Tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1hpyrazol-1-yl]benzensulfonamid (tạp A của celecoxib)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 77 TỔNG HỢP 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1H- PYRAZOL-1-YL]BENZENSULFONAMID (TẠP A CỦA CELECOXIB) Nguyễn Minh Trí*, Lâm Nguyễn Đoan Trang**, Huỳnh Phương Nguyên**, Lê Thị Thu Cúc***, Trương Ngọc Tuyền** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tạp A của celecoxib là 1 trong 2 tạp chất chính (tạp A và B) của celecoxib được quy định trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ, đóng vai trò quan trọng trong công tác kiểm nghiệm thành phẩm thuốc celecoxib trên thị trường Việt Nam hiện nay. Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1- yl]benzensulfonamid (tạp A của celecoxib) và xác định độ tinh khiết tạp A. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của celecoxib được tổng hợp qua 4 giai đoạn đi từ các nguyên liệu đầu đơn giản. Tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại. Xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ như IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC. Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC. Kết quả: Tổng hợp được tạp A của celecoxib với hiệu suất tổng cộng 33,99% và độ tinh khiết đạt 99,15% đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu. Kết luận: Đã được tổng hợp thành công tạp A và xác định cấu trúc. Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn để thiết lập chất đối chiếu. Từ khóa: Tạp A celecoxib, tổng hợp, chất đối chiếu. ABSTRACT SYNTHESIS OF 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1H-PYRAZOLE- 1-YL]BENZENESULFONAMIDE (CELECOXIB RELATED COMPOUND A) Nguyen Minh Tri, Lam Nguyen Doan Trang, Huynh Phuong Nguyen, Le Thi Thu Cuc, Truong Ngoc Tuyen * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 77-82 Backgrounds: Celecoxib related compound A is one of the two major impurities (A and B) of celecoxib which is specified in the British Pharmacopoeia and the US Pharmacopoeia. Synthesis of celecoxib related compound A provides reference material for impurity testing of celecoxib in Vietnam. Objectives: Design the procedure for synthesis of 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H- pyrazole-1-yl]benzenesulfonamide (celecoxib related compound A) and determination of its impurity for reference material. Methods: Celecoxib related compound A was synthesized via 4 steps from simple starting material. Final product was purified by column chromatography and recrystallization. Confirmation its structure by using IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC and HSQC. Results: Overall yields of synthesis of celecoxib related compound A is 33.99% and the purity of the product was 99,15% by HPLC and met the requirements for reference material. *Công ty Dược phẩm Korean United Pharma **Khoa Dược, ĐH Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh. Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trương Ngọc Tuyền ĐT: 0903330604 Email: truongtuyen@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 78 Conclusions: Celecoxib related compound A were successfully synthesized with high purity (99.15%) and met requirement for establishment reference material. Key words: Celecoxib related compound A, synthesis, reference material. ĐẶT VẤN ĐỀ Tạp A của celecoxib là một trong 2 tạp chất chính (tạp A và B) được quy định trong Dược điển Anh(3) và Dược điển Mỹ(6), tạp này đóng vai trò quan trọng trong công tác phân tích tạp chất của thành phẩm thuốc celecoxib trên thị trường Việt Nam hiện nay. Theo Dược điển Anh, tạp A xuất hiện trong quá trình tổng hợp celecoxib là sản phẩm của 4-hydrazinobenzensulfonamid với 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan-1,3- dion, được xem là tạp chất chính với giới hạn cho phép trong nguyên liệu là không quá 0,4%. Bên cạnh đó, tạp A còn thuộc nhóm GHS06 có thể gây độc cho gan, thận khi hít hay nuốt phải. Do đó việc kiểm nghiệm tạp này trong nguyên liệu hay thành phẩm thuốc là hết sức cần thiết. Hiện nay để phục vụ cho kiểm nghiệm thuốc, các tạp chuẩn đều được nhập từ nước ngoài với giá cao. Do đó, nhóm nghiên cứu quyết định tiến hành việc tổng hợp tạp A của celecoxib từ nguyên liệu đơn giản ban đầu để phục vụ cho việc thiết lập chất đối chiếu nhằm giúp giảm giá thành sản phẩm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)- 1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid còn gọi là tạp A của celecoxib. Hóa chất Sulfanilamid, natri acetat, natri hydroxid, natri sulfit, acid hydrocloric, acid nitric, acid sulfuric, methanol, 1,4-dioxan, n-hexan, petroleum ether (Trung Quốc); ethanol, ethyl acetat (Việt Nam); acetonitril, methanol (HPLC grade); 3-methylacetophenon (Acros, Bỉ); anhydrid trifluoroacetic (Prolabo, Pháp). Thiết bị Máy khuấy từ gia nhiệt IKA, máy lọc áp suất giảm Velp, máy cô quay chân không Buchi, cân phân tích Sartorius, cân điện tử Chaus, máy đo điểm nóng chảy Sanyo- Gallenkamp, máy đo quang phổ hồng ngoại IRAFFINITY-1S Shimadzu, máy đo quang phổ MS Agilent LC-MS/MS; LC-MS Shimadzu, máy quang phổ NMR Bruker Avance III 500 MHz, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC- PDA Shimadzu Prominence. Phương pháp nghiên cứu Tạp A của celecoxib được tổng hợp qua 4 giai đoạn được mô tả trong sơ đồ 1. Sơ đồ 1: Quy trình tổng hợp tạp A của celecoxib Tạp A Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 79 Tổng hợp methyl trifluoroacetat (SP1) Cho thật chậm anhydrid trifluoroacetic (105 g; 0,5 mol) vào methanol (120 mL) trong bình cầu 500 mL ở 0 °C. Thêm 5 mL H2SO4 đậm đặc vào và đun hồi lưu 3 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được trung tính hóa với Na2CO3 hoặc NaOH 10%, sau đó chưng cất ở 41-45 °C. Sản phẩm chưng cất được làm khan với CaCl2 rồi với Na2SO4. Sản phẩm được bảo quản lạnh trong chai kín(1). Tổng hợp 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl) butan-1,3-dion (SP2) Hòa tan natri methylat (4,1 g; 75 mmol) bằng toluen (100 mL) trong bình cầu. Ổn định nhiệt độ phản ứng 20-25 oC, cho từ từ 3- methylacetophenon (6,7 g; 50 mmol) trong toluen vào bình cầu trong 30 phút. Tiếp tục khuấy hỗn hợp trong 30 phút. Dung dịch methyl trifluoroacetat (9,6 g; 75 mmol) trong toluen được cho từ từ vào hỗn hợp trên ở 20 – 25 oC trong 1 giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên 110 oC, khuấy trong 24 giờ. Hỗn hợp phản ứng được làm nguội ở 30 oC và cho vào cốc chứa dung dịch HCl, khuấy đều và để yên đến khi sản phẩm tách lớp. Chiết sản phẩm còn lại trong dung dịch nước bằng toluen. Rửa sản phẩm với nước cất, loại bỏ dung môi bằng cô quay(2). Tổng hợp 4-hydrazinobenzensulfonamid (SP3) Hòa tan sulfanilamid (12,9 g; 0,075 mol) trong một hỗn hợp đồng lượng gồm 21 mL HCl đậm đặc và 21 mL nước, làm lạnh nhanh đến 0 oC để thu được dạng muối hydroclorid ở dạng bột mịn. Muối diazoni được tạo ra bằng cách cho từ từ dung dịch chứa NaNO2 (5,2 g; 0,075 mol) trong 12 mL nước. Kiểm tra phản ứng bằng giấy tẩm KI - hồ tinh bột. Tiếp tục khuấy trong vài phút, sau đó cho vào dung dịch lạnh chứa Na2SO3 (19,66 g; 0,156 mol) và NaOH (4 g; 0,1 mol) trong l00 mL nước; tiếp tục khuấy hỗn hợp trong 5 phút. Để yên trong 5 phút, acid hóa với 70 mL dung dịch HCl đậm đặc và đun cách thủy ở 30 oC trong 3 phút, khi tinh thể màu vàng tươi tách ra. Để yên trong tủ lạnh 2 giờ, lọc ra các tinh thể, thêm 50 mL HCl đậm đặc, đun cách thủy trong 10 phút và để nguội. Lọc lấy tủa gồm 4-hydrazinobenzensulfonamid hydroclorid và các muối natri, hòa tan tủa vào trong nước và trung hòa bằng CH3COONa khan, xuất hiện tủa của 4-hydrazinobenzensulfonamid(2). Tổng hợp tạp A Cho 4-hydrazinobenzensulfonamid (4,675 g; 25 mmol) vào bình cầu 250 mL chứa sẵn methanol (75 mL). Điều chỉnh pH tới 2-3 bằng HCl đậm đặc và khuấy đều. Cho từ từ dung dịch 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan- 1,3-dion (5,75 g; 25 mmol) trong methanol (15 mL) vào và đun hồi lưu trong 16 giờ(2). Dung môi được loại bỏ hoàn toàn bằng cô quay, phần còn lại được hòa tan trong 35 mL nước và chiết bằng ethyl acetat (3 x 50 mL). Rửa dịch chiết ethyl acetat bằng nước. Cô quay thu được chất rắn. Tinh chế Sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột trên pha tĩnh hấp phụ (silica gel-Si60), dung môi rửa giải là clorofrom – ethyl acetat – petroleum ether (10:3:2) kết hợp với phương pháp kết tinh thay đổi dung môi. Xác định cấu trúc Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các phương pháp quang phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và HSQC đồng thời so sánh với các tài liệu tham khảo(4). Xác định độ tinh khiết Dựa trên các điều kiện sắc ký tham khảo(3,6), chúng tôi đã khảo sát được các thông số. Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C6 – phenyl (250 x 4,6 mm; 5 µm). Dung môi pha mẫu: nước – methanol (25 : 75). Pha động: Acetonitril – dung dịch đệm (50:50), trong đó dung dịch đệm là dung dịch Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 80 KH2PO4 2,7 g/L đã được điều chỉnh tới pH 3,0 bằng H3PO4. Tốc độ dòng: 1 mL/ phút. Nhiệt độ cột: 50 oC. Thể tích tiêm mẫu: 5 µL. Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 215 nm. Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 10,0 mg tạp A, cho vào bình định mức 10 mL, thêm vào 5 mL dung môi pha mẫu, siêu âm cho đến khi tạp A tan hết (khoảng 5 phút), thêm nước cất vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: dung môi pha mẫu. KẾT QUẢ Methyl trifluoroacetat (M = 128,0502) (SP1) là chất lỏng trong suốt không màu, nặng hơn nước, có mùi thơm của ester. Hiệu suất 67,2%. tos: 42 - 44 oC. Tỷ trọng và nhiệt độ sôi phù hợp với số liệu tham khảo của hãng Sigma- Aldrich (d = 1,273 g/cm3, tos = 43 - 43,5 °C)(5). 4,4,4-Trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan- 1,3-dion (M = 230,1832) (SP2) là chất lỏng màu vàng cam. Không tan trong nước, tan trong ethanol, ethyl acetat. Hiệu suất: 80,5%. Rf = 0,75 (cloroform-ethyl acetat-petroleum ether (10:3:2)). MS m/z: [M-H]- tìm thấy: 229,0473 ([M-H]- dự kiến: 229,0477). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,96 (s, 1H, H2’); 7,92 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H6’); 7,54 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H4’); 7,47 (t, 1H, J = 7,5 Hz, H5’); 6,99 (s, 1H, H2); 4,41 (s, 1H, Henol); 2,40 (s, 3H, Hmethyl). 13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 185,89 (C3); 174,07 (C1); 138,68 (C1’); 135,11(C2’); 132,49 (C6’); 128,99 (C4’); 128,31 (C5’); 125,17 (C3’); 114,28 - 121,05 (-CF3); 93,01 (C2); 20,69 (Cmethyl). 4-Hydrazinobenzensulfonamid (M = 187,2196) (SP3) là tinh thể trắng ngà, hoặc hơi vàng. Tan trong nước, ít tan trong ethanol. Hiệu suất: 73,3%. Rf = 0,55 (Cloroform-ethyl acetat-methanol (10:7:3)). Phổ IR (cm-1): 3251, 3194 (NH), 2846 (C-Hbenzen), 1506 cm-1 (C=Cbenzen). MS m/z: [M-H]- tìm thấy 186,0330 ([M-H]- dự kiến 186,0337); [M+Na]+ tìm thấy 210,0300 ([M+Na]+ dự kiến 210,0313). Phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,50 (d, 2H, J = 9 Hz, H2, H6); 7,40 (s, 2H, Hsulfonamid); 6,91 (d, 2H, J = 9 Hz, H3, H5); 6,88 (s, 2H, HNH2); 6,49 (s, 1H, HNH). 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)- 1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid (M = 381,3722) (Tạp A) là tinh thể trắng sáng. Tan trong methanol, ethyl acetat; không tan trong n-hexan. Hiệu suất: 83,2%. MP: 139,5 oC (phù hợp với thông số LGC Standard(6) 135-145 oC) khoảng nhiệt độ từ khi bắt đầu đến khi nóng chảy hoàn toàn dưới 1 oC. Rf = 0,5 (Cloroform- ethyl acetat-petroleum ether (10:3:2)). Phổ IR (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 3336 (3335, NH), 3236 (3236), 1593 (1592, C=N), 1494 (1494, C=Cbenzen), nhóm CF3 1157 (1157) cm-1, 1128 (1128) cm-1. MS m/z = [M+Na]+ tìm thấy 404,0613 ([M+Na]+ dự kiến 404,0657); [M-H]- tìm thấy 380,0557 ([M-H]- dự kiến 380,0681). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H2, H6); 7,54 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H3, H5); 7,50 (s, 2H, Hsulfonamid); 7,21 (s, 1H, H4’); 7,25 – 7,29 (m, 3H, H5”, H4”, H2”); 7,01 (d, 1H, J = 7,0 Hz, H6”); 2,29 (s, 3H, Hmethyl). Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 145,28 (C3’); 144,01 (C4’); 142,28 (CF3); 141,98 (CF3); 141,04 (C1); 138,21(C3”); 129,99; 129,45; 128,59; 128,13; 126,72 (C2, C6); 125,91 (C3, C5); 122,31 (C5’); 120,17 (C1”); 106,29 (C4’); 20,82 (Cmethyl). Từ các kết quả trên có thể kết luận sản phẩm thu được chính là tạp A của celecoxib. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 81 Xác định độ tinh khiết bằng HPLC Tính phù hợp của hệ thống Tính phù hợp của hệ thống được xác định bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch tạp A 1000 µg/ml. Kết quả trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6) tR (phút) S (µV x giây) As Rs N Trung bình 15,203 20450149 0,95 8,624 18183 RSD (%) 0,07 0,69 0,09 0,48 0,28 RSD của các thông số đều nhỏ hơn 2%, số đĩa lý thuyết (N > 2000), hệ số phân giải Rs > 1,5 cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc phân tích tạp A. Độ tinh khiết của tạp Tiến hành sắc ký mẫu trắng và dung dịch thử (tạp A 1000 µg/ml) cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của pic tạp A. Độ tinh khiết tạp A tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic là 99,15% tính theo chế phẩm khan. Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch tạp A 1000 µg/mL BÀN LUẬN Cho đến nay vẫn chưa ghi nhận công trình nào trên thế giới công bố về quy trình tổng hợp tạp A. Qua 4 bước đã tổng hợp được tạp A của celecoxib, nguyên liệu trong quy trình tổng hợp là các chất thông dụng, dễ tìm. Phản ứng tổng hợp và quy trình tinh chế có hiệu suất tương đối cao (từ 67,2%-83,2%) và có thể thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm. Quy trình tổng hợp đã được lựa chọn những điều kiện phản ứng tối ưu nhất và hiệu suất tổng cộng toàn bộ quy trình là 33,99%. Ở giai đoạn tổng hợp tạp A, việc thêm nhiều lần nguyên liệu 4-hydrazino benzensulfonamid sẽ giúp tăng hiệu suất phản ứng, giảm lượng tạp trong hỗn hợp sau phản ứng. Tinh chế riêng lẻ bằng phương pháp kết tinh lại hoặc sắc ký cột không loại hoàn toàn được tạp. Khi kết hợp giữa hai phương pháp, dùng phân đoạn chứa sản phẩm từ cột sắc ký, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 82 loại dung môi, sau đó kết tinh lại với n-hexan sẽ thu được sản phẩm với độ tinh khiết cao. Tạp A celecoxib sau khi tổng hợp đã xác định hàm lượng bằng HPLC với độ tinh khiết 99,15% phù hợp để nhân chuẩn và có thể bổ sung nguồn tạp chuẩn này cho các cơ quan kiểm nghiệm trong nước, do đến nay tạp này vẫn chưa có trong ngân hàng chất chuẩn quốc gia. KẾT LUẬN Từ các nguyên liệu ban đầu sulfanilamid, anhydrid trifluoroacetic và 3- methylacetophenon, qua 4 bước đã tổng hợp thành công 4-[5-(3-methylphenyl)-3- (trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]benzene sulfonamid - tạp A của celecoxib với hiệu suất từng bước khá cao. Sản phẩm cuối cùng được chứng minh công thức bằng các phương pháp IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và HSQC. Hàm lượng của tạp A là 99,15% khi xác định bằng HPLC, với độ tinh khiết như vậy thì nguyên liệu này đủ điều kiện để tiến hành làm chuẩn trong kiểm nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amiet Louis (1986), "Process for the preparation of methyl trifluoroacetate", US Patent 4730082. 2. Anumula RR, Gilla G, Alla S, et al. (2011), "Process for preparation of celecoxib", US Patent 7919633B2. 3. British Pharmacopoeia (2016), CD-ROMs, monographs: celecoxib. 4. LGC standards (06/2013), “Safety Data Sheet according to OSHA HCS”, Celecoxib impurity A, pp. 1-8. 5. Sigma – Aldrich (01/2017), “Safety datasheet according to 1907/2006/EC”, Methyl trifluoacetate, pp. 1-7. 6. United States Pharmacopoeia 40 (2017), CD-ROMs, monographs: celecoxib. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019