Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất sâm Việt Nam

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 242 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT SÂM VIỆT NAM Trần Thị Thu Vân*, Nguyễn Đức Hạnh**, Đỗ Quang Dương**, Nguyễn Minh Đức**,*** TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu mối liên quan nhân quả và tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) dựa trên hiệu suất chiết cao và hàm lượng các chất điểm chỉ ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), majonosid-R2 (M-R2) và ginsenosid-Rb1 (G-Rb1). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mười bốn thí nghiệm chiết xuất Sâm Việt Nam khô bằng phương pháp đun hồi lưu được thiết kế bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6 nhằm khảo sát ảnh hưởng của 3 biến độc lập (độ cồn, số lần chiết và tỷ lệ dung môi/dược liệu) trên 4 biến phụ thuộc (hiệu suất chiết cao, hàm lượng các chất điểm chỉ G-Rg1, M-R2 và G-Rb1). Hàm lượng G-Rg1, M-R2 và G-Rb1 trong các mẫu thử được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mối liên quan nhân quả giữa các biến độc lập và biến phụ thuộc được khảo sát, sử dụng phần mềm BCPharSoft OPT. Quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam tối ưu được xác định với yêu cầu hiệu suất chiết cao, hàm lượng các chất điểm chỉ G-Rg1, M- R2 và G-Rb1 đồng thời ở mức tối đa. Kết quả: Cả ba biến độc lập (số lần chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu và độ cồn) đều ảnh hưởng đến 4 biến phụ thuộc. Số lần chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu và độ cồn tối ưu của quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam lần lượt là 3, 13 và trung bình. Tại điều kiện chiết xuất tối ưu, hiệu suất chiết cao thu được là 56,25%, hàm lượng G-Rg1, M-R2 và G-Rb1 lần lượt là 6,80%, 11,01%, 2,06%. Kết luận: Đây là nghiên cứu đầu tiên khảo sát mối liên quan nhân quả và tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam, tạo tiền đề cho việc nâng cao chất lượng cao Sâm Việt Nam và các sản phẩm liên quan. Từ khóa: Panax vietnamensis, Sâm Việt Nam, quy trình chiết xuất, liên quan nhân quả. ABSTRACT OPTIMIZATION OF VIETNAMESE GINSENG EXTRACTION CONDITIONS Tran Thi Thu Van, Nguyen Duc Hanh, Do Quang Duong, Nguyen Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 ‐ No 2‐ 2019: 242‐248 Objectives: This study aimed at the cause-effect relations and optimization of Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) extraction process by heat reflux method based on the extraction yield and the contents of ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), majonosid-R2 (M-R2) and ginsenosid-Rb1 (G-Rb1). Materials and methods: 14 experiments were designed using Design-Expert 6.0.6 software to investigate the effects of three independent variables (extraction times, solvent/material ratios, ethanol concentrations) on 4 dependent variables (the extraction yield and the contents of G-Rg1, M-R2 and G-Rb1). G-Rg1, M-R2 and G-Rb1 contents were analyzed by using a validated HPLC method. The cause-effect relations between the independent and dependent variables were investigated and the optimized extraction process was determined using BCPharSoft OPT software. Results: All three independent variables (extraction times, solvent/material ratios and ethanol concentrations) were found to affect all dependent varibles (the extraction yield and the contents of G-Rg1, *Khoa Dược, Đại Học Lạc Hồng **Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh ***Khoa Dược, Đại Học Tôn Đức Thắng Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908988820 Email: nguyenminhduc@tdtu.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 243 M-R2 and G-Rb1). The optimized extraction times, material/solvent ratio and ethanol concentration of the extraction process were found to be 3, 13 and medium, respectively. Conclusion: This study reports for the first time the cause-effect relations and optimization of Vietnamese Ginseng extraction process which is important for producing its high quality extract and the related products. Key words: Panax vietnamensis, extraction process, cause-effect relations. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một cây thuốc quý, độc đáo và đặc hữu của Việt Nam, được phát hiện vào năm 1973(7). Các công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh Sâm Việt Nam (SVN) có thành phần saponin đặc trưng với hàm lượng saponin toàn phần khoảng 12‐15% (tính trên dược liệu khô), cao nhất trong các loài thuộc chi Panax đã được nghiên cứu trên thế giới với nhiều tác dụng dược lý và công dụng tương tự Nhân sâm (P. ginseng CA. Meyer)(6,7). Do vậy, giá trị kinh tế mà SVN mang lại là rất lớn. Nhằm thu được tối đa các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu, một trong những khâu quan trọng cần được đầu tư nghiên cứu là quy trình chiết xuất. Kỹ thuật chiết xuất cần phải linh hoạt, đơn giản, an toàn và hiệu quả về mặt kinh tế. Trong các nghiên cứu chiết xuất saponin từ dược liệu thuộc chi Panax, có nhiều phương pháp hiện đại cho hiệu quả tốt, tiết kiệm thời gian như chiết xuất có hỗ trợ vi sóng, chiết xuất bằng xung điện trường, chiết dưới áp suất cao, chiết bằng hệ thống tăng tốc dung môi(1,3,4,5). Tuy nhiên, những phương pháp này chưa thể áp dụng rộng rãi trong điều kiện thực tế sản xuất ở Việt Nam. Phương pháp chiết xuất hồi lưu là phương pháp phổ biến hiện đang được nhiều nhà máy đầu tư cho các dây chuyền sản xuất cao thuốc và các thuốc có nguồn gốc dược liệu. Việc xây dựng một quy trình chiết xuất tối ưu cho dược liệu nói chung và dược liệu quý như SVN nói riêng là một việc làm rất cấp thiết. Phần mềm thông minh có thể xây dựng các mối liên quan nhân quả từ các dữ liệu thực nghiệm và giúp tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu. Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chiết xuất SVN với sự hỗ trợ của các phần mềm thông minh sao cho hiệu suất chiết cao và hàm lượng các saponin quan tâm thu được đồng thời ở mức tối ưu. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu Thân rễ và rễ củ khô của SVN trồng (6 tuổi), chất đối chiếu ginsenosid‐Rb1 (hàm lượng 99,17%), ginsenosid‐Rg1 (hàm lượng 96,43%) và majonosid‐R2 (hàm lượng 98,86%) do Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Acetonitril, methanol và nước cất đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC. Phương pháp chiết xuất SVN Mẫu 3 g bột SVN (kích thước 0,5‐1,0 mm) được chiết xuất bằng phương pháp đun hồi lưu có khuấy trộn ở nhiệt độ 60 ± 2oC. Thời gian mỗi lần chiết là 3 giờ. Các thông số nồng độ ethanol, số lần chiết và tỷ lệ dung môi/dược liệu được thay đổi theo thiết kế. Toàn bộ dịch chiết các lần 1, lần 2 và lần 3 được gộp lại, cô cách thủy và sấy chân không để thu được cao khô. Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa 14 thí nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Design‐Expert 6.0.6 (Stat‐Ease Inc., Mỹ) theo mô hình D‐optimal với các mức và yêu cầu của 3 biến độc lập và 4 biến phụ thuộc được trình bày trong Bảng 1. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 244 Bảng 1: Ý nghĩa và các mức của các biến theo thiết kế D-optimal Biến độc lập Mức 1 Mức 2 Mức 3 X1: Độ cồn (%) Thấp Trung bình Cao X2: Số lần chiết 2 3 - X3: Tỷ lệ dung môi/dược liệu (ml/g) 10 25 45 Biến phụ thuộc Điều kiện ràng buộc Y1: Hàm lượng G-Rg1 trong cao (%) Tối đa Y2: Hàm lượng M-R2 trong cao (%) Tối đa Y3: Hàm lượng G-Rb1 trong cao (%) Tối đa Y4: Hiệu suất chiết cao (%) Tối đa Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình của 3 lần thử nghiệm. Sử dụng phần mềm BCPharSoft OPT (Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ) để nghiên cứu mối liên quan nhân quả và tối ưu hóa quy trình chiết xuất. Quy trình chiết xuất tối ưu được thực nghiệm kiểm chứng lặp lại 3 lần. Áp dụng trắc nghiệm t (one‐sample t test) để so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả dự đoán. Phương pháp xác định hiệu suất chiết cao Dịch chiết của các lần chiết được gộp chung, trộn đều và lọc thu được thể tích dịch chiết V (ml). Lấy 50 ml dịch lọc cô trên bếp cách thủy đến cắn khô. Cắn tiếp tục được sấy ở 105oC trong 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm trong thời gian 30 phút và xác định khối lượng cao m (g). Hiệu suất chiết cao Y4 (%) được xác định bằng phương trình sau: trong đó, M (g) là khối lượng SVN khô. Phương pháp định lượng đồng thời G-Rb1, G-Rg1 và M-R2 trong cao SVN bằng HPLC Các giá trị Y1, Y2, Y3 được xác định bằng phương pháp định lượng đồng thời G‐Rb1, G‐Rg1 và M‐R2 trong cao khô SVN thu được trong phương pháp xác định hiệu suất chiết cao. Cân chính xác khoảng 40 mg cao khô SVN, cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml methanol 70%, siêu âm 10 phút, để yên trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ 10 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC Agilent Infinity 1260 (Mỹ), đầu dò DAD. Cột Zorbax Eclipse Plus‐C18 (150 × 4,6 mm; 5 µm). Thể tích tiêm mẫu 20 µl. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Nhiệt độ cột 30oC. Bước sóng phát hiện 196 nm. Pha động bao gồm nước (A) và acetonitril (B) với chương trình rửa giải gradient của dung môi B: 0‐15 phút (19,5‐30%); 15‐35 phút (30‐40%); 35‐40 phút (40‐95%); 40‐55 phút (95%); 55‐56 phút (95‐19,5%); 56‐66 phút (19,5%). KẾT QUẢ Phương pháp định lượng đồng thời G-Rb1, G-Rg1 và M-R2 trong cao SVN bằng HPLC Quy trình định lượng đồng thời G‐Rb1, G‐Rg1 và M‐R2 trong cao SVN bằng HPLC đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH, đạt yêu cầu của một phương pháp phân tích (tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng) với sắc ký đồ HPLC được trình bày trong Hình 1. 10 20 30 mAU 0 100 200 300 M-R2 G-Rg1 G-Rb1 Hình 1: Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời G-Rg1 (Rt =10,12 phút), M-R2 (Rt =16,02 phút) và G-Rb1 (Rt =22,15 phút) trong cao SVN Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 245 Mô hình thực nghiệm, tương quan hồi quy của biến độc lập và biến phụ thuộc Bảng 2: Kết quả thực nghiệm theo mô hình D-Optimal Thí nghiệm Biến độc lập Biến phụ thuộc x1 x2 x3 y1 y2 y3 y4 1 Thấp 2 25 6,8132 10,9642 2,0043 56,7481 2 Trung bình 2 40 6,7026 11,2211 2,0420 55,4320 3 Trung bình 3 40 6,6102 10,7700 1,9906 57,2433 4 Cao 2 40 7,1590 12,3712 2,1789 52,0320 5 Cao 3 40 7,0805 11,5822 2,1265 53,0378 6 Trung bình 3 10 6,9583 11,5507 2,0730 53,3018 7 Thấp 2 40 6,7208 11,2202 2,0226 56,5129 8 Thấp 2 10 6,8629 10,9421 2,0382 55,0954 9 Trung bình 2 25 7,0121 11,5313 2,1510 53,0406 10 Thấp 3 10 6,4946 10,4128 1,9652 58,1668 11 Trung bình 2 10 6,8377 11,1164 2,0414 54,4321 12 Thấp 3 25 6,6508 10,0965 1,9950 58,0160 13 Cao 3 25 7,1427 11,3884 2,1615 52,2532 14 Cao 3 10 7,5178 12,2663 2,2331 50,1850 Ghi chú: Y = giá trị trung bình ± SD Dữ liệu 14 thử nghiệm (Bảng 2) được chọn làm đầu vào cho phần mềm BCPharSoft OPT để khảo sát liên quan nhân quả và tối ưu hóa quy trình chiết xuất SVN. Mô hình hóa Điều kiện: ‐ Nhóm thử (Y1(3,5), Y2(5,10), Y3(3,4), Y4(4,12)) ‐ Thuật toán: Back Propagation Learning Kết quả tương quan hồi quy của phương pháp tối ưu hóa thể hiện mức độ liên quan nhân quả được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3: Đánh giá các mô hình nhân quả đối với quy trình chiết xuất cao SVN Biến phụ thuộc Y1 Y2 Y3 Y4 R 2 luyện 0,98 0,98 0,99 1,00 R 2 thử 0,98 0,99 0,98 0,98 Các giá trị R2 luyện và R2 thử từ 0,98 – 1,00 nên mô hình dự đoán được xây dựng từ phần mềm BCPharSoft OPT là rất tốt. Mô hình này có thể được sử dụng làm cơ sở để khảo sát liên quan nhân‐quả, tối ưu hóa và dự đoán các biến phụ thuộc. Tối ưu hóa Điều kiện: ‐ Ràng buộc (đối với Xi): số nguyên dương ‐ Hàm mục tiêu (đối với Yi): Y1, Y2, Y3 và Y4 yêu cầu tối đa Quy luật nhân quả liên quan Kết quả từ biểu đồ 3D cho thấy mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát trên tính chất sản phẩm. Qua đó, một số quy luật được rút ra như sau: Đối với hàm lượng G‐Rg1 (Y1): Nếu X1 (nồng độ ethanol) tăng thì Y1 tăng; nếu X1 cao và X3 cao thì Y1 trung bình; nếu X2 = 2 và X3 trung bình thì Y1 cao; X2 = 2 và X3 cao hoặc thấp thì Y1 trung bình; nếu X2 = 3 thì Y1 thấp (Hình 2). Đối với hàm lượng M‐R2 (Y2): Nếu X1 tăng thì Y2 tăng; nếu X2 = 2 thì Y2 cao; nếu X2 = 3 thì Y2 thấp (Hình 3). Đối với hàm lượng G‐Rb1 (Y3): Nếu X1 tăng thì Y3 tăng; nếu X1 cao và X3 cao thì Y3 trung bình; nếu X3 trung bình thì Y3 cao; nếu X3 cao hoặc thấp thì Y3 thấp (Hình 4). Đối với hiệu suất chiết (Y4): Nếu X1 tăng thì Y4 giảm; nếu X2 = 2 và X3 trung bình thì Y4 thấp; nếu X2 = 3 và X3 trung bình hay cao thì Y4 cao (Hình 5). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 246 Hình 2: Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng G-Rg1 (Y1) Hình 3: Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng M-R2 (Y2) Hình 4: Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng G-Rb1 (Y3) Hình 5: Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hiệu suất chiết cao (Y4) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 247 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Điều kiện chiết xuất tối ưu và giá trị dự đoán các biến Y bởi phần mềm BCPharSoft OPT được trình bày ở Bảng 4. Bảng 4: Điều kiện chiết xuất tối ưu và giá trị dự đoán các biến Y Biến số Kết quả tối ưu Giá trị dự đoán X1 X2 X3 Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) Giá trị Trung bình 3 13 6,675 10,880 2,034 56,368 Thực hiện lặp lại 3 lần quy trình chiết xuất tối ưu. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0 để so sánh kết quả thực nghiệm và kết quả dự đoán. Kết quả thống kê được trình bày ở Bảng 5. Bảng 5: So sánh kết quả dự đoán và thực nghiệm kiểm chứng (n=3) Kết quả Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) Thực nghiệm 6,80 ± 0,11 11,01 ± 0,08 2,06 ± 0,04 56,25 ± 1,05 Dự đoán 6,675 10,880 2,034 56,368 Trắc nghiệm t (Bảng 5) cho thấy kết quả dự đoán và kết quả kiểm chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, kết quả thực nghiệm chứng điều kiện chiết xuất tối ưu phù hợp với kết quả dự đoán bởi phần mềm BCPharSoft OPT. BÀN LUẬN Phương pháp chiết hồi lưu có khuấy trộn (thiết bị chiết đa năng) được áp dụng nhiều trên công nghiệp vì tính hiệu quả, nhanh chóng, ít tiêu thụ dung môi hơn. Giá thành các thiết bị công nghiệp cũng không quá đắt. Các saponin khá bền trong điều kiện nhiệt độ chiết xuất nóng hồi lưu nên phương pháp này khả thi trong điều kiện sản xuất ở Việt Nam. Xem xét mối quan hệ giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc trên biểu đồ 3D cho thấy ảnh hưởng của nồng độ ethanol trên hiệu suất chiết và hàm lượng của các saponin khảo sát là đáng kể. Khi tăng nồng độ ethanol hiệu suất chiết giảm dần, trong khi hàm lượng các saponin lại tăng lên. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Kwon J. H. và cộng sự (2003), kết quả cho thấy hiệu suất chiết ginsenosid tối ưu ở nồng độ ethanol 45‐60% và hàm lượng saponin toàn phần cao nhất ở nồng độ 60‐75%; hay báo cáo của Kim SJ và cộng sự (2007) rằng hiệu suất chiết cao Nhân Sâm đạt tối ưu khi chiết bằng nước và ethanol 70% cho hàm lượng ginsenosid tăng lên đáng kể(2,4). Bởi vì ở nồng độ ethanol thấp các tạp chất phân cực như chất nhầy, tinh bột, đường,...dễ dàng di chuyển ra khỏi dược liệu, làm gia tăng khối lượng dịch chiết, dẫn đến làm tăng hiệu suất chiết. Khi tăng nồng độ ethanol, khả năng hòa tan chọn lọc của dung môi cũng tăng, nên hàm lượng các saponin (độ phân cực trung bình) cũng tăng lên. Thực nghiệm cũng cho thấy ở nồng độ ethanol cao, hàm lượng ginsenosid tăng lên đáng kể và hiệu suất chiết thấp hơn ở các nồng độ thấp và trung bình. Do đó, để cân bằng giữa hiệu suất chiết và chất lượng cao chiết, quy trình chiết xuất tối ưu xây dựng từ phần mềm là phù hợp. Các kết quả thực nghiệm kiểm chứng có tính lặp lại và phù hợp với kết quả dự đoán từ phầm mềm BCPharSoft OPT. KẾT LUẬN Thông số tối ưu của quy trình chiết xuất SVN được xác định ở nồng độ ethanol là trung bình, số lần chiết là 3 và tỷ lệ dung môi/dược liệu là 13 và quy trình chiết xuất đạt tối ưu đồng thời về hiệu suất chiết (56,25%) và hàm lượng các saponin chính khảo sát (hàm lượng G‐Rg1, M‐R2 và G‐Rb1 lần lượt là 6,80%, 11,01% và 2,06%). Quy trình chiết xuất tối ưu đạt được đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu suất và chất lượng dịch chiết, nâng cao chất lượng cao SVN thu được. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 248 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hou J, He S, Ling M, Li W, Dong R, Pan Y, Zheng Y (2010), “A method of extracting ginsenosides from Panax ginseng by pulsed electric field”, J Sep Sci, 33(17‐18), pp.2707‐2713. 2. Kim SJ, Murthy HN, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2007), “Parameters affecting the extraction of ginsenosides from the adventitious roots of ginseng (Panax ginseng CA Meyer)”, Sep Purif Technol, 56(3), pp.401‐406. 3. Kwon JH, Bélanger JM, Paré JJ (2003), “Optimization of microwave‐assisted extraction (MAP) for ginseng components by response surface methodology”, J Agric Food Chem, 51(7), pp.1807‐1810. 4. Kwon JH, Lee GD, Bélanger JM, Jocelyn Paré JR (2003), “Effect of ethanol concentration on the efficiency of extraction of ginseng saponins when using a microwave‐assisted process (MAP™)”, Int J Food Sci Technol, 38(5), pp.615‐622. 5. Lee HS, Lee HJ, Yu HJ, Ju DW, Kim Y, Kim CT (2011), “A comparison between high hydrostatic pressure extraction and heat extraction of ginsenosides from ginseng (Panax ginseng CA Meyer)”, J Sci Food Agric, 91(8), pp.1466‐1473. 6. Nguyễn Thượng Dong (2003),“Nghiên cứu phát triển cây Sâm Việt Nam”, Dược liệu, 8(2), pp.59‐60. 7. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc thuộc họ Nhân sâm, Nhà xuất bản khoa học Kỹ thuật, Hà Nội. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019