Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng acetylcholinesterase của một số dẫn chất benzohydrazid

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 360 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT BENZOHYDRAZID Lê Tuấn*, Lê Thị Hoài Thảo*, Trần Kiên*, Huỳnh Ngọc Trinh*, Huỳnh Thị Ngọc Phương* TÓM TẮT Mở đầu: Các dẫn chất benzohydrazid với khung cấu trúc có thể nằm gọn trong vùng xúc tác của acetylcholinesterase (AChE),có tiềm năng tạo những chất mới ức chế enzym này. Mục tiêu: Tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính kháng AChE in vitro của một số dẫn chất benzohydrazid. Khảo sát khả năng gắn kết ở mức độ phân tử của chất có tác dụng tốt trong thử nghiệm in vitro. Phương pháp: Các dẫn chất benzohydrazid được tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa benzoylhydrazid và các aldehyd thơm và dị vòng thơm. Hoạt tính kháng AChE được xác định bằng phương pháp Ellman. Docking được thực hiện bằng phần mềm Autodock Vina 1.1.2 trên 1DX6. Kết quả: Trong 15 dẫn chất benzohydrazid được tổng hợp và xác định cấu trúc, có 2 chất (HDP 3C và HDP 3F ) có tác dụng kháng AChE in vitro mạnh hơn chất đối chứng galanthamin. Kết luận: Sự thêm vào nhóm ammonium bậc 4 thông qua quá trình benzyl hóa các N của pyridinohydrazon giúp làm tăng hoạt tính kháng acetylcholinesterase, đặc biệt tác dụng mạnh đáng kể ở nhóm dẫn chất 4-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-benzyl-pyridium. Từ khóa: Aceylcholinesterase, benzophydrazid, kháng acetylcholinesterase, 1DX6. ABSTRACT SYNTHESIS AND EVALUATION ANTI-ACETYLCHOLINESTERASE ACTIVITY OF SOME BENZOHYDRAZID DERIVATIVES Le Tuan, Le Thi Hoai Thao, Tran Kien, Huynh Ngoc Trinh, Huynh Thi Ngoc Phuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 360 – 366 Background: Benzohydrazide derivatives, whose structures can fix neatly in the catalytic region of acetylcholinesterase (AChE), may be potential inhibitors of the enzyme. Objectives: Synthesis and evaluation anti-acetylcholinesterase activity of some benzohydrazid derivatives. Structure-activity relationship was also determined. Methods: Benzohydrazide derivatives were synthesized from the condensation reaction between benzoylhydrazide and aromatic aldehydes. Anti-acetylcholinesterase activity was examined by Ellman method. Docking was done by software Autodock Vina 1.1.2 on 1DX6. Results: Among synthesized benzohydrazide derivatives, two compounds (HDP 3C and HDP 3F) exhibited anti-acetylcholinesterase activity more potent than that of the reference of galanthamine Conclusion: Addition of the quaternary ammonium group via the N-benzylation of pyridinohydrazone enhances significantly the anti-acetylcholinesterase activity, particularly in the compounds of 4-methyl- (2- benzoylhydrazono) methyl) -1-benzyl -pyridium. Key words: Aceylcholinesterase, benzophydrazid, kháng acetylcholinesterase, 1DX *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Huỳnh Thị Ngọc Phương ĐT: 0908772118 Email: ngocphuonghuynhthi@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 361 ĐẶT VẤN ĐỀ Các chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) được xem là một trong những nhóm thuốc chính nhằm làm chậm tiến trình bệnh Alzheimer(1,2). Tuy nhiên cho đến hiện nay chỉ có 3 thuốc trong nhóm này được sử dụng trong lâm sàng là donepezil, galantamin, rivastigmin, và cũng chỉ hiệu quả cho việc giảm triệu chứng của bệnh Alzheimer ở giai đoạn nhẹ tới trung bình(4). Trong đề tài này, một số dẫn chất benzohydrazid với khung cấu trúc có thể nằm gọn trong vùng xúc tác của acetylcholinesterase (AChE) được tổng hợp và thử hoạt tính kháng AChE in vitro, góp phần tìmthêm chất mới có tiềm năng sử dụng hiệu quả hơn trong điều trị Alzheimer. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và trang thiết bị - Nguyên liệu tổng hợp được mua từ công ty Acros organics, sử dụng trực tiếp không tinh chế lại. Xác định nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuart SMP10 với nhiệt kế không hiệu chỉnh. - Phổ IR được đo trên máy FTIR 8101 (SHIMADZU). Phổ 1H-NMR ghi bằng máy Bruker (500 MHz) ở 25 oC với chuẩn nội là TMS (tetra methyl silan). Phổ MS được đo trên máy Shimadzu LCMS. Phương pháp tổng hợp Các dẫn chất benzohydrazid HDZ 01- 08 được tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa benzoylhydrazid và các dẫn chất aldehyd thơm và dị vòng thơm, bằng cách đun hồi lưu 60-65 oC trong CH3COOH/CH3OH, với hiệu suất từ 80 % đến 92 % (Hình 1). Các dẫn chất ((2-benzoylhydrazono) methyl) pyridinium (HDP) được tổng hợp lần lượt từ hydrazon HDZ 01-03 với dẫn chất benzyl clorid bằng cách đun hồi lưu trong acetonitril khan ở 80-90oC (Hình 2). Cấu trúc và độ tinh khiết của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM), điểm chảy và các kỹ thuật phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS). - Dẫn chất benzohydrazid Hình 1: Sơ đồ tổng hợp HDZ 01-08 R R HDZ 01 HDZ 05 HDZ 02 HDZ 06 HDZ 03 HDZ 07 HDZ 04 HDZ 08 - Dẫn chất pyridinium benzohydrazid (HDP) Hình 2: Sơ đồ tổng hợp các HDP Phương pháp thử hoạt tính kháng acetylcholinesterase Sử dụng phương pháp đo quang Ellman trên đĩa 96 giếng để xác định hoạt tính kháng acetylcholinesterase (AChE)(3) - Nguyên tắc: AChE thủy phân acetylthiocholin iodid (ATCI) tạo ra Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 362 thiocholin, tác dụng với acid 5,5’-dithiobis-(2- nitrobenzoic) (DTNB) tạo ra hợp chất màu vàng 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Độ hấp thụ của TNB được đo ở 415 nm và tỉ lệ với hoạt tính của enzym. Độ hấp thu càng thấp chứng tỏ hợp chất TNB tạo ra càng ít, tức thiocholin tạo ra càng ít. Điều này có nghĩa là AChE bị ức chế càng mạnh. - Cách tiến hành Các dẫn chất HDZ và HDP được hòa tan trong dung môi methanol 10 % đến nồng độ 200 µM (riêng với hợp chất HDZ 06 và HDZ 07 thử nghiệm ở 50 µM - nồng độ hòa tan tối đa dưới sự hỗ trợ của methanol 10%). - Tính toán kết quả Phần trăm ức chế AChE được tính toán dựa vào công thức Trong đó ABE: Độ hấp thu của giếng chứa mẫu trắng có enzym AB: Độ hấp thu của giếng chứa mẫu trắng không có enzym ACE: Độ hấp thu của giếng chứa hợp chất có enzym AC: Độ hấp thu của giếng chứa hợp chất không có enzym Kết quả % ức chế AChE được trình bày dưới dạng (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) của 3 lần thử nghiệm. - Xác định IC50 của hợp chất có tiềm năng Kết quả sàng lọc tác động kháng AChE cho phép chọn ra những chất có tiềm năng để xác định IC50 (nồng độ chất khảo sát gây ức chế 50% hoạt tính của enzym AChE). Mỗi chất được pha loãng thành các dãy nồng độ và sử dụng phương pháp đo quang để xác định % ức chế AChE ở nồng độ tương ứng. Sau đó, phương trình hồi qui tuyến tính được thiết lập để mô tả sự liên quan giữa lgC với phần trăm ức chế AChE (% ức chế = a×lgC + b). Giá trị IC50 được nội suy bằng công thức dưới đây: Phương pháp docking Docking được thực hiện bằng phần mềm Autodock Vina 1.1.2 (The Scripps Research Institute, USA) trên mô hình đồng kết tinh giữa galanthamin và enzym acetylcholinesterase loài cá đuối điện Tetronarce californica (PDB ID : 1DX6).. Kết quả docking được phân tích bằng Autodock Tool 1.5.6 và Chimera 1.6.2 (UCSF, USA)(5,6) KẾT QUẢ Kết quả tổng hợp Dẫn chất benzohydrazid HDZ 01 (E)-N’-(pyridin-2-ylmethylen)benzohydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25. Hiệu suất: 70%, tinh thể dạng kim, màu vàng. Điểm chảy: 60 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300. IR (υ cm-1 ): 3459,11 (N-H amid); 3063,94 – 3021,52 (C-H thơm); 1660,04 (C =O amid); 1562,77 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,05 (s, 1H); 8,63 (d, J = 4 Hz, 1H); 8,49 (s, 1H, CH=N); 8,00 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,94 – 7,88 (m, 3H); 7,63 (t, J = 7 Hz, 1H); 7,56 (t, J = 7,25 Hz, 2H); 7,44 - 7,41 (m, 1H). LC-MS: m/z 248 [M+Na]+ ; 224 [M-H]- . HDZ 02 (E)-N’-((pyridin-3-yl)methylen)benzo hydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25. Hiệu suất: 88%, tinh thể dạng kim, màu vàng. Điểm chảy: 158 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 299. IR (υ cm-1 ): 3468,59 (N-H amid); 3225,25 – 3055,60 (C-H thơm); 1657,64 (C=O amid); 1572,00 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,00 (s, 1H); 8,87 (s, 1H); 8,62 (d, J = 3,5 Hz, 1H); 8,52 (s, 1H, CH=N); 8,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,93 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,62 (t, J = 7 Hz, 1H); 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,51 (dd, J = 5 Hz, 1H). LC-MS: m/z 248 [M+Na]+; 224 [M-H]-. HDZ 03 (E)-N’-((pyridin-4-yl) methylen) benzohydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25. Hiệu suất: 80%, bột màu trắng. Điểm chảy: 177 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 297. IR (υ cm- 1 ): 3260,28 (N-H amid); 3051,46 (C-H thơm); 1650,27 (C=O amide); 1552,21 (C=N). . 1H- NMR (500 MHz, DMSO): 12,11 (s, 1H); 8,66 (d, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 363 J = 4,5 Hz, 2H); 8,46 (s, 1H, CH=N); 7,94 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,67 (s, 2H); 7,63 (t, J = 7,25 Hz, 1H); 7,56 (t, J = 7,5 Hz, 2H). LC-MS: m/z 248 [M+Na]+; 224 [M-H]- HDZ 04 (E)-N’-(thiophen-2-ylmethylen)benzo hydrazid C12H10N2OS Ptl: 230,29. Hiệu suất: 85%, bột màu xanh. Điểm chảy: 139 ± 1 oC UV- Vis (λ max nm, MeOH): 318. IR (υ cm-1 ): 3252,30 (N-H amide); 3088,35 – 3070,40 (C-H thơm); 1642,48 (C=O amide); 1553,43 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 11,79 (s, 1H, NH); 8,67 (s, 1H, CH=N); 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,68 (d, J = 5 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 7 Hz, 1H); 7,54 (t, J = 7,25 Hz, 2H); 7,47 (d, J = 3 Hz, 1H); 7,16 (t, J = 4 Hz, 1H). LC-MS: m/z 253 [M+Na]+; 229 [M-H]-. HDZ 05 (E)-N’-(4-(dimethylamino)benzyliden) benzohydrazid C16H17N3O Ptl: 267,33. Hiệu suất: 90%, bột màu xanh. Điểm chảy: 158 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 357. IR (υ cm-1 ): 3243,75 (N-H amid); 3057,73 – 3030,02 (C-H thơm); 1649,93 (C=O amid); 1519,88 (C=N). 1H- NMR (500 MHz, DMSO): 11,52 (s, 1H); 8,32 (s, 1H, CH=N); 7,90 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,57 – 7,50 (m, 5H); 6,77 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 2,98 (s, 6H, 2CH3). LC-MS: m/z 290 [M+Na]+; 266 [M-H]-. HDZ 06 (E)-N’-(2-(trifluoromethyl) benzyliden) benzohydrazid C15H11F3N2O Ptl: 292,26. Hiệu suất: 80%, tinh thể hình kim, không màu. Điểm chảy: 128 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 297. IR (υ cm-1 ): 3190,60 (N-H amid); 3031,13 (C-H thơm); 1651,24 (C=O amid); 1555,17 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,16 (s, 1H); 8,86 (s, 1H, CH=N); 8,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,95 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 7,82 (m, 2H); 7,66 (m, 2H); 7,56 (t, J = 7,25 Hz, 2H). LC-MS: m/z 315 [M+Na]+; 291 [M-H]- HDZ 07 (E)-N’-(2-chloro-6-fluorobenzyliden) benzohydrazid C14H10ClFN2O Ptl: 276,70. Hiệu suất: 80%, bột trắng. Điểm chảy: 146 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 291. IR (υ cm-1 ): 3172,51 (N-H amide); 3049,35 – 3026,06 (C-H thơm); 1650,67 (C=O amide); 1555,06 (C=N); 691,90 (C-Cl). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,06 (s, 1H); 8,72 (s, 1H, CH=N); 7,94 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 7,61 (m, 5H); 7,36 (t, J = 9 Hz, 1H). LC-MS: m/z 299 [M+Na]+; 275 [M-H]- HDZ 08 (E)-N’-(2-hydroxybenzyliden)benzo hydrazid C14H12N2O2 Ptl: 240,26. Hiệu suất: 90%, bột màu xanh. Điểm chảy: 137 ± 1 oC UV- Vis (λ max nm, MeOH): 285, 296, 327. IR (υ cm-1 ): 3268,94 (N-H amide); 3056,55 (C-H thơm); 1673,61 (C=O amide); 1538,04 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,10 (s, 1H) ; 11,30 (s, 1H) ; 8,65 (s, 1H, CH=N) ; 7,95 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,63 (t, J = 7,5; 7 Hz, 1H); 7,56 – 7,53 (m, 3H); 7,32 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 6,95 (m, 2H).. LC-MS: m/z 263 [M+Na]+; 239 [M-H]- Dẫn chất ((2-benzoylhydrazono) methyl) pyridinium HDP-1F: (E)-2-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (4-fluorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82. Hiệu suất: 70%, tinh thể dạng kim, màu vàng. Điểm chảy: 80 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 336. IR (υ cm-1 ): 3527,27 (N-H amid); 3030,77 -2981,87 (C-H thơm); 1679,20 (C=O amid); 1553,61 (C=N); 1142,79 (C-F). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,08 (d, J = 6 Hz, 1H); 8,95 (s, 1H, CH=N); 8,84 (s, 1H); 8,69 (t, J = 8Hz, 1H); 8,17 (m, 1H); 8,01 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,70 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,59 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,42 (d, J = 4,5 Hz, 2H); 7,25 – 7,21 (m, 2H); 6,11 (s, 2H, CH2). LC-MS: m/z 334 [M-Cl]+. HDP-2F: (E)-3-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (4-fluorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82. Hiệu suất: 65%, bột màu trắng. Điểm chảy: 205 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 301. IR (υ cm-1 ): 3459,34 (N-H amide); 3058,39 -3009,85 (C-H thơm); 1678,09 (C=O amid); 1509,26 (C=N); 1151,95 (C-F). 1H- NMR (500 MHz, MeOD): 9,70 (s, 1H); 9,05 (d, J = 6 Hz, 1H); 9,98 (d, J = 8 Hz, 1H); 8,56 (s, 1H, CH=N); 8,19 (t, J = 8; 6,5 Hz, 1H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,68 (m, 3H); 7,59 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,27 (t, J = 8,5 ; 9 Hz, 2H); 5,90 (s, 2H, CH2). LC- MS: m/z 334 [M-Cl]+. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 364 HDP-2M:(E)-3-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (2-methylbenzyl) pyridinium chlorid C21H20ClN3O, Ptl: 365,86. Hiệu suất: 65%, tinh thể dạng kim, màu trắng. Điểm chảy: 215 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300. IR (υ cm-1 ): 3418,59 (N-H amid); 3072,02 (C-H thơm); 1666,29 (C=O amide); 1557,39 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,57 (s, 1H); 9,02 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 8,87 (d, J = 6 Hz, 1H); 8,58 (s, 1H, CH=N); 8,19 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 8,01 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,68 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,59 (t, J = 8 ; 7,5 Hz, 2H); 7,45 (m, 1H); 7,39 (m, 3H); 5,98 (s, 2H, CH2); 2,40 (s, 3H, CH3). LC-MS: m/z 330 [M-Cl]+. HDP-2C: (E)-3-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (2-chlorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17Cl2N3O, Ptl: 386,28. Hiệu suất: 60%, bột màu xanh. Điểm chảy: 220 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300. IR (υ cm-1 ): 3349,35 (N-H amide); 3076,59 (C-H thơm); 1687,80 (C=O amid); 1563,08 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,63 (s, 1H); 9,03 (d, J = 8 Hz, 1H); 8,99 (d, J = 6 Hz, 1H); 8,60 (s, 1H, CH=N); 8,20 (dd, J = 6,5 Hz, 1H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,70 (m, 2H); 7,61 (m, 5H); 6,07 (s, 2H, CH2). LC-MS: m/z 350 [M-Cl]+. HDP-3F: (E)-4-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (4-fluorobenzyl)pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82. Hiệu suất: 75%, bột màu xanh. Điểm chảy: 207 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 334. IR (υ cm-1 ): 3446,35 (N-H amid); 3026,47 (C-H thơm); 1672,30 (C=O amide); 1556,54 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,05 (d, J = 7 Hz, 2H); 8,55 (s, 1H, CH=N); 8,49 (s, 2H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,70 (m, 1H); 7,63 (m, 4H); 7,27 (m, 2H); 5,83 (s, 2H, CH2). LC-MS: m/z 334 [M-Cl]+. HDP-3M: (E)-4-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (2-methylbenzyl)pyridinium chlorid C21H20ClN3O, Ptl: 365,86. Hiệu suất: 61%, bột màu trắng. Điểm chảy: 215 ± 1 oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 335. IR (υ cm-1 ): 3324,46 (N-H amid); 3043,57 (C-H thơm); 1688,90 (C=O amid); 1550,91 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 8,92 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 8,58(s, 1H, CH=N) ; 8,48 (s, 2H); 8,03 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,69 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,60 (t, J = 8; 7,5 Hz, 2H); 7,45 (m, 1H); 7,38 (m, 3H); 5,92 (s, 2H, CH2); 2,37 (s, 3H, CH3). LC-MS: m/z 330 [M-Cl]+. HDP-3C: (E)-4-((2-benzoylhydrazono) methyl)-1- (2-chlorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17Cl2N3O, Ptl: 386,28. Hiệu suất: 63%, bột màu xanh. Điểm chảy: 198 ± 1 oC. UV-Vis (λ max nm, MeOH): 335. IR (υ cm-1 ): 3340,53 (N-H amid); 3043,81 (C-H thơm); 1688,09 (C=O amid); 1551,11 (C=N). 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,01 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 8,58 (s, 1H, CH=N) ; 8,49 (s, 2H); 8,03 (d, J = 7 Hz, 2H); 7,68 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,61 – 7,52 (m, 5H); 5,99 (s, 2H, CH2). LC-MS: m/z 350 [M-Cl]+. Kết quả thử kháng acetylcholinestrerase - Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng AChE Phần trăm ức chế AChE của các dẫn chất HDP và HDZ ở nồng độ 200 µM hoặc nồng độ hòa tan tối đa dưới sự hỗ trợ của methanol 10% được trình bày ở bảng 3. Bảng 3: Phần trăm ức chế AChE của các dẫn chất HDZ và HDP Chất % ức chế Chất % ức chế HDP 1F 63,4 ± 2,5 % HDZ 01 6,9 ± 1,9 % HDP 2F 89,9 ± 0,8 % HDZ 02 15,6 ± 1,9 % HDP 2M 89,2 ± 1,0 % HDZ 03 16,7 ± 0,9 % HDP 2C 96,0 ± 0,8 % HDZ 04 7,8 ± 1,5 % HDP 3F 97,0 ± 2,9 % HDZ 05 13,7 ± 0,7 % HDP 3M 98,1 ± 3,1 % HDZ 06* 12,9 ± 1,8 % HDP 3C 101,7 ± 0,6 % HDZ 07* 7,2 ± 1,5 % HDZ 08 9,6 ± 1,8 % *Thử nghiệm ở 50 µM - nồng độ hòa tan tối đa dưới sự hỗ trợ của methanol 10%. Kết quả cho thấy tất cả các dẫn chất HDP đều có khả năng ức chế AChE cao, ở nồng độ 200 µM có phần trăm ức chế AChE lớn hơn 50%. Trong khi đó các dẫn chất HDZ đều có phần trăm ức chế AChE thấp hơn 50%, tối đa là 16,7%. - Xác định IC50 của các dẫn chất HDP Dãy nồng độ cùng phần trăm ức chế AChE tương ứng để xác định giá trị IC50 của các dẫn chất HDP và chất đối chiếu galantamin được trình bày ở bảng 4. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 365 Bảng 4: Xác định IC50 của dẫn chất HDP và galantamin Chất HDP 1F HDP 2F HDP 2M HDP 2C HDP 3F HDP 3M HDP 3C Galathamin IC50 (µM) 90,398 8,551 12,943 2,152 0,450 0,992 0,288 0,711 Trong 7 dẫn chất HDP, có 3 chất với IC50 nhỏ hơn 1 µM là HDP 3F, HDP 3M và HDP 3C. Trong đó có 2 chất với giá trị IC50 nhỏ hơn chất đối chiếu galatamin (IC50 = 0,711 µM), đó là HDP 3F (IC50 = 0,450 µM) và HDP 3C (IC50 = 0,288 µM). Như vậy, chất HDP 3C có hoạt tính kháng AChE cao nhất trong các dẫn chất HDP và khả năng ức chế AChE cao gấp 2,5 lần galantamin. Kết quả docking Qui trình docking thực hiện trên 3 chất HDP thể hiện khả năng ức chế AChE tốt nhất qua phương pháp đo quang Ellman trên giếng, đó là HDP 3F, HDP 3M, HDP 3C. HDP-3F Điểm số docking: 3C: -10,7; 3F: -10,6; 3M: -10,4 BÀN LUẬN Phản ứng tổng hợp Các benzohydrazid được tổng hợp khá dễ dàng với hiệu suất từ 80 đến 92 %. Ngoại lệ, việc tổng hợp HDZ 01 khó khăn hơn với thời gian phản ứng kéo dài khoảng 24 tiếng so với 30 phút đối với các hydrazon khác, điều này có thể là do vị trí của nguyên tử nitơ của nhân pyridin (meta- so với nhóm aldehyd). Một khoảng giá trị pH thích hợp là rất quan trọng trong quá trình tổng hợp các hydrazon, pH thích hợp nhất khoảng từ 4 đến 5. Đối với các dẫn chất ((2-benzoylhydrazono) methyl) pyridinium, việc tổng hợp các dẫn chất có nhân pyridin-2-yl rất khó khăn. Hiệu ứng không gian có thể là nguyên nhân do sự hiện diện của các nhóm thế cồng kềnh gần nguyên tử nitơ của nhân pyridin. Dung môi khan là cần thiết để thu được hiệu suất tổng hợp cao. Liên quan cấu trúc – hoạt tính Các dẫn chất benzoylhydrazon phải được pyridinium hóa mới có tác dụng ức chế acetylcholinesterase và đặc biệt tác dụng mạnh đáng kể ở dẫn chất 4-((2- benzoylhydrazono)methyl)-1-benzyl- pyridium (HDP 3C, 3M, 3F). Một nhóm thế halogen tại vị trí 2 của nhóm benzyl dường như cũng cần thiết để có hoạt tính ức chế AChE tốt (HDP 3C). Các nhận xét về mối quan hệ cấu trúc này cũng khá tương quan với kết quả docking. Theo đó, cả 3 chất HDP 3C, HDP Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 366 3M và HDP 3F nằm gọn trong túi xúc tác của AChE. Sự gắn kết của các chất khảo sát với AChE được thực hiện bằng tương tác của nhân thơm với các acid amin trong trung tâm xúc tác, như Trp84, Glu199, Phe330 ở vị trí anion thứ cấp đóng vai trò giúp định hướng cơ chất vào túi xúc tác. Phần lớn năng lượng ổn định cơ chất đến từ vùng này. Ngoài ra còn có Trp279 ở vùng ngoại biên với chức năng non-cholinergic mới được phát hiện gần đây (hình thành các mảng β-amyloid). Theo kết quả này, phần benzyl (nhân thơm C) của HDP 3C tương tác với Trp84, nhóm Clo cũng tương tác với Trp 84. Ngoài ra, vòng pyridin (nhân thơm B) thể hiện tương tác với Phe330 và một phần Tyr334, nhân thơm A tương tác chủ yếu với Trp279. Điểm số docking của HDP 3C thấp nhất là -10,7, đây cũng là chất có IC50 thấp nhất trong các chất thử nghiệm. Với HDP 3F và HDP 3M, vòng C cũng có tương tác giữa với Trp84, tuy nhiên, tương tác vòng B với Phe330 và vòng A với Trp279 đều kém hơn so với HDP 3C. KẾT LUẬN Sự thêm vào nhóm ammonium bậc 4 thông qua quá trình benzyl hóa các N của pyridinohydrazon giúp làm tăng hoạt tính kháng acetylcholinesterase, đặc biệt tác dụng mạnh đáng kể ở nhóm dẫn chất 4-((2- benzoylhydrazono)methyl)-1-benzyl- pyridium. Kết quả tìm trong database của reaxys ngày 6/6/2018, thì cả 2 chất HDP 3C và HDP 3F đều là chất mới chưa được công bố, hứa hẹn trở thành các chất AChEI có tiềm năng để phát triển thành thuốc mới. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Benzi G. et al. (1998), "Is there a rationale for the use of acetylcholinesterase inhibitors in the therapy of Alzheimer's disease?", European Journal of Pharmacology, 346(1), pp.1-13. 2. Bierer LM, et al. (1995), "Neurochemical correlates of dementia severity in Alzheimer's disease: relative importance of the cholinergic deficits", J Neurochem, 64(2), pp.749-760. 3. Ellman GL, et al. (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical Pharmacology, 7 (2), pp.88-95. 4. Fallarero A. et al. (2008), "Inhibition of acetylcholinesterase by coumarins: The case of coumarin 106", Pharmacological Research, 58(3–4), pp.215-221. 5. O’Boyle NM; Banck M; James CA; Morley C; Vandermeersch T; Hutchison GR Open Babel. (2011) An Open Chemical Toolbox. Journal of Cheminformatics, 3, pp.33. 6. Trott O, Olson AJ (2010) AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of Computational Chemistry (31) pp.455-461. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019