg/ml; kiểu thô ráp (Rough, R) Kanamycin: 20 µg/ml; PAS: 0,5 µg/ml; và PZA: Lúc đầu tròn nhẵn, sau đó, sần sùi như hoa 200 µg/ml (theo phương pháp Wayne). súp lơ, màu kem. Đọc kết quả cấy đàm tìm VK * Kết quả KSĐ lao: Nhạy cảm: khi có khuẩn lạc mọc ở ống Bảng 7: Đọc kết quả cấy đàm tìm VK lao chứng nhưng không có khuẩn lạc mọc ở các Cấy đàm Kết quả ống có KS. Không thấy khuẩn lạc (-) Kháng thuốc: có khuẩn lạc mọc ở cả ống 1 - 19 khuẩn lạc ghi số khuẩn lạc chứng và các ống có KS. Đồng thời, có chỉ số 20 - 100 khuẩn lạc (+) R >10% đối với PZA và > 1% đối với các 100 - 200 khuẩn lạc (++) thuốc còn lại. 200 - 500 khuẩn lạc (+++) > 500 khuẩn lạc (++++) KẾT LUẬN Định danh Mycobacterium sau nuôi cấy (cổ Nhuộm soi AFB trực tiếp, cấy tìm VK lao và thực hiện KS đồ kháng thuốc lao là những xét điển) nghiệm quan trọng trong chẩn đoán bệnh lao, Dựa vào xác định tốc độ mọc, nhiệt độ mọc, đặc biệt trong tình hình lao đa kháng thuốc ngày hình thái khuẩn lạc (nhìn bằng mắt thường và càng gia tăng. Ngày nay, với sự tiến bộ của lĩnh bằng KHV), sự sinh sắc tố, các tính chất sinh vật vực sinh học phân tử, đã giúp phát triển nhiều hóa học, các đặc điểm hóa sinh (các test sinh phương pháp, kỹ thuật giúp xác định VK lao gây hóa). Có thể nghĩ đến M. tuberculosis nếu VK bệnh trong các mẫu thử cũng như có được kết mọc chậm, không có sắc tố, không sinh sắc tố quả KS đồ nhanh, chính xác, dễ thực hiện trong ngoài ánh sáng, khuẩn lạc mọc xù xì, có khuynh một thời gian ngắn nhất. Đây cũng chính là yêu hướng tạo thừng, sản sinh ra niacin: test niacin cầu cấp thiết của chương trình chống lao trong (+), test khử nitrat dương tính, test NAP (P tầm soát, phát hiện, quản lý và kiểm soát tốt Nitro-alpha-acetylamino-beta) nhạy và test TCH bệnh lao trong cộng đồng. (Thiophene-2-carboxylic acid hydrazide) kháng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Thực hiện KS đồ kháng lao 1. Anandi M et al (2007), “Drug resistance and Drug resistance detection”, Textbook of Tuberculosis, pp. 635-660. Cấy bệnh phẩm vào ống môi trường 2. Bộ Y tế và Chương trình chống lao quốc gia (2001), Phát hiện (Lowenstein-Jensen) có chứa KS và ống chứng (2 và điều trị bệnh lao (sách dịch), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. ống) sau khi đã định danh là M. tuberculosis và ủ 221-235. 3. Bộ Y tế và Chương trình chống lao quốc gia (2009), Hướng dẫn ở nhiệt độ 35 – 370C. Thường xuyên theo dõi quản lý bệnh lao, Nhà xuất bản Y học, Hà nội. nhiệt độ ủ. Kiểm tra tình trạng nhiễm khuẩn sau 4. Butt T, Ahmad RN, Afzal RK, Mahmood A, Anwar M (2004), “Rapid detection of rifampicin susceptibility of Mycobacterium 24 – 48 giờ. Sau 72 giờ, kiểm tra bề mặt môi tuberculosis in sputum specimens by mycobacteriophage trường phải khô, xoáy nắp chặt vừa phải tránh assay”, J. Pak. Med. Asso. 2004, 54(7), pp. 379-382. bay hơi làm khô môi trường. Đọc kết quả hàng 5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I (2006), “Evaluation of the Genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin tuần. Theo dõi xét nghiệm trong vòng 7 ngày để and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates”, phát hiện MOTT và trả lời kết quả sau 8 tuần. J. Clin. Microbiol 2006, 44(7), pp. 2338-2342. Xét nghiệm KS đồ được tiến hành với các thuốc: 6. Cirillo DM, Piana F, Frisicale L, Quaranta M, Riccabone A, Penati V, Vaccarino P, Marchiaro G (2004), “Direct rapid INH, RIF, EMB, PZA, SM, Ofloxacin, PAS, TB1, diagnosis of rifampicin-resistant M. tuberculosis infection in Ethionamide, Cycloserine, Kanamycin theo clinical samples by line probe assay (INNO LiPA Rif-TB)”, New Microbiol, 27(3), pp. 221-227. phương pháp tỉ lệ với các nồng độ sau: SM: 4 7. Crofton J (1999), “Các xét nghiệm nhuộm soi AFB, cấy tìm vi µg/ml; INH: 0,2 µg/ml; RIF: 40 µg/ml; EMB: 2 khuẩn lao”, Bệnh lao lâm sàng, Viện lao và bệnh phổi Trung ương, tr.235-250. µg/ml; TB1: 10 µg/ml; Ofloxacin: 2 µg/ml; 8. Didi B, Andersen AB, et al (2006), “Rapid Genotypic Detection 36 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium 175-183. tuberculosis Directly in Clinical Specimens”, J. Clin. Microbiol, 22. Pai M, Kalantri S, Pascopella L, Riley LW, Reingold AL (2005), 44(7), pp. 2605-2608. “Bacteriophage-based assays for the rapid detection of 9. Espasa M, Gonzalez-Martin J, Alcaide F, et al (2005), “Direct rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a meta- detection in clinical samples of multiple gene mutations analysis”, J. Infect. 2005, 51(3), pp. 175-187. causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid 23. Philips JA, Rubin EJ (2008), “The microbiology, virulence, and and rifampicin using fluorogeneic probes”, J. Antimicrob. immunology of mycobacteria”, Fishman’s pulmonary diseases Chemother. (55), pp.860-5. and disorders, 4th ed., chapter 139, pp.2459-2465. 10. Fraser RS, Pare PD, Colman N, Muller NL (2005), 24. Quy trình cấy đàm và làm kháng sinh đồ tại Phòng xét “Mycobacteria”, Synopsis of diseases of the chest, 3rd ed., pp.249- nghiệm vi sinh học, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. Tài liệu lưu 267. hành nội bộ. 11. Hazbon MH (2004), “Recent advances in molecular methods 25. Riska E, Jacobs WR, Alland D (2000); “Molecular for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant determinants of drug resistance in tuberculosis”; Int J Tuberc tuberculosis”, Biomedica, 24, pp. 149-162. Lung Dis;42, pp: S4–S10. 12. Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann 26. Rusch-Gerdes S, Pfyffer GE, Casal M, Chadwick M, Siddiqi S. S (2005), “Use of the geneotype MTBDR assay for rapid (2006), “Multicenter laboratory validation of the BACTEC detection of rifampin and isoniazid resistance in MGIT 960 technique for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis complex isolates”, J. Clin. Microbiol., Mycobacterium tuberculosis to classical second-line drugs and (43), pp.3699-703. newer antimicrobials”, J. Clin. Microbiol., (44), pp.688-92. 13. Hoàng Thị Phượng, Trần Văn Sáng, Lê Thị Kim Hoa, Phạm 27. Sajduda A, Brzostek A., Poplawska M, et al. (2004), Thị Thái Hà (2009), “Nhận xét đặc điểm lâm sàng, cận lâm “Molecular characterization of rifampin- and isoniazid- sàng của lao phổi có vi khuẩn lao kháng đa thuốc”, Kỷ yếu Hội resistant M. tuberculosis strains isolated in Poland”, J. Clin. nghị khoa học bệnh phổi toàn quốc lần thứ III-11/2009, tp.HCM, tr. Microbiol., (42), pp.2425-31. 265-271. 28. Shah NS, Lan NT, Huyen MN, Laserson K., Iademarco M.F., 14. Hopewell PC et al (2010), “Tuberculosis”, Murray and Nadel’s Binkin N, Wells C, Varma JK (2009), “Validation of the line- Textbook of respiratory medicine, 5th ed, pp.755-792. probe assay for rapid detection of rifampicin-resistant 15. Kim SY, Park YJ, Song E, et al (2006), “Evaluation of the Mycobacterium tuberculosis in Vietnam”, Int. J. Tuberc. Lung. Dis. CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA 2009, 13(2), pp. 247-252. chip for identifying mutations associated with resistance to 29. Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F (2004), “Molecular genetic isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis”, Diagn. methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of Microbiol. Infect. Dis., (54), pp.203-10. mycobacteria from clinical specimens”, APMIS, (112), pp.728- 16. Mailaender C, Reiling N, Engelhardt H et al (2004), “The 52. MspA porin promotes growth and increases antibiotic 30. Sharma M, Sethi S, Mishra B, Sengupta C, Sharma SK (2003), susceptibility of both Mycobacterium bovis BCG and “Rapid detection of mutations in rpoB gene of rifampicin Mycobacterium tuberculosis”. Microbiology, 150, pp.853-64. resistant Mycobacterium tuberculosis strains by line probe 17. Martin A, Portaels F, Palomino JC (2007), “Colorimetric redox- assay”, Indian J. Med. Res. 2003, 117, pp. 76-80. indicator methods for the rapid detection of multidrug 31. Traore H, van Deun A, Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review (2006), “Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis-complex and meta-analysis”, J. Antimicrob. Chemother., (59), pp.175-83. DNA and Rifampin Resistance in Clinical Specimens from 18. Martin A, Portaels F (2007), “Drug Resistance and Drug Tuberculosis Patients by the Line Probe Assay; a Large Scale Resistance Detection”, Textbook of Tuberculosis, pp. 635-655. Study”, J. Clin. Microbiol., (44), pp.4384-8. 19. Martin A, Takiff H, Vandamme P, Swings J, Palomino JC, 32. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc, Nhà xuất bản y Portaels F (2006), “A new rapid and simple colorimetric học, Hà Nội, tr. 5-35. method to detect pyrazinamide risistance in Mycobacterium 33. Watterson SA, Wilson SM, Yates MD, Drobniewski F.A. tuberculosis using nicotinamide”, J. Antimicrob Chemother 2006, (1998), “Comparison of three molecular assays for rapid 58(2), pp. 327-331. detection of rifampincin resistance in Mycobacterium 20. Martin A, Panaiotov S, Portaels F, Hoffner S, Palomino JC, tuberculosis”, J. Clin. Microbiol 1998, 36(7), pp. 1969-1673. Angeby K (2008), “The nitrate reductase assay for the rapid 34. Whitelaw AC, turm WA (2009), “Microbiological testing for detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis”. In: Schaaf H.S. and Zumla A., Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta- Tuberculosis: a comprehensive reference, 1st ed., pp.169-178. analysis”, J. Antimicrob Chemother 2008, 62(1), pp. 56-64. 21. Martin A, Portaels F, Palomino JC (2007), “Colorimetric redox- indicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis”, J. Antimicrob Chemother 2007, 59(2), pp. Chuyên Đề Nội Khoa I 37