Tối ưu hoá phản ứng tổng hợp sulfasalazin

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 560 TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG TỔNG HỢP SULFASALAZIN La Ngọc Vân*, Trương Văn Đạt*, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Bệnh viêm ruột, một trong những bệnh về đường tiêu hóa, hiện nay đang có xu hướng tăng. Sulfasalazin (Salicylazosulfapyridin), ban đầu được sử dụng như thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp. Sau đó được sử dụng điều trị viêm ruột một cách hiệu quả. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích tạo ra nguồn nguyên liệu sulfasalazin đáp ứng cho ngành dược phẩm Việt Nam trong việc điều trị bệnh viêm ruột. Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Với các trang thiết bị đơn giản cùng nguyên liệu dễ kiếm gồm sulfapyridin, acid salicylic, natri nitrit qua hai giai đoạn để tạo thành sulfasalazin. Giai đoạn 1: tổng hợp muối sulfapyridin diazonium clorid từ sulfapyridin và natri nitrit trong môi trường acid HCl. Giai đoạn 2: tổng hợp sulfasalazin bằng phản ứng ghép đôi giữa muối sulfapyridin diazonium clorid và acid salicylic trong môi trường base NaOH. Nhiệt độ phản ứng luôn duy trì từ 0 oC đến 5 oC. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tổng hợp. Tối ưu hóa quy trình tổng hợp dựa vào phần mềm Modde 5.0. Tinh chế, kiểm tra cấu trúc và độ tinh khiết của sản phẩm. Kết quả: Sulfasalazin được tổng hợp qua 2 bước. Cấu trúc sản phẩm và độ tinh khiết được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như điểm chảy, IR, MS, UV-Vis, SKLM. Kết quả tối ưu hoá cho thấy có 3 yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Phản ứng sau khi tối ưu hoá có hiệu suất cao (82,75%), sản phẩm có độ tinh khiết cao (98,71%) Từ khóa: sulfasalazin, sylfapyridin, tối ưu hóa. ABSTRACT OPTIMIZATION OF PARAMETERS FOR SYNTHESIS OF SULFASALAZINE La Ngoc Van, Truong Van Dat, Tran Thanh Dao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 560 – 566 Background – Objectives: Inflammatory bowel disease, one of the digestive diseases, has increasing tendency. Sulfasalazine (Salicylazosulfapyridine) was originally proposed as a treatment for rheumatoid arthritis. It was subsequently discovered that sulfasalazine was also efficacious in treating inflammatory bowel disease. The aim of this study is to synthesis sulfasalazine with simple and effect condition to supply materials for Vietnam's pharmaceutical industry. Materials and Methods: With simple method and materials such as sulfapyridine, salicylic acid, sodium nitrite, ect and following two steps to synthesis of sulfasalazine. First, synthesis sulfapyridine diazonium from sulfapyridine and sodium nitrite in HCl. Second, synthesis of sulfasalazine by pairing reaction of sulfapyridine diazonium and salicylic acid in NaOH. The temperature of both reactions is maintained from 0 oC to 5 oC. Optimize parameters based on Modde 5.0 software to indentify the best conditions for reaction. Results: Salfasalazine was synthesized from 2 step reaction. Structure of sulfasalazine was identified by these methods: melting point, IR, MS, UV-Vis, TLC. There were 3 factors affecting the reaction yield. The *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 Email: daott@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 561 experimental result is high yield (82.75%) and high impurity (98.71%). Keywords: sulfasalazine, sulfapyridine, optimization. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm ruột rất phổ biến ở các nước phương Tây, đặc biệt tỷ lệ mắc bệnh tăng mạnh vào khoảng đầu những năm 1950. Nguyên nhân của xu hướng này có thể do ô nhiễm nguồn nước, mất an toàn vệ sinh thực phẩm và thói quen sinh hoạt thiếu khoa học. Ngoài ra, bệnh này tuy phổ biến và ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng cuộc sống nhưng nhiều người vẫn thờ ơ, chưa điều trị kịp thời và dứt điểm nên dễ gây ra những biến chứng đáng tiếc. Điều trị bằng thuốc là phương pháp đầu tiên để làm giảm các triệu chứng của bệnh viêm kết tràng và cả bệnh Crohn. Hai loại thuốc thường được kê đơn là thuốc kháng viêm và chất ức chế miễn dịch. Trong các phác đồ điều trị bệnh hiện nay thì thuốc kháng viêm thường là bước đầu tiên trong điều trị gồm các sulfamid như sulfasalazin, mesalazin, olsalazin và balsalazin(1,3,9). Qua tìm hiểu, chúng tôi nhận thấy rằng một trong những thuốc đầu tay điều trị viêm ruột là sulfasalazin hoàn toàn có thể sản xuất ở Việt Nam với nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, hoá chất Bảng 1: Danh mục các hóa chất sử dụng STT Tên hóa chất Hàm lượng (%) Tiêu chuẩn Xuất xứ 1 Sulfapyridin ≥ 99,0 Tổng hợp Mỹ (Merck) 2 Acid salicylic ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 3 Natri nitrit ≥ 99,0 Tổng hợp Trung Quốc 4 HCl 36-38 Tổng hợp Trung Quốc 5 NaOH ≥ 99,0 Tổng hợp Trung Quốc 6 Methanol ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 7 Cloroform ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 8 Acid acetic băng ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 9 Ethyl methyl ceton ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 10 Aceton ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 11 Natri acetat ≥ 99,5 Tổng hợp Trung Quốc 12 Methanol ≥ 99,9 Kiểm Nghiệm (HPLC) Mỹ 13 Acetonitril ≥ 99,9 Kiểm Nghiệm (HPLC) Mỹ Thiết bị nghiên cứu Máy khuấy từ Stuart, cá từ. Máy hút chân không, phễu Buchner. Cân phân tích Kern ABS-220-4. Máy soi UV VL-215-LC. Tủ sấy dụng cụ Heraeus. Tủ lạnh Towashi. Máy đo điểm chảy Stuart. Máy làm đá EverMed. Bercher, pipet, nhiệt kế, bình cầu và các dụng cụ khác. Phương pháp nghiên cứu - Dựa vào các patent để chọn phương pháp tổng hợp sulfasalazin phù hợp với điều kiện Việt Nam. Sulfasalazin được tổng hợp từ 2 giai đoạn theo phương pháp(6,7): Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 562 Sơ đồ 1: Các giai đoạn tổng hợp sulfasalazin + Giai đoạn 1: Tổng hợp muối sulfapyridin diazonium clorid từ sulfapyridin và natri nitrit trong môi trường acid HCl, nhiệt độ phản ứng duy trì từ 0 oC đến 5 oC. + Giai đoạn 2: Tổng hợp sulfasalazin bằng phản ứng ghép đôi giữa muối sulfapyridin diazonium clorid và acid salicylic trong môi trường base NaOH, nhiệt độ phản ứng cũng luôn duy trì từ 0 oC đến 5 oC. - Thực hiện khảo sát sơ bộ: Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng. Ở mỗi lần khảo sát, thay đổi thông số cần tìm trong khi giữ nguyên các giá trị khác. - Tối ưu hoá bằng phần mềm Modde 5.0: sau khi xác định, các yếu tố ảnh hưởng sẽ được đưa vào phần mềm Modde, bố trí các yếu tố theo mô hình Box-Behnken để phần mềm cho ra những phản ứng cần thực hiện(8). - Xây dựng quy trình tổng hợp sulfasalazin hoàn chỉnh: tổng hợp sulfasalazin theo quy trình đã lựa chọn; tinh chế sản phẩm thu được; kiểm tra bằng sắc lý lớp mỏng; đo độ ẩm, định lượng, tính hiệu suất phản ứng; định tính; kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC(2). - Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký(2): + Hệ thống HPLC: Alliance (Water 2695– Detector PDA 2996) + Cột phân tích: HiQ sil C18, size 4,6 mm x 250 mm (5µm) Ser.00B00494 + Pha động: Methanol – Acetonitril – Nước cất (30:30:40) + Nhiệt độ cột: 24 oC + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl + Bước sóng phát hiện: 365 nm + Nồng độ pha mẫu 100 ppm. KẾT QUẢ Tổng hợp, tinh chế và tính hiệu suất phản ứng - Tiến hành phản ứng diazo hoá và phản ứng ghép đôi theo sơ đồ 1, thực hiện trong bình cầu: + Bình cầu 1: 0,3 g (0,0012 mol) sulfapyridin hòa tan trong 4ml HCl 3M. + Bình cầu 2: 0,08 g (0,0012 mol) NaNO2 hòa tan trong 3ml nước. + Ngâm cả 2 bình cầu trong nước đá đến khi nhiệt độ đạt khoảng 0 oC - 5 oC. + Thực hiện phản ứng diazo hoá. - Phản ứng ghép đôi: + Chuẩn bị bình cầu 3: cân 0,18 g (0,0013 mol) acid salicylic hòa tan trong 5ml NaOH 20%. Ngâm bình cầu 3 trong nước đá đến khi nhiệt độ đạt khoảng 0 oC - 5 oC. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 563 + Cho từ từ hỗn hợp muối sulfapyridin diazonium clorid vào bình cầu 3, kiểm tra nhiệt độ luôn phải nằm trong khoảng 0 oC - 5 oC. Sau khi đã cho hết, để phản ứng tiếp tục trong 2 giờ, nhiệt độ luôn duy trì trong khoảng 0 oC - 5 oC. + Sau 2 giờ, để phản ứng trở về nhiệt độ phòng. Cho từ từ dung dịch HCl 3M vào dịch phản ứng, tủa sẽ bắt đầu xuất hiện, tiếp tục cho dung dịch HCl vào đến khi hỗn hợp đạt pH=5. Lọc lấy tủa, rửa tủa kỹ bằng nước, sau đó rửa bằng ether, sấy khô. - Tinh chế sản phẩm trong becher chứa H2O và dung dịch CH3COOH (tỷ lệ 1:2). Lọc lấy sản phẩm, sấy khô. Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng. Hiệu suất sau tinh chế là 56,01%. - Thực hiện kiểm tra trên SKLM với 3 hệ dung môi: + Hệ 1: Cloroform – ethyl methyl ceton – acid acetic (70:15:10) + Hệ 2: Cloroform – aceton – acd acetic (90:5:5) + Hệ 3: Cloroform – methanol - acid acetic (85:10:5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Môi trường acid cho phản ứng diazo hóa và môi trường base cho phản ứng ghép cặp. Acid HCl và base NaOH là những nguyên liệu có sẵn và dễ kiếm nên chúng tôi thực hiện theo tài liệu đã chọn. Ngoài ra, quá trình điều chế phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp từ 0 oC đến 5 oC vì HNO2 dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao và muối diazonium là hợp chất không bền dễ bị phân hủy sẽ chuyển một phần thành dẫn xuất của phenol ở nhiệt độ thường làm giảm hiệu suất phản ứng. Vậy nên chúng tôi sẽ giữ phản ứng ở nhiệt độ cố định từ 0 oC đến 5 oC. Do đó, chúng tôi thực hiện tối ưu hoá trên các yếu tố còn lại như sau: Khảo sát thời gian phản ứng - Giữ nguyên các yếu tố tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin, tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin, thay đổi thời gian phản ứng lần lượt 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ. Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng. - Hiệu suất tăng dần theo thời gian, nhận thấy rằng tại thời điểm 3 giờ (180 phút) thì cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị đó hiệu suất bắt đầu giảm xuống. Chọn giá trị 3 giờ ứng với thời gian phản ứng tối ưu để đưa vào mô hình thiết kế phản ứng. Khảo sát tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin - Để thực hiện khảo sát tỷ lệ mol giữa natri nitrit – sulfapyridin, các yếu tố thời gian, tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin được cố định, còn tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin được thay đổi lần lượt bằng 1:1; 1,75:1; 2:1; 2,25:1; 2,5:1; 2,75:1. - Cố định thông số thời gian tại 3 giờ (180 phút) và lượng acid salicylic sử dụng là 0,18g (0,0013 mol). Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng. Tại tỉ lệ 2,25:1 thì cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị đó hiệu suất bắt đầu giảm xuống. Chọn giá trị tỉ lệ 2,25 cho hiệu suất phản ứng tối ưu để đưa vào mô hình thiết kế phản ứng. Khảo sát tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin - Để thực hiện khảo sát tỷ lệ mol giữa acid salicylic – sulfapyridin, các yếu tố thời gian, tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin được cố định, còn tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin được thay đổi lần lượt bằng 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1;3,5:1 - Cố định thông số thời gian tại 3 giờ (180 phút) và lượng natri nitrit sử dụng là 0,14g (0,002 mol). Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng. Tại tỉ lệ 2,5:1 thì cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị đó hiệu suất bắt đầu giảm xuống. Chọn giá trị tỉ lệ 2,5 cho hiệu suất phản ứng tối ưu để đưa vào mô hình thiết kế phản ứng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 564 Kết quả bố trí thí nghiệm bậc 2 theo mô hình Box-Behnken Tiến hành - Chọn các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, ta có 3 yếu tố như sau: + Yếu tố 1: Tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin. + Yếu tố 2: Tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin. + Yếu tố 3: Thời gian phản ứng (phút) Bảng 2. Mã hóa các yếu tố khảo sát Yếu tố Các mức Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1 X1- 2 2,25 2,5 X2- 2 2,5 3 X3- 150 180 210 Kết quả - Bố trí ma trận và các giá trị thực nghiệm thu được: Bảng 3. Kết quả hiệu suất 15 phản ứng STT Mã thí nghiệm Tỷ lệ mol NaNO2 và sulfapyridin Tỷ lệ mol acid salicylic và sulfapyridin Thời gian phản ứng Hiệu suất (%) 1 N1 2,00 2,0 180 53,54 2 N2 2,50 2,0 180 64,25 3 N3 2,00 3,0 180 61,19 4 N4 2,50 3,0 180 75,82 5 N5 2,00 2,5 150 67,71 6 N6 2,50 2,5 150 82,14 7 N7 2,00 2,5 210 66,74 8 N8 2,50 2,5 210 76,82 9 N9 2,25 2,0 150 58,58 10 N10 2,25 3,0 150 70,34 11 N11 2,25 2,0 210 56,85 12 N12 2,25 3,0 210 67,82 13 N13 2,25 2,5 180 77,25 14 N14 2,25 2,5 180 76,62 15 N15 2,25 2,5 180 76,77 - Tiến hành phân tích ANOVA, giá trị R2 = 0,998 là đạt yêu cầu (yêu cầu > 0,9) với mức tin cậy 95% thể hiện mối tương quan chặt chẽ giữa hiệu suất và các yếu tố khảo sát. - Bên cạnh đó, giá trị Q2 = 0,967 cũng đạt yêu cầu (yêu cầu > 0,5) cho thấy các biến số trong phương trình hồi quy cũng có sự tương quan khá chặt chẽ. Dựa theo hệ số Q2 ta cũng có thể dự đoán hiệu suất của phản ứng khi thay đổi các yếu tố khảo sát ở trong vùng khảo sát. - Giá trị p trong phân tích ANOVA bằng 0,000 là đạt yêu cầu (yêu cầu < 0,05) chứng tỏ mô hình phù hợp với thực nghiệm. - Phương trình bề mặt đáp ứng đối với hiệu suất được thiết lập như sau: Y (%) = 76,88 + 6,23125X1 + 5,24376X2 – 1,3175X3 – 1,6125X12 – 11,5675X22 – 1,91499X32 + 0,979988X1X2 – 1,0875X1X3 - Trong đó: X1: Tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin. X2: Tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin. X3: Thời gian phản ứng. Hình 2: Tác động của các yếu tố lên hiệu suất phản ứng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 565 - Nhận xét: + Từ phương trình bề mặt đáp ứng và hình 2 ta nhận thấy rằng yếu tố tỷ lệ mol NaNO2 và tỷ lệ mol acid salicylic có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phản ứng. Hai tỷ lệ này khi tăng lên thì sẽ dẫn đến tăng hiệu suất tổng hợp tuy nhiên khi tỷ lệ này tăng quá cao sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng, thể hiện qua yếu tố X và X2. + Tương quan giữa tỷ lệ mol NaNO2 và tỷ lệ mol acid salicylic là tương quan có ý nghĩa thể hiện qua hệ số X1X2. Hệ số tương quan cho thấy rằng khi cùng tăng 2 yếu tố này thì hiệu suất của phản ứng sẽ tăng. + Tương quan giữa tỷ lệ mol NaNO2 và thời gian cũng là tương quan có ý nghĩa thể hiện qua hệ số tương quan X1X3. Hệ số tương quan cho biết rằng khi đồng thời tăng 2 yếu tố này thì hiệu suất sẽ giảm. Hình 3: Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất vào các biến riêng lẻ - Tiến hành dự đoán giá trị tối ưu hiệu suất của phản ứng bằng phần mềm. Kết quả tối ưu là: tỷ lệ mol NaNO2 và sulfapyridin = 2,5; tỷ lệ mol salicylic và sulfapyridin = 2,6332; thời gian phản ứng là 161 phút. Lặp lại thí nghiệm theo như điều kiện dự đoán 3 lần, ta thu được các hiệu suất như sau: 83,15%; 82,34%; 82,76%. Hiệu suất phản ứng thực tế trung bình là 82,75%, khác biệt không có ý nghĩa với hiệu suất dự đoán là 83,124%. Kết quả xác định tính chất và kiểm tra độ tinh khiết Bảng 4: Bảng tóm tắt các chỉ tiêu định tính và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm Chỉ tiêu Kết quả SKLM Kiểm tra với 3 hệ dung môi, kết quả không có bất kì vết phụ nào ở vết của sản phẩm IR Dao động ứng với νmax: 1678 cm -1 (-CO), 1537 cm -1 (-C=C-) MS [M+H ]+ là 399,0653 và [M-H] - là 397,0696 UV λmax = 366 nm và λmax = 243 nm Điểm chảy Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm là 240 o C-245 o C kèm sự phân hủy. Độ tinh khiết 98,71% theo HPLC Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế đã được công bố. Như vậy, sản phẩm đúng là sulfasalazin(4,5). BÀN LUẬN Kết quả tối ưu hoá thể hiện rằng khi giá trị được chọn khảo sát càng tốt thì đường sẽ có dạng parabol, giá trị cực đại có thể nhìn thấy được và vẫn nằm trong miền giá trị khảo sát. Cả 3 yếu tố khảo sát đều có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, khi các giá trị này tăng thì hiệu suất phản ứng tăng. Nhưng khi giá trị này tăng đến một giá trị ngưỡng nào đó thì hiệu suất bắt đầu giảm xuống. Cả 3 yếu tố đều tương quan qua lại. Như vậy, mô hình đáp ứng tốt, các giá trị chọn để khảo sát là tối ưu. Vùng giá trị cực đại đều nhìn thấy được trên các đường đồng mức, giá trị hiệu suất thu được sau khi tiến hành bằng thực nghiệm dựa trên mô hình có giá trị gần bằng giá trị dự đoán, sau khi tiến hành tối ưu, hiệu suất tổng hợp đạt được 82,75%. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã khảo sát và xây dựng được quy trình tổng hợp sulfasalazin từ 3 nguyên liệu là sulfapyridin, NaNO2 và acid salicylic bằng cách diazo hóa sulfapyridin và ghép đôi muối diazonium này với acid salicylic. Đây là một phương pháp dễ thực hiện, trang thiết bị đơn giản và nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 566 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp sulfasalazin bằng phần mềm Modde 5.0 đưa ra được những thông số tối ưu cho quy trình tổng hợp và đã kiểm tra bằng thực nghiệm. Kết quả tối ưu là: tỷ lệ mol NaNO2 và sulfapyridin = 2,5; tỷ lệ mol salicylic và sulfapyridin = 2,6332; thời gian phản ứng là 161 phút. Định tính, kiểm tra độ tinh khiết bằng các phương pháp: sắc kí lớp mỏng, MS, UV, IR, và HPLC và cho thấy sản phẩm tổng hợp được hoàn toàn phù hợp với cấu trúc dự đoán, độ tinh khiết khá cao, hàm lượng đạt 98,71%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Buning C and Lochs H (2006), "Conventional therapy for Crohn's disease", World J Gastroenterol, 12(30), pp. 4794-4806. 2. Chen J (2007), "Determination of Sulfasalazine Tablets by HPLC", Food and Drug Control Institute of Nanning City, Nanning, China. 3. Cross RK, Jung C, Wasan S, et al. (2006), "Racial differences in disease phenotypes in patients with Crohn’s disease", Inflamm Bowel Dis, 12, pp. 192-198. 4. https://monographs.iarc.fr/wp-content/uploads/2018/06 /mono108-08.pdf (truy cập 06/2018) 5. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sulfasalazine (truy cập 06/2018) 6. Karl HA (1977), "4-(4-hydroxy-or acetoxy-3-carbomethoxy phenylazo)-benzenesulphonyl chloride", US Patent 4,405,429. 7. Karl HA (1986), "2-hydroxy-5-(arylazo)-benzene alkanoic acids", US Patent 4,628,083. 8. Nguyễn Thị Chung (2009), Ứng dụng tối ưu hóa thống kê trong lĩnh vực nghiên cứu dược phẩm, Bài giảng cao học, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, tr. 53. 9. Watkinson G (1986), "Sulphasalazine: a review of 40 years' experience", Drugs, 32, pp. 1-11. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019