Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải pectin mạnh

1 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PECTIN MẠNH Phan Thị Thanh Diễm1Ngô Thị Bảo Châu2 Tóm tắt: Việc sản xuất chế phẩm enzyme pectinase từ các chủng nấm mốc rất có ý nghĩa trong đời sống nói chung và lĩnh vực công nghệ thực phẩm nói riêng. Trong nghiên cứu này, một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc Penicillium citrinum M4 và chủng nấm mốc Aspergillus oryzae M75 có khả năng phân giải pectin, phân lập từ các loại vỏ củ, quả giàu pectin đã được tối ưu hóa. Chủng P. citrinum M4 có thời gian nuôi cấy là 120 giờ; pH môi trường là 7,5; nguồn carbon là tinh bột; nguồn nitrogen là peptone. Chủng A. oryzae M75 có thời gian nuôi cấy là 72 giờ; pH môi trường là 7,5; nguồn carbon là maltose; nguồn nitrogen là urea. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm enzyme pectinase trong đời sống. Từ khóa: Aspergillus, Điều kiện nuôi cấy, Pectin, Pectinase, Penicillium. 1. Mở đầu Hiện nay, nhiều enzyme vi sinh vật đã được khai thác, sản xuất và ứng dụng rất nhiều trong đời sống. So với nguồn khai thác từ động vật và thực vật thì nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền,... Các enzyme được tập trung nghiên cứu và ứng dụng phải kể đến như protease, amylase, cellulase và pectinase cũng là một trong những enzyme đang được quan tâm hiện nay. Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin. Đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease [2]. Enzyme này được sử dụng nhiều trong công nghệ chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt sợi, xử lý nước thải, y học, nông nghiệp,... Tuy nhiên, giá thành các chế phẩm pectinase còn khá cao, điều này sẽ hạn chế khả năng ứng dụng của enzyme này vào thực tế. Mục đích của nghiên cứu này là xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp về thời gian, pH, các nguồn carbon và nguồn nitrogen cho 2 chủng Penicillium citrinum M4 và Aspergillus oryzae M75, nhằm tạo cơ sở cho nấm mốc sinh trưởng phát triển mạnh và phân giải pectin tốt nhất đồng thời là cơ sở để sản xuất chế phẩm enzyme pectinase. 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Hai chủng Penicillium citrinum M4 và Aspergillus oryzae M75 có khả năng phân giải pectin mạnh này được lưu giữ tại Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. 1 . ThS, Khoa Lý-Hóa-Sinh, Trường Đại học Quảng Nam 2 . ThS, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 2 Hình 1. Khuẩn lạc của các chủng P. citrinum M4 và A. oryzae M75 có khả năng phân giải pectin mạnh 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Hai chủng P. citrinum M4 và A. oryzae M75 được nuôi cấy trong môi trường Czapek dịch thể có bổ sung pectin thay thế nguồn đường saccharose [3]. - Bố trí thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm mốc bằng phương pháp“một lúc - một biến”. Nghiên cứu lựa chọn thời gian thích hợp ở khoảng thời gian 48, 72, 96, 120 và 144 giờ. Tối ưu pH lần lượt là 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0. Nguồn carbon là glucose, lactose, maltose, fructose, tinh bột, CMC và rỉ đường. Nguồn nitrogen là gelatin, urea, cao thịt, cao nấm men, peptone và NH4NO3. Nuôi cấy dịch nấm mốc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 4 ngày sau đó thu enzyme ngoại bào. Lấy 100 µl dịch enzyme ngoại bào cho vào giếng thạch pectin rồi đem ủ ở 37°C, sau 24 giờ lấy ra nhuộm thuốc thử Lugol. Xác định hoạt tính pectinase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân pectin [3]. - Phương pháp xác định hoạt độ pectinase: Hoạt độ pectinase được xác định bằng cách đo lượng đường khử được giải phóng từ hoạt động của pectinase trên cơ chất pectin bằng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). Lấy 3 ml hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,8 ml dung dịch pectin và 0,2 ml dịch enzyme được pha loãng thích hợp trong 2 ml dung dịch sodium acetate 0,1 M; pH 5. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 40°C trong 10 phút. Sau đó thêm vào 1 ml NaOH và 1 ml DNS, làm dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 10 phút. Tính lượng đường khử giải phóng bởi sự thủy phân enzyme. Một đơn vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol của các nhóm khử trong một phút với galacturonic acid là tiêu chuẩn trong các điều kiện thí nghiệm [6]. - Phương pháp xác định sinh khối khô của nấm mốc: Thu sinh khối tươi nấm mốc từ bình nuôi cấy cho vào đĩa petri có lót giấy lọc tiến hành sấy khô tuyệt đối [3]. - Xử lý số liệu: thí nghiệm lặp lại ba lần, số ́liệu được xử lí bằng thống kê mô tả (Microsoft Excel 2010) và phân tích ANOVA (Duncan’s test p <0,05) bằng chương trình SPSS 20.0. 3. Kết quả 3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 3 Trong môi trường Czapek dịch thể có bổ sung pectin (3g/l), 2 chủng P. citrinum M4 và A. oryzae M75 được xác định sinh khối khô và hoạt tính pectinase sau khoảng thời gian nuôi cấy là 48, 72, 96, 120 và 144 giờ. Kết quả được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Thời gian nuôi cấy (giờ) SKK )mg/mL) ĐKVPGP )mm) Hoạt độ pectinase (U/ )mL P. citrinum M4 48 0,10h 13,33l 10,12e 72 0,19g 16,00k 11,08c 96 0,35e 23,33e 11,24b 120 0,45c 27,33b 11,87a 144 0,40d 25,67c 10,44d A. oryzae M75 48 0,10h 24,00d 8,69g 72 0,23f 28,67a 10,12e 96 0,47b 22,67f 8,85f 120 0,49a 21,67g 8,21h 144 0,44c 19,33h 7,57k Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test). Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong quá trình nuôi cấy chủng P. citrinum M4 cho hoạt tính pectinase và tích lũy sinh khối cực đại tại thời điểm 120 giờ nuôi cấy: đường kính vòng phân giải 27,33 mm; sinh khối khô đạt 0,45 g/mL; hoạt độ pectinase 11,87 U/mL. Sau 120 giờ nuôi cấy thì hoạt tính pectinase cũ̃ng như sinh khối bắt đầu giảm dần. Chủng A. oryzae M75 có hoạt tính pectinase đạt cực đại tại 72 giờ nuôi cấy: đường kính vòng phân giải 28,67 mm; hoạt độ pectinase 10,12 U/mL. Tuy nhiên, khả năng tích lũy sinh khối của chủng A. oryzae M75 diễn ra chậm hơn so với hoạt tính pectinase, đạt cực đại tại thời điểm 120 giờ nuôi cấy với 0,49 g/mL. Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng, thời gian nuôi cấy thích hợp cho A. niger thể hiện hoạt tính enzyme pectinase cao nhất là 48 giờ [4]. PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 4 Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Hà, khả năng sinh tổng hợp pectinase của chủng nấm mốc NM1 (phân lập từ vỏ cam hỏng) đạt cực đại tại thời điểm 72 giờ [1]. Hình 2. Đường kính vòng phân giải pectin của pectinase tá́ch từ chủng P. citrinum M4 sau 120 giờ và A. oryzae M75 sau 72 giờ nuôi cấy 3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Sau thời gian nuôi cấy thích hợp (72 giờ đối với chủng nấm mốc A. oryzae M75 và 120 giờ đối với chủng P. citrinum M4) ở các pH môi trường nuôi cấy khác nhau, xác định sinh khối khô và hoạt độ pectinase. Kết quả được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Chủng nấm mốc pH môi trường nuôi cấy SKK )mg/mL) ĐKVPGP )mm) Hoạt độ )pectinase (U/mL P. citrinum M4 4,0 0,05n 0,00l 0,40o 5,0 0,12m 0,00l 2,47m 6,0 0,27k 24,00f 9,64e 6,5 0,42f 25,33e 10,44d 7,0 0,46de 26,67cd 10,92b 7,5 0,47d 27,67b 12,51a 8,0 0,43f 23,00g 9,17g A. oryzae M75 4,0 0,11m 0,00l 0,40o 5,0 0,14l 12,33k 0,88n PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 5 6,0 0,38g 26,33d 8,37k 6,5 0,45e 27,00bcd 9,01h 7,0 0,53c 27,33bc 9,33f 7,5 0,60a 29,33a 10,67c 8,0 0,55b 21,33h 7,57l Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test). Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng P. citrinum M4 và A. oryzae M75 có khả năng phân giải pectin trong môi trường có pH khoảng 6,0 - 8,0, trong đó pH 6,5 - 7,5 là thích hợp nhất cho hoạt động phân giải pectin của chúng. Chủng P. citrinum M4 có giá trị pH môi trường tối ưu là 7,5 (đường kính vòng phân giải pectin 27,67 mm, sinh khối khô 0,47 mg/mL, hoạt độ pectinase 12,51 U/mL). Chủng A. oryzae M75 cũng có giá trị pH môi trường tối ưu là 7,5 (đường kính vòng phân giải 29,33 mm, sinh khối khô 0,60 mg/mL, hoạt độ pectinase 10,67 U/mL). Ở môi trường pH 4,0, cả hai chủng nấm mốc đều không có khả năng tiết enzyme pectinase ra môi trường hoặc khả năng tiết enzyme pectinase rất yếu. Nguyên nhân có thể là do ở điều kiện này, do môi trường acid mạnh đã hạn chế sinh trưởng phát triển, sự sinh tổng hợp enzyme của các chủng nấm mốc. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Hà, khả năng sinh tổng hợp pectinase của chủng nấm mốc NM1 (phân lập từ vỏ cam hỏng) đạt cực đại tại pH 5,0 [1]. Hình 3. Đường kính vòng phân giải pectin của pectinase tách từ chủng P. citrinum M4 và chủng A. oryzae M75 ở giá trị pH 7,5 3.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Nuôi cấy lắc các chủng nấm mốc trong môi trường Czapek dịch thể pH = 7,5 với các nguồn carbon khác nhau: glucose, lactose, maltose, fructose, tinh bột, CMC và rỉ đường trong 72 giờ đối với chủng A. oryzae M75 và 120 giờ đối với chủng P. citrinum M4. Kết quả được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 6 Chủng nấm mốc Nguồn carbon )SKK (mg/mL )ĐKVPGP (mm P. citrinum M4 Glucose 0,18f 23,67l Maltose 0,49c 34,33d Lactose 0,05lm 20,33n Fructose 0,06k 23,00m Tinh bột 0,28e 40,33a CMC 0,03n 25,67k Rỉ đường 0,09gh 31,00f A. oryzae M75 Glucose 0,10g 32,67e Maltose 0,62a 39,67a Lactose 0,08h 28,67g Fructose 0,42d 26,33hk Tinh bột 0,48c 38,00b CMC 0,04mn 26,67h Rỉ đường 0,52b 36,67c Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test) Đối với chủng P. citrinum M4, đường kính vòng phân giải pectin cao nhất ở môi trường có nguồn bổ sung carbon là tinh bột, vòng phân giải đạt 40,33 mm và thấp nhất ở môi trường có nguồn carbon là lactose (20,33 mm). Khả năng tích lũy sinh khối của chủng P. citrinum M4 trong môi trường Czapek - pectin với các nguồn carbon khác nhau cũng rất khác nhau. Sinh khối khô thấp ở môi trường có nguồn carbon như CMC, lactose, fructose. Sinh khối khô đạt cực đại ở môi trường nuôi cấy sử dụng maltose (0 ,49 mg/mL ). Trong khi đó, chủng A. oryzae M75 lại thích hợp với nhiều nguồn carbon khác nhau, thể hiện qua đường kính vòng phân giải pectin của enzyme khá lớn (cao hơn 25,00 mm), cao nhất là khi nuôi cấy trong môi trường có nguồn carbon là maltose (38,00 mm, sinh khối khô 0,62 mg/mL). Như vậy, nguồn carbon thích hợp nuôi cấy đối với hai chủng nấm mốc P. citrinum M4 và A. oryzae M75 lần lượt là tinh bột và maltose. PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 7 Hình 4. Đường kính vòng phân giải pectin của pectinase tách từ chủng P. citrinum M4 và chủng A. oryzae M75 với nguồn carbon nuôi cấy tối ưu 3.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng, phát triển và khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc các chủng nấm mốc trong môi trường Czapek dịch thể với các nguồn nitrogen khác nhau: gelatine, urea, cao thịt, cao nấm men, peptone và NH4NO3. Sau 72 giờ nuôi cấy với nguồn carbon là maltose đối với chủng M75 và 120 giờ nuôi cấy với nguồn carbon là tinh bột đối với chủng M4, ở điều kiện pH = 7,5 cho cả hai chủng nấm mốc. Kết quả được thể hiện ở Bảng 4. Đối với chủng P. citrinum M4, trong môi trường nuôi cấy bổ sung cao nấm men khả năng tích lũy sinh khối cao nhất (0,52 mg/mL) và đường kính vòng phân giải đạt 42,47 mm. Với nguồn urea, sinh trưởng phát triển cũng như phân giải pectin thấp, với sinh khối khô chỉ đạt 0,07 mg/mL và môi trường bổ sung nguồn NH4NO3 thì đường kính vòng phân chỉ 21,00 mm. Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng phát triển và phân giải pectin của các chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Nguồn nitrogen )SKK (mg/mL )ĐKVPGP (mm P. citrinum M4 Gelatine 0,36k 27,67k Cao nấm men 0,52d 29,67g Cao thịt 0,43h 32,33c Peptone 0,49e 42,67a Urea 0,07l 25,67l NH4NO3 0,44gh 21,00o A. oryzae M75 Gelatine 0,64 a 24,17m PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 8 Cao nấm men 0,43h 28,33h Cao thịt 0,46f 30,50e Peptone 0,45fg 23,17n Urea 0,55c 41,67b NH4NO 3 0,57b 31,50e Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test) Ở chủng A. oryzae M75, trong môi trường nuôi cấy có bổ sung nguồn gelatine thì nấm mốc có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt với sinh khối khô đạt 0,64 mg/mL. Hoạt tính pectinase mạnh ở môi trường nuôi cấy có bổ sung nguồn urea với đường kính vòng phân giải lớn 41,67 mm. Và khả năng sinh trưởng phát triển yếu ở môi trường bổ sung nguồn nitrogen là cao nấm men sinh khối chỉ đạt 0,43 mg/mL và khi bổ sung nguồn peptone đường kính vòng phân giải pectin chỉ 23,17 mm. Theo Nguyễn Thị Thúy Hà (2011), sử dụng môi trường bán rắn với cám, trấu, pectin (3g/100g môi trường), nguồn nitrogen lần lượt là (NH4)2SO4, NH4NO3 và peptone thì chủng NM1 có khả năng sinh trưởng tổng hợp pectinase cao nhất khi sử dụng nguồn nitrogen là (NH4)2SO4, sau đó đến peptone và cuối cùng là NH4NO3 [1]. Còn theo kết quả nghiên cứu Trần Thanh Trúc (2013) với nguồn nitrogen bổ sung là urea, (NH4)2SO4, (NH4)HSO4 thì urea cho hoạt độ pectinase cao nhất 27,87 U/g [5]. Hình 5. Đường kính vòng phân giải pectin của pectinase tách từ chủng P. citrinum M4 và A. oryzae M75 với nguồn nitrogen nuôi cấy tối ưu 4 . Kết luận Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển và khả năng phân giải pectin mạnh của 2 chủng nấm mốc trong môi trường Czapek dịch thể là: - Chủng P. citrinum M4: thời gian nuôi cấy 120 giờ; pH môi trường 7,5; nguồn carbon tinh bột và nguồn nitrogen peptone. - Chủng A. oryzae M75: thời gian nuôi cấy 72 giờ; pH môi trường 7,5; nguồn carbon maltose và nguồn nitrogen urea. PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 9 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Thị Thúy Hà (2005), “Nghiên cứu khả năng tổng hợp pectinase của nấm mốc phân lập từ cơ chất giàu pectin và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”, Luận văn Thạc sĩ kĩ thuật, Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm và đồ uống, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng. [2] Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật Sinh hóa, NXB ĐHQG Tp. HCM [3] Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Thực tập Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Huế. [4] Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2009), “Nghiên cứu enzyme cellulase và pectinase từ chủng Trichoderma viride và Aspergillus niger nhằm xử lí nhanh vỏ quả cà phê”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 12 (13), tr. 50 - 56. [5] Trần Thanh Trúc (2013), “Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger sinh pectin methyllesterase hoạt tính cao”, Luận án Tiến sĩ, Chuyên ngành Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. [6] Mrudula S., Anitharaj R. (2011), “Pectinase production in solid state fermentation by Aspergillus niger using orange peel as substrate”, Global Journal of Biotechnology & Biochemistry, 6 (2), pp. 64 - 71. Title: OPTIMIZING CULTIVATION CONDITIONS OF MOLD STRAINS FOR PECTIN HYDROLYSIS PHAN THI THANH DIEM Quang Nam University NGO THI BAO CHAU University of Science, Hue University Abstract: The production of pectinase enzymes from molds is significant in life in general, specifically in food technology. In this study, some conditions for the culture of mold strain P. citrinum M4 and mold strain A. oryzae M75 have the ability to decompose pectin, isolated from the optimized pectin - rich peels of some fruits. M4 mold strain - Penicilliumcitrinum has a culture time of 120 hours; pH of the medium is 7.5; carbon source is starch; nitrogen is pepton. M75 mold strain - Aspergillusoryzae has a culture time of 72 hours; pH of the medium is 7.5; carbon source is mattose; nitrogen is urea. Research results will contribute to the production and application of pectinase enzyme in real life situations. Keywords: Aspergillus, Culture condition, Pectin, Pectinase, Penicillium. PHAN THỊ THANH DIỄM - NGÔ THỊ BẢO CHÂU 10