Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và xác định hàm lượng các ginsenosid re, rg1 và rb1 trong sâm Hoa Kỳ (panax quinquefolius l.) bằng phương pháp hplc với đầu dò PDA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 108 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC GINSENOSID RE, RG1 VÀ RB1 TRONG SÂM HOA KỲ (Panax quinquefolius L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Nguyễn Thanh Tuyền*, Vũ Hải Đăng*, Ngô Kiến Đức* TÓM TẮT Mở đầu: Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) là một dược liệu quý thuộc chi Panax, có tác dụng tốt trên nhiều hệ cơ quan khác nhau như hệ thần kinh, tim mạch, miễn dịch, Các sản phẩm từ sâm và cao chiết sâm rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm này còn chưa được đảm bảo. Do đó, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và xác định hàm lượng các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” được thực hiện với mục đích xây dựng một quy trình chiết xuất và kiểm nghiệm để kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong các chế phẩm sâm. Mục tiêu: Khảo sát tìm điều kiện chiết xuất tối ưu các ginsenosid trong sâm Hoa Kỳ. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Đối tượng nghiên cứu: Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) Phương pháp nghiên cứu: tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid bằng mô hình Box-Behnken. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời ba ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 theo hướng dẫn của ICH 2005. Kết quả: Quy trình định lượng đồng thời ba ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 đã được xây dựng và thẩm định và đạt các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác cao. Xác định được ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết lên hiệu suất chiết ginsenosid. Điều kiện chiết xuất tối ưu các ginsenosid là ethanol 69,4%, tỉ lệ dung môi/dược liệu 51,4 ml/ 1 g với thời gian chiết 6,1 giờ. Kết luận: Quy trình chiết xuất ginsenosid với các thông số tối ưu và quy trình định lượng đồng thời ba ginsenosid trong sâm Hoa Kỳ có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm nhằm đảm bảo chất lượng các sản phẩm có chứa sâm. Từ khóa: ginsenosid, sâm Hoa Kỳ, mô hình Box-Behnken, Panax quinquefolius L. ABSTRACT OPTIMIZATION OF EXTRACTION AND DETERMINATION OF GINSENOSIDE RE, RG1 AND RB1 IN AMERICAN GINSENG (Panax quinquefolius L.) BY HPLC WITH PDA DETECTOR Nguyen Thanh Tuyen, Vu Hai Dang, Ngo Kien Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 108-115 Background - Objectives: American ginseng (Panax quinquefolius L.) is a precious medicinal plant in Panax genus, which has various benefits on nervous, circulatory, and immune system, There are many products from ginseng and ginseng extracts, however, the quality of these products is not consistent. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Ngô Kiến Đức ĐT: 0903055357 Email: ngokienduc@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 109 Therefore, the aim of this study was to optimize condition of extraction and develop a HPLC method for assay of Re, Rg1 and Rb1 to ensure quality and consistency of ginseng products. Method: Extraction conditions of ginsenosides was optimized using Box – Behnken design. A HPLC – PDA method for assay of Re, Rg1 and Rb1 was developed and validated according ICH 2005 guidelines. Results: The HPLC - PDA method for determination of ginsenoside Re, Rg1 and Rb1 was developed and validated. The method requirement of system suitability, specificity, linearity, high accuracy and precision. The effects of ethanol concentration, solvent/sample ratio and extraction time on extraction yield of ginsenosides was evaluated. The optimized condition for ginsenosides extraction was 69.4% ethanol, a ratio of 51.4 ml solvent to 1 g sample and an extraction time of 6.1 hours. Conclusion: The extraction process with optimized parameters and the method for simultaneous determination of three ginsenosides in American ginseng can be applied for quality control of ginseng products. Keywords: ginsenosides, American ginseng, Box-Behnken design, Panax quinquefolius L. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.), còn gọi là sâm Wisconsin là một loại dược liệu quý thuộc chi Sâm (Panax). Sâm Hoa Kỳ khác biệt với sâm Hàn Quốc về tỉ lệ các loại ginsenosid và do đó có những tác dụng sinh học tương đối khác nhau. Theo một số các nghiên cứu(6), sâm Hoa Kỳ có tác dụng trên nhiều hệ cơ quan khác nhau như hệ thần kinh, tim mạch, hô hấp, tiêu hóa, miễn dịch, có tác dụng tốt đối với các bệnh tiểu đường, ung thư. Ở Việt Nam trong những năm gần đây, sâm Hoa Kỳ ngày càng được nhiều người biết đến và sử dụng. Các sản phẩm từ sâm và cao chiết sâm ngày càng phong phú và đa dạng, tuy nhiên chất lượng của nhiều sản phẩm này vẫn chưa được kiểm soát. Để kiểm tra chất lượng của các chế phẩm sâm, người ta thường xác định hàm lượng hoạt chất ginsenosid trong sâm bằng kỹ thuật HPLC(7). Đề tài được thực hiện dựa trên nhu cầu thực tế là cần kiểm soát hàm lượng ginsenosid trong các sản phẩm từ sâm để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) Mẫu nghiên cứu Sâm Wisconsin (Panax quinquefolius L.) nhập khẩu bởi công ty CPĐT Thảo Dược Xanh. Chất đối chiếu, hóa chất và dung môi Chất đối chiếu ginsenosid Re, hàm lượng 94,28% tính trên nguyên trạng, số lô: GRe-001- 0913; ginsenosid Rg1, hàm lượng 96,43% tính trên nguyên trạng, số lô: GRg1.Ref.012011; ginsenosid Rb1, hàm lượng 99,17% tính trên nguyên trạng, số lô: GRb1.Ref.012011 do Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Dung môi dùng cho nghiên cứu bao gồm: ethanol 96% (Việt Nam), acetonitril và methanol (J.T.Baker, Mỹ). Trang thiết bị Cân phân tích Mettler Toledo XP26 (Mỹ); Cột sắc ký SunfireTM C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) (Mỹ); Hệ thống HPLC/PDA HP Series 1050 (Mỹ). Lựa chọn điều kiện phân tích Theo các nghiên cứu đã được công bố, để phân tích ginsenosid thì cột sắc ký thường sử dụng là cột pha đảo C18 với kích thước 150 - 250 x 4,6 mm, 3 - 5 μm; hệ dung môi là H2O – acetonitril; kiểu rửa giải gradient; bước sóng phát hiện là 203 nm. Đa số các phương pháp HPLC trong Dược điển Mỹ(5) và các nghiên cứu(1,5) đều có thời gian phân tích rất dài với chương trình gradient từ 60 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 110 phút trở lên, gây tốn kém thời gian, dung môi, không thích hợp cho việc khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất. Do đó, đề tài lựa chọn phương pháp của công ty Dionex (Mỹ) với thời gian phân tích tương đối ngắn là 25 phút, sau đó tiến hành khảo sát lại và điều chỉnh các thông số sắc ký cho phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở phòng thí nghiệm. Điều kiện sắc ký được đề nghị như sau: Cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) Pha động: A nước và B acetonitril Chương trình gradient: 0 – 3 phút pha động có tỉ lệ 70% A + 30% B, 3 – 8 phút A và B thay đổi tỉ lệ theo thởi gian để đến 8 phút pha động có tỉ lệ 60% A + 40% B, 8 – 15 phút A và B thay đổi tỉ lệ theo thởi gian để đến 15 phút pha động là 100% B, 15 – 20 phút pha động là 100% B, 20 – 21 phút A và B thay đổi tỉ lệ theo thởi gian để đến 21 phút pha động có tỉ lệ 70% A + 30% B, 21 – 27 phút pha động có tỉ lệ 70% A + 30% B. Bước sóng phát hiện: 203 nm Nhiệt độ cột: 50oC Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Thể tích tiêm mẫu 5 µl Chuẩn bị mẫu Dung dịch đối chiếu gốc: Cân chính xác 20,167 mg chất đối chiếu Rb1 cho vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 2 ml methanol, lắc cho tan hết, thêm methanol đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch đối chiếu gốc Rb1 nồng độ 4000 μg/ml. Tiến hành tương tự chất đối chiếu Re và chất đối chiếu Rg1 sẽ thu được các dung dịch đối chiếu gốc Re nồng độ 1600 μg/ml và Rg1 nồng độ 800 μg/ml. Dung dịch đối chiếu hỗn hợp: Hút chính xác lần lượt 1,25 ml; 1,25 ml và 0,625 ml các dung dịch đối chiếu gốc Rb1, Re và Rg1, cho vào bình định mức 5 ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch đối chiếu hỗn hợp Rb1, Re và Rg1 có nồng độ lần lượt là 1000 μg/ml, 400 μg/ml và 100 μg/ml. Dung dịch đối chiếu hỗn hợp được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiến hành sắc ký. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất Chiết hồi lưu 1 g bột sâm Hoa Kỳ với các điều kiện thay đổi về nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết. Thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid được thiết kế theo mô hình Box-Behnken(2) 3 yếu tố với 15 thí nghiệm. Các dịch chiết của từng thí nghiệm được xác định hàm lượng ginsenosid chiết được bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Kết quả của 15 thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm MODDE 5.0 để xác định mối tương quan giữa các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu, thời gian chiết với hiệu suất chiết ginsenosid; xây dựng phương trình bề mặt đáp ứng và dự đoán điều kiện cho hiệu suất tối ưu. Thẩm định quy trình phân tích Quy trình định lượng các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 được thẩm định theo hướng dẫn của ICH (2005)(3) về các yếu tố: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đúng và độ chính xác. KẾT QUẢ Tối ưu hóa hiệu suất chiết ginsenosid Thiết lập mô hình tối ưu hóa Thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid được thiết kế theo mô hình Box- Behnken 3 yếu tố với 15 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Khoảng khảo sát tối ưu của các yếu tố nồng độ ethanol (50-96%), tỉ lệ dung môi/dược liệu (30/1-70/1) và thời gian chiết (4-8 giờ) được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Kim và cộng sự (2007)(4), Dược điển Trung Quốc 2015(1) và Dược điển Mỹ 40(5). Kết quả các thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 111 Từ các kết quả trong bảng 1, sử dụng phần mềm MODDE 5.0 để phân tích sự ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết lên hàm lượng ginsenosid chiết được. Phương trình hồi quy của mô hình tìm được là: = -200,7277 + 3,6787C + 2,4264R + 28,0417T – 0,0268C2 – 0,0253R2 – 2,3240T2 + 0,0014CR – 0,0050CT + 0,0121RT Trong đó: là hàm lượng ginsenosid chiết được (mg/g); C là nồng độ ethanol (%); R là tỉ lệ dung môi/dược liệu; T là thời gian chiết (giờ) Bảng 1: Kết quả các thí nghiệm tối ưu hóa TT Mã thí nghiệm Nồng độ ethanol (%) Tỉ lệ dung môi/dược liệu Thời gian chiết (giờ) Hàm lượng ba ginsenosid (mg/g) 1 --0 50 30/1 6 54,92 2 +-0 96 30/1 6 42,90 3 -+0 50 70/1 6 55,74 4 ++0 96 70/1 6 46,42 5 -0- 50 50/1 4 53,83 6 +0- 96 50/1 4 47,05 7 -0+ 50 50/1 8 54,90 8 +0+ 96 50/1 8 47,43 9 0-- 70 30/1 4 52,71 10 0+- 70 70/1 4 55,21 11 0-+ 70 30/1 8 54,24 12 0++ 70 70/1 8 58,67 13 000 70 50/1 6 71,79 14 000 70 50/1 6 74,99 15 000 70 50/1 6 77,04 Bảng 2: Kết quả phân tích ANOVA của phương trình hồi quy Bậc tự do (df) Tổng bình phương (SS) Trung bình bình phương (MS) Giá trị F Giá trị P Mô hình (Model) 9 1471,47 163,496 35,8022 0,001 Số dư (Residual) 5 22,8333 4,567 Không phù hợp (Lack of fit) 3 8,83165 2,944 0,4205 0,759 Sai số thuần (Pure error) 2 14,0016 7,001 Tổng 14 1494,3 106,736 R2 = 0,985, R2 hiệu chỉnh = 0,957 Bảng 3: Kết quả phân tích ANOVA các hệ số trong phương trình hồi quy Hệ số Giá trị SC (Scaled & Centered) Sai số chuẩn Giá trị P Hằng số 74,2675 1,2486 0,0000 C -4,4488 0,7555 0,0020 R 1,4497 0,7587 0,1143 T 0,7901 0,7587 0,3454 C2 -14,1691 1,1358 0,0001 R2 -10,1033 1,1121 0,0003 T2 -9,2958 1,1121 0,0004 CR 0,6274 1,0640 0,5810 CT -0,2283 1,0640 0,8386 RT 0,4825 1,0685 0,6705 Hình 1: Đường biểu diễn dự đoán ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng ginsenosid chiết được Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 112 Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 5) cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê và có sự tương thích với thực nghiệm: giá trị P mô hình 0,05; R2 hiệu chỉnh = 0,957 ở độ tin cậy 95%. Ảnh hưởng của các yếu tố đối với hiệu suất chiết ginsenosid Dựa vào kết quả bảng 3, các giá trị của yếu tố nồng độ và giá trị bậc hai của cả ba yếu tố nồng độ, tỉ lệ, thời gian đều thể hiện mức độ ý nghĩa tin cậy cao (P < 0,05) khi tham gia vào mô hình. Như vậy, các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết ginsenosid (Hình 1). Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất Dựa trên phương trình hồi quy của mô hình, sử dụng công cụ tối ưu hóa (Optimizer) của phần mềm MODDE 5.0 cho phép xác định giá trị hàm lượng mong muốn và các giá trị tương ứng của các yếu tố. Kết quả giá trị hàm lượng tối đa tìm được là 74,7 mg/g khi chiết bằng ethanol 69,4% với tỉ lệ 51,4 ml/ 1 g trong 6,1 giờ. Điều kiện này tương đương với điều kiện của thí nghiệm trung tâm và giá trị hàm lượng dự đoán được cũng xấp xỉ với giá trị hàm lượng quan sát được từ các thí nghiệm trung tâm. Thẩm định phương pháp Tính phù hợp hệ thống Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu đối chiếu hỗn hợp (n=6) Ginsenosid Thời gian lưu TB RSD% của thời gian lưu Diện tích pic TB RSD% của diện tích pic (S) Hệ số bất đối (As) Số đĩa lý thuyết (N) Độ phân giải (Rs) Re 6,271 0,59 641,79205 0,87 0,91 10648 - Rg1 6,613 0,59 153,56691 1,45 0,81 12855 1,50 Rb1 12,786 0,22 1403,27914 0,27 0,89 174393 34,40 Nhận xét: RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại đều nhỏ hơn 2%. Hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000, độ phân giải lớn hơn hoặc bằng 1,5. Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng (methanol), mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn. Kết quả cho thấy mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian lưu của các ginsenosid, sắc ký đồ mẫu thử có 3 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 3 pic ginsenosid trong mẫu chuẩn. Các pic của ginsenosid tách hoàn toàn với các pic khác trong sắc ký đồ. Diện tích của các pic ginsenosid trong mẫu thử thêm chuẩn tăng lên so với các pic tương ứng trong mẫu thử. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic cho thấy các pic Re, Rg1 và Rb1 đạt độ tinh khiết pic (hệ số tinh khiết (purity factor) nằm trong ngưỡng giới hạn tính được (calculated threshold limit)). Như vậy, quy trình phân tích có tính đặc hiệu. Sắc ký đồ của các mẫu được minh họa ở hình 2, 3, 4 và 5. Tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác Tính tuyến tính Tiến hành pha 5 dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ khác nhau trong khoảng 20- 150% so với nồng độ trung bình mẫu thử. Tiến hành sắc ký từng dung dịch. Độ đúng Hút 900 μl dung dịch thử cho vào eppendorf 2 ml. Thêm một lượng xác định dung dịch chuẩn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 113 rồi thêm MeOH vừa đủ 1,5 ml sao cho nồng độ của mẫu thử pha chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính của 3 ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ trung bình của mẫu thử. Ở mỗi mức nồng độ, tiến hành định lượng 3 lần. Độ lặp lại Chuẩn bị 6 mẫu thử, tiến hành sắc ký từng mẫu trong cùng một ngày. Độ chính xác trung gian Chuẩn bị mẫu như độ lặp lại, tiến hành sắc ký 3 ngày khác nhau. Kết quả thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính từ 80 – 600 μg/ml đối với Re, từ 20 – 150 μg/ml đối với Rg1 và từ 200 – 1500 μg/ml đối với Rb1. Quy trình có tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng từ 88,3-109,8%. Quy trình có độ chính xác với RSD cùng ngày ≤ 1,9% và RSD khác ngày ≤ 3,1%. Hình 2: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thử Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 114 Hình 5: Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn Bảng 5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác Ginsenosid Re Rg1 Rb1 Phương trình hồi quy = 1,6228x = 1,5734x = 1,394x Khoảng tuyến tính (μg/ml) 80 – 600 20 – 150 200 – 1500 R2 0,9990 0,9981 0,9996 Độ đúng Tỷ lệ phục hồi 102,11-109,80% 88,30-109,61% 102,53-109,48% RSD%, n=9 2,73 8,16 2,01 Độ lặp lại Hàm lượng (mg/g) 19,63 2,63 50,58 RSD%, n=6 0,67 1,94 0,33 Độ chính xác trung gian Hàm lượng (mg/g) 19,96 2,65 52,07 RSD%, n=18 1,88 3,11 2,37 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Pha loãng dung dịch đối chiếu thành các nồng độ thấp dần. Tiến hành sắc ký và thiết lập tỷ số tín hiệu trên nhiễu S/N. Nồng độ mà tại đó có S/N lớn hơn và gần với 3 nhất là giới hạn phát hiện (LOD). Tương tự, nồng độ mà tại đó có S/N lớn hơn và gần với 10 nhất là giới hạn định lượng (LOQ). Kết quả thu được như sau: LOD của Re và Rg1 là 6 ppm, của Rb1 là 4 ppm; LOQ của Re và Rg1 là 16 ppm, của Rb1 là 14 ppm. Các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) được định lượng bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA được thẩm định theo hướng dẫn của ICH (2005): - Tính phù hợp hệ thống - Tính đặc hiệu - Tính tuyến tính với miền giá trị từ 20 - 150 μg/ml đối với Rg1, từ 80 - 600 μg/ml đối với Re và từ 200 - 1500 μg/ml đối với Rb1 - Giới hạn phát hiện: 6 ppm đối với Rg1 và Re, 4 ppm đối với Rb1 - Giới hạn định lượng: 16 ppm đối với Rg1 và Re, 14 ppm đối với Rb1 - Độ đúng với tỷ lệ phục hồi từ 88,3-109,8% - Độ chính xác với RSD cùng ngày ≤ 1,939% và RSD khác ngày ≤ 3,107% BÀN LUẬN Đề tài đã sử dụng phần mềm MODDE 5.0 với mô hình Box-Behnken để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid từ sâm Hoa Kỳ bằng cách khảo sát biến phụ thuộc là hàm lượng ba ginsenosid chiết được với các biến độc lập là nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết. Các kết quả trên cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất chiết ginsenosid, theo đó ethanol 70% cho hiệu suất chiết ginsenosid tăng đáng kể so với ethanol 50%. Điều này có thể do ethanol 70% có khả năng hòa tan tốt ginsenosid. Khi nồng độ ethanol tăng lên trên 70%, hiệu suất chiết giảm. Nguyên nhân là Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 115 protein trong dược liệu có thể bị đông tụ trong ethanol nồng độ cao, làm sức cản khuếch tán tăng lên. Tương tự, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết cũng có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết ginsenosid. Hiệu suất chiết tăng dần khi tỉ lệ tăng từ 30:1 lên 50:1, điều này phù hợp với nguyên lý chuyển khối do càng tăng lượng dung môi thì gradient nồng độ giữa khối dược liệu và khối chất lỏng càng lớn nên khả năng khuếch tán tăng. Khi tăng lượng dung môi lên hơn nữa thì hiệu suất lại giảm. Nguyên nhân cho vấn đề này chưa rõ, tuy nhiên cũng có nghiên cứu ghi nhận sự giảm hiệu suất chiết khi tăng lượng dung môi sử dụng đối với phương pháp chiết siêu âm. Hiệu suất chiết thay đổi theo thời gian chiết, cụ thể là hiệu suất chiết tăng khi thời gian chiết tăng từ 4 giờ đến 6 giờ và bắt đầu giảm dần sau 6 giờ. Nguyên nhân là do quá trình tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao có thể làm biến đổi một số ginsenosid như Rg1, Re, Rb1,dẫn đến hàm lượng tính theo các ginsenosid này bị giảm. Điều kiện chiết xuất tối ưu cho sâm Hoa Kỳ xác định được từ mô hình Box-Behnken là chiết bằng ethanol 69,43% với tỉ lệ 51,44: 1 trong 6,10 giờ. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Kim và cộng sự về các yếu tố ảnh hưởng đến việc chiết xuất ginsenosid từ rễ sâm Hàn Quốc. KẾT LUẬN Quy trình phân tích đã thiết lập có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác, có thể được ứng dụng để kiểm tra chất lượng của các sản phẩm sâm Hoa Kỳ trên thị trường. Đề tài đã xác lập được điều kiện tối ưu để chiết xuất hoạt chất ginsenosid trong sâm: sử dụng ethanol 69,4% với tỉ lệ 51,4 ml trên 1 g dược liệu và thời gian chiết là 6,1 giờ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chinese Pharmacopoeia Commission (2015). Chinese Pharmacopoeia of the People's Republic of China (Vol. 1), pp. 131-132. 2. Ferreira S, et al. (2007). Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods. Analytica Chimica Acta, 597(2): pp.179-186. 3. International Council on Harmonization (2005). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), pp. 125-154. 4. Kim S, et al. (2007). Parameters affecting the extraction of ginsenosides from the adventitious roots of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). Separation and Purification Technology, 56 (3): pp.401-406. 5. The United States Pharmacopoeial Convention (2017), USP 40-NF 35, pp. 6786-6790. 6. Vuksan V, et al. (2000). American Ginseng (Panax quinquefolius L) Reduces Postprandial Glycemia in Nondiabetic Subjects and Subjects With Type 2 Diabetes Mellitus. Archives of Internal Medicine, 160(7): pp.1009. 7. Wang Y, et al. (2015). Chemical analysis of Panax quinquefolius (North American ginseng): A review. Journal of Chromatography A, 1426: pp.1-15. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019