Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin d aspartic protease của loài giun móc truyền lây ancylostoma ceylanicum

Vietnam J. Agri. Sci. 2019, Vol. 17, No. 3: 196-203 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2019, 17(3): 196-203 www.vnua.edu.vn 196 TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE TRONG PHÂN ĐOẠN GEN MÃ HĨA ENZYME CATHEPSIN D ASPARTIC PROTEASE CỦA LỒI GIUN MĨC TRUYỀN LÂY Ancylostoma ceylanicum Dương Đức Hiếu1*, Bùi Khánh Linh1, Nguyễn Thu Hương2, Lê Đức Vĩnh3, Nguyễn Thị Hồng Yến1, Nguyễn Thị Hồng Chiên1, Nguyễn Văn Phương1 1Khoa Thú y, Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam 2Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Cơn trùng TW 3Đại học Y Dược Phạm Ngọc Thạch *Tác giả liên hệ: ddhieu@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 02.04.2019 Ngày chấp nhận đăng: 01.06.2019 TĨM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định sự tồn tại của lồi giun mĩc chĩ truyền lây Ancylostoma ceylanicum trên người tại Việt Nam, đồng thời phân tích đặc điểm đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hĩa enzyme cathepsin D aspartic protease của A.ceylanicum, một trong những loại enzyme thủy phân đĩng vai trị quan trọng trong vịng đời phát triển của giun mĩc (Williamson et al., 2004). Bằng phương pháp KOD-PCR, sự tồn tại của lồi giun mĩc chĩ truyền lây Ancylostoma ceylanicum trên người và chĩ tại Việt Nam được khẳng định. Kết quả so sánh các trình tự phân đoạn gen mã hĩa enzyme cathepsin D aspartic protease của A.ceylanicum cho thấy xuất hiện nhiều đột biến điểm tại vùng Exon 7, 8, 9. Đặc biệt, 3 đột biến điểm khơng đồng nghĩa (1 điểm đột biến trên vùng exon 7 và 2 điểm đột biến trên vùng exon 9) được xác định gây ra sự thay đổi về trình tự axitamin của aspartyl protease. Kết quả nghiên cứu về tính đa hình đơn nucleotide trên vùng gen mục tiêu này của chúng tơi là cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại vacxin phịng bệnh giun mĩc hiệu quả sử dụng kháng nguyên cathepsin D aspartic protease tái tổ hợp. Từ khĩa: Ancylostoma ceylanicum, tính đa hình đơn nucleotide, cathepsin D aspartic protease. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in the Gene Segment Coding for Cathepsin D Aspartic Protease of Zoonotic Hookworm Ancylostoma ceylanicum ABSTRACT This study was conducted to determine the presence of the canine zoonotic hookworm species, Ancylostoma ceylanicum, in humans in Vietnam and to analyze the single nucleotide polymorphism in the gene segment encoding A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease, one of the hydrolytic enzymes with an important role in the life cycle of hookworm. The existence of Ancylostoma ceylanicum in dogs and humans in Vietnam was confirmed by KOD-PCR. Comparative analysis of tthe sequences encoding A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease revealed, some mutations in exon 7, 8, and 9. Three SNPs non-synonymous mutations (one from exon 7 and two from exon 9) caused the changes in amino acid sequences of aspatyl protease. Our results can be considered for futher studies on the development of effective vaccine against hookworm disease using recombinant cathepsin D aspartic protease as an antigen. Keywords: Ancylostoma ceylanicum, single nucleotide polymorphisms, cathepsin D aspartic protease. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh giun mĩc là một trong những căn bệnh truyền lây được Tổ chức Y tế thế giới WHO xếp vào danh mục những căn bệnh bị lãng quên tại vùng nhiệt đới, ước tính trên 700 triệu người tại các quốc gia đang phát triển bị nhiễm căn bệnh này (Hotez et al., 2004). Đặc biệt, Ancylostoma ceylanicum, lồi giun mĩc chĩ duy nhất cĩ khả năng lây nhiễm và phát Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương 197 triển thành dạng trưởng thành ở cơ thể người, đã được ghi nhận với tỷ lệ nhiễm cao trên chĩ và người tại khu vực Đơng Nam Á (Traub et al., 2008; Ngui et al., 2012a; Ngui et al., 2012b; Conlan et al., 2012; Inpankaew et al., 2014), trong đĩ cĩ Việt Nam (Dinh et al., 2015; Duong et al., 2018). Giun mĩc ký sinh trong ruột vật chủ, lấy chất dinh dưỡng từ việc hút máu, ly giải hồng cầu, phân hủy huyết sắc tố Hemoglobin (Hb) và các loại protein khác bằng con đường thủy phân protein (Williamson et al., 2004). Mebendazole và albendazole là những loại thuốc được sử dụng phổ biến trong việc tẩy giun. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra tính kháng thuốc trên nhĩm giun truyền qua đất, trong đĩ cĩ lồi giun mĩc Necator americanus, do liên quan đến đột biến điểm di truyền (Ambrose et al., 2018). Do vậy, việc phát triển các loại thuốc tẩy giun mới, cũng như vacxin được coi là cần thiết trong việc phịng chống căn bệnh này. Cathepsin D aspartic protease (aspartyl protease) là một trong những loại enzyme thủy phân đĩng vai trị quan trọng trong việc phân hủy huyết sắc tố trong quá trình tiêu hĩa của giun mĩc trưởng thành (Williamson et al., 2002; Williamson et al., 2003a), cũng như phân hủy mơ của vật chủ trong quá trình xâm nhập và di hành của ấu trùng (Brown et al., 1999; Williamson et al., 2003b; Jolodar et al., 2004). Do đĩng vai trị quan trọng trong sự tồn tại và phát triển của giun mĩc ở cơ thể vật chủ, aspartyl protease được nhiều nghiên cứu đánh giá cao về tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển vacxin phịng bệnh giun mĩc (Loukas et al., 2005). Việc đánh giá tính đa hình đơn nucleotide (SNPs) là cần thiết, đặc biệt là những đột biến điểm khơng đồng nghĩa (non- synonymous SNPs) dẫn đến sự sai khác trong trình tự axit-amin cĩ thể làm thay đổi cấu trúc, chức năng của protein và ảnh hưởng tới hiệu quả của vacxin phịng bệnh. Trong nghiên cứu bước đầu này, phân đoạn gen (vùng Exon 7- Exon 8- Exon 9) mã hĩa aspartyl protease của lồi giun mĩc truyền lây A.ceylanicum được giải trình tự và phân tích tính đa hình đơn nucleotide. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mẫu và nguồn gốc mẫu Mẫu phân chĩ thu thập ngẫu nhiên tại các hộ nuơi chĩ tại Hà Nội và Bắc Ninh được chuyển về Phịng thí nghiệm Ký sinh trùng - Bộ mơn Ký sinh trùng, Khoa Thú y, Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam để xét nghiệm. Mẫu ấu trùng giun mĩc người thu từ các bệnh nhân dương tính với trứng giun mĩc được cung cấp bởi Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Cơn trùng TW (NIMPE). 2.2. Phương pháp phù nổi Fullerborn 5 gram mẫu phân chĩ được cho vào cốc sạch chứa khoảng 50-60 mL dung dịch nước muối bão hịa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc dung dịch qua lưới lọc và chuyển dung dịch sang ống fancol 15 cho đầy, đặt phiến kính lên. Sau 15-20 phút trứng giun sẽ nổi lên bám vào phiến kính, lấy ra và soi dưới kính hiển vi quang học (x10) xác định trứng giun mĩc theo khĩa định danh Bowman, 2009. 2.3. Phương pháp nuơi ấu trùng trên thạch agar Khoảng 5 gram mẫu phân chĩ dương tính với trứng giun mĩc được chuyển lên bề mặt đĩa thạch agar (2%). Trứng giun mĩc được nuơi trong tủ ấm 27C và kiểm tra hàng ngày. Sau khoảng 2-3 ngày nuơi cấy, ấu trùng giun mĩc được thu và bảo quản trong dung dịch cồn 70. 2.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Từng ấu trung giun mĩc riêng rẽ được rửa sạch bằng dung dịch PBS-Tween20 (0,1%) và chuyển vào ống Eppendorf chứa dung dịch đệm lysis gồm Direct PCR Lysis Reagent (Tail) (VIAGEN Biotech, Canada), 1 M Dithiothreitol và Proteinase K (QIAGEN, Hà Lan). Ủ hỗn hợp lysis trong 20 phút ở 60C, 10 phút ở 95C. DNA tổng số của ấu trùng giun mĩc được bảo quản trong tủ âm (-20C) đến khi dùng. 2.5. Phương pháp KOD-PCR nhân vùng gen mt cox1 và phân đoạn gen aspartyl protease Cặp mồi HPo1: 5`-TTACGTAGAAGGTCAA TTTCTTTGG-3` và HPo2: 5`- CTACTTAACCTA Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hĩa enzyme cathepsin D aspartic protease của lồi giun mĩc truyền lây Ancylostoma ceylanicum 198 TACTCCGGCCTTC-3` được thiết kế dựa trên trình tự gen ty thể của A. ceylanicum AP017674.1 (NCBI) nhằm nhân phân đoạn gen mt cox1 (983 bp). Phản ứng KOD- PCR được thực hiện sử dụng KOD Fx Neo polymerase với chu kỳ nhiệt như sau: 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ lặp lại (94C - 10 giây, 63C - 30 giây, 68C - 1 phút), 68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR được kiểm tra sử dụng mạch khuơn DNA của các lồi giun mĩc A. caninum, A. ceylanicum và N. americanus làm đối chứng. Căn cứ vào trình tự genome của A. ceylanicum JARK01001578.1 (NCBI), cặp mồi AceyAP3F: 5`-GGTGTTCGCTTTCTGGCTCA-3` và AceyAP3R: 5`-GGTCAATACGTAATCTTCAC CCTTG-3` được thiết kế phủ vùng mã hĩa Exon 7, 8, 9 của aspartyl protease gen. PCR master mix trong 25 ul phản ứng gồm 12,5 ul dung dịch đệm 2x KOD Fx PCR, 5 ul 2 mM dNTP, 0,5 ul KOD Fx Neo polymerase, 0,75 ul 10 uM mồi xuơi và ngược, 1ul mạch khuơn DNA và nước cất tinh sạch. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: khởi đầu 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ lặp lại (biến tính 98C -10 giây, gắn mồi ở 63C - 30 giây, kéo dài ở 68C - 45 giây), kết thúc kéo dài 68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên thạch agarose 1,5% chứa GelRed (Wako, Nhật Bản) trong 30 phút ở 100V trong dung dịch đệm 1X TAE. 2.6. Phương pháp TA cloning Sản phẩm PCR của phản ứng nhân phân đoạn gen aspartyl protease được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN, Hà Lan) và được gắn với plasmid pCR 2.1-TOPO bằng TOPO TA Cloning kits (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Sau đĩ, vector tách dịng gen được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và được nuơi trong mơi trường SOC trong tủ ấm lắc 37C. Sau 1 giờ nuơi cấy, tế bào E.coli được cấy chuyển trên bề mặt thạch LB chứa Amplicilin (50 ug/mL) và chất chỉ thị màu X-Gal, nuơi trong tủ ấm 37C trong 12 giờ. Kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc, chọn lọc các khuẩn dương tính (màu trắng) và tiến hành phản ứng Colony PCR sử dụng cặp mồi AceyAP3F và AceyAP3R. Ghi chú: M: thang chuẩn DNA; giếng 1,2: mẫu ấu trùng giun mĩc từ chĩ; giếng 3,4: mẫu ấu trùng giun mĩc từ người Hình 1. (A) Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR sử dụng cặp mồi HPo1 và HPo2 nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 nhằm sàng lọc lồi giun mĩc A.ceylanicum; (B) Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 của A.ceylanicum trên gel Agarose 1,5% Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương 199 2.7. Phương pháp Sequencing PCR và giải trình tự gen Sản phẩm Colony PCR sau khi tinh sạch được sử dụng là mạch khuơn cho phản ứng Sequencing PCR bằng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng Sequencing PCR như sau: ủ 96C trong 1 phút, 25 chu kỳ lặp lại (biến tính 96C - 10 giây, gắn mồi ở 50C - 5 giây, kéo dài ở 60C - 4 phút) và giữ sản phẩm ở 4C. Sản phẩm Sequencing PCR được tinh sạch bằng hạt từ tính - Magnetic Bead Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Mỹ) và chuyển vào đĩa PCR 96 giếng. Trình tự gen được giải mã sử dụng phương pháp Sanger Sequencing bằng hệ thống máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). 2.8. Xử lý số liệu Tồn bộ kết quả trình tự gen được xử lý, phân tích và so sánh bằng phần mềm 4Peak và MEGA7, đồng thời sử dụng hệ thống dữ liệu về trình tự gen, trình tự protein từ NCBI để tham khảo. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR và kết quả sàng lọc lồi giun mĩc truyền lây Ancylostoma ceylanicum thu tại Việt Nam Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR phân biệt lồi giun mĩc truyền lây A. ceylanicum được kiểm tra bằng các mẫu DNA đối chứng được tách chiết từ giun mĩc trưởng thành của các lồi A. caninum, A. ceylanicum và N. americanus đã được định lồi bằng hình thái học. Kết quả thể hiện ở hình 1A cho thấy với mẫu A.ceylanicum chỉ cho 1 dải băng duy nhất cĩ kích thước như dự đốn ở vị trí 983bp, với mẫu A.caninum thu được nhiều dải băng khơng đặc hiệu và khơng cĩ kết quả dương tính nào với mẫu N. americanus. Như vậy, phản ứng KOD- PCR sử dụng cặp mồi HPo1 và HPo2 đảm bảo tính đặc hiệu khi phân loại lồi giun mĩc A.ceylanicum. Kết quả phân lập ấu trùng giun mĩc truyền lây A.ceylanicum từ chĩ và người bằng KOD- PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 (983bp) được thể hiện ở hình 1B. Kết quả điện di cho thấy một dải băng sáng rõ nét duy nhất ở mỗi làn chạy cĩ kích thước 983bp. Như vậy, trong các mẫu ấu trùng giun mĩc thu được từ chĩ và người, chúng tơi đều phát hiện sự tồn tại và phân lập thành cơng lồi giun mĩc chĩ truyền lây A.ceylanicum trên cả 2 vật chủ (người và chĩ). 3.2. Tách dịng gen aspartyl protease của Ancylostoma ceylanicum bằng vector tách dịng TA cloning Với các mẫu DNA tổng số của ấu trùng giun mĩc A.ceylanicum sau khi định danh bằng phản ứng KOD-PCR, chúng tơi tiếp tục sử dụng làm mạch khuơn nhằm nhân phân đoạn gen aspartic protease mục tiêu cĩ kích thước khoảng 810 bp (Hình 2). Sau khi tinh sạch, 17 sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của A.ceylanicum phân lập từ 11 mẫu ấu trùng giun mĩc từ chĩ và 6 mẫu từ người được lựa chọn gắn với vector tách dịng TOPO- TA cloning và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Ít nhất 12 khuẩn lạc dương tính (màu trắng) của từng mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên (Hình 3A), kiểm tra bằng Colony PCR (Hình 3B) và tiến hành giải trình tự gen. 3.3. Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của Ancylostoma ceylanicum Sau khi phân tích kết quả giải trình tự gen và BLAST trên NCBI, chúng tơi xác định được 22 điểm SNPs trên phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của lồi giun mĩc chĩ truyền lây A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, số lượng SNPs ở vùng Exon 8 là nhiều nhất, tuy nhiên các đột biến điểm này đều là đột biến điểm đồng nghĩa và khơng hề ảnh hưởng tới sự sai khác về trình tự axit-amin của aspartic protease. Trong khi đĩ, 3 đột biến điểm (1 SNP tại vùng Exon 7 và 2 Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hĩa enzyme cathepsin D aspartic protease của lồi giun mĩc truyền lây Ancylostoma ceylanicum 200 SNPs tại vùng Exon 9) đều dẫn đến sự thay đổi về axit amin. Cụ thể, codon ACA mã hĩa Threonine tại vùng Exon 7 chuyển thành bộ ba ATA mã hĩa Isoleucine (Hình 4). Tại vùng Exon 9, CTC mã hĩa Leucine thành CCC mã hĩa Proline và CCT mã hĩa Proline chuyển thành TCT mã hĩa Serine (Hình 5). Tính đa hình đơn SNPs trên một số vùng gen chức năng khác của lồi giun mĩc cũng đã được nghiên cứu như beta-tubulin gen mã hĩa protein beta-tubulin, một loại protein quan trọng tham gia vào quá trình phân chia tế bào. Cơ chế của các loại thuốc tẩy giun phổ biến như albendazole hay mebendazole là kìm hãm quá trình hình thành thoi vơ sắc từ beta-tubulin trong thời kỳ phân bào, do vậy tiêu diệt được giun mĩc (Kwa et al., 1993; Kwa et al., 1994). Tuy nhiên, các đột biến điểm ở vị trí F167Y hoặc F200Y trên vùng gen mã hĩa beta-tubulin trên lồi giun mĩc Necator americanus được xác định là marker chỉ thị cho sự kháng thuốc tẩy giun. Sự tồn tại những đột biến điểm này trong kiểu gen của giun mĩc đã được ghi nhận ở Ghana (Ambrose et al., 2018), Bzazil (Furtado et al., 2014) và Kenya (Diawara et al., 2013). Một nghiên cứu của Barry et al. (2006) về phân tích tính đa dạng trong kiểu gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum cũng đã chỉ ra nhiều điểm SNPs trên bề mặt cấu trúc của protein này và cĩ thể liên quan đến sự thay đổi vai trị đặc tính của enzyme. Thí nghiệm trên chuột cho thấy, kháng thể kháng enzyme aspartyl protease cĩ thể làm giảm 16-26% số lượng ấu trùng L3 xâm nhập và di hành qua da chuột (Williamson et al., 2003b). Theo Loukas et al. (2005), vắc xin chế tạo từ protein aspatyl protease tái tổ hợp sử dụng thử nghiệm đã làm giảm số lượng giun mĩc trong ruột chĩ và giảm số lượng trứng bài thải ra mơi trường so với nhĩm đối chứng, đồng thời làm giảm mất máu và các biến đổi bệnh tích ở ruột của chĩ. Tuy nhiên, những nghiên cứu trong và ngồi nước về tính đa hình trong kiểu gen cathepsin D aspartic protease của giun mĩc, về đột biến điểm liên quan đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng của loại enzyme đĩ, về ảnh hưởng của sự thay đổi này đến hiệu quả của vắc xin phịng bệnh cịn rất hạn chế. Ghi chú: M: thang chuẩn DNA Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của A.ceylanicum trên gel Agarose 1,5% Bảng 1. Số lượng đột biến điểm (SNPs), đột biến điểm đồng nghĩa và đột biến điểm khơng đồng nghĩa phát hiện trên vùng Exon 7, Exon 8 và Exon 9 của phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của A.ceylanicum Exon 7 Exon 8 Exon 9 SNPs: 7 11 4 Đột biến điểm đồng nghĩa (synonymous SNPs) 6 11 2 Đột biến điểm khơng đồng nghĩa (non-synonymous SNPs) 1 2 Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương 201 Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc của E.coli DH5α sau khi nuơi cấy trên thạch LB chứa Amplicilin và X-Gal (A) và kết quả Colony PCR (B). M: thang chuẩn DNA Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum khơng chứa đột biến điểm tại vùng Exon 7, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm tại vùng Exon 7 Hình 4. Vị trí đột biến điểm khơng đồng nghĩa tại vùng Exon 7 của phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI 4. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã xác định sự tồn tại của lồi giun mĩc truyền lây A. ceylanicum trên cả hai đối tượng vật chủ là người và chĩ ở Việt Nam dựa trên kết quả KOD- PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1. Căn cứ vào kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen mã hĩa cathepsin D aspartic protease của lồi A.ceylanicum, một trong những enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân hemoglobulin và các loại protein trong đường tiêu hĩa của giun mĩc, tính đa hình đơn nucleotide được phân tích và xác định được 3 điểm SNPs khơng đồng nghĩa làm thay đổi trình tự axitamin của enzyme thủy phân này tại vùng Exon 7 và Exon 9, cụ thể ở các vị trí ACA811ATA Thr265IIE, CTC1030CCC Leu338Pro và CCT1036TCT Pro340Ser căn cứ theo trình tự tham khảo AY181028.1 và AAO22152.1 từ NCBI. Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hĩa enzyme cathepsin D aspartic protease của lồi giun mĩc truyền lây Ancylostoma ceylanicum 202 Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum khơng chứa đột biến điểm tại vùng Exon 9, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm tại vùng Exon 9 Hình 5. Các vị trí đột biến điểm khơng đồng nghĩa tại vùng Exon 9 của phân đoạn gen mã hĩa enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI TÀI LIỆU THAM KHẢO Ambrose R.O., Josephine E.Q., Peter S., Santosh G., Lisa M.H., Fabio P.D., Benjamin E., Adalgisa C., Debbie H., Michael D.W. & Michael C. (2018). Genetic markers of benzimidazole resistance among human hookworms (Necator americanus) in Kintampo North Municipality, Ghana. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. https://doi.org/10.4269/ajtmh.18-0727. Barry A.E., Leliwa-Sytek A., Man K., Kasper J.M., Hartl D.L. & Day K.P. (2006). Variable SNP density in aspartyl-protease genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Gene. 376(2): 163-73. Brown A., Girod N., Billett E.E. & Pritchard D.I. (1999). Necator americanus (human hookworm) aspartyl proteinases and digestion of skin macromolecules during skin penetration. Am J Trop Med Hyg. 60: 840-847. Bowman D.D., Georgi J.R. & Saunders. (2009). Georgis’ Parasitology for Veterinarians. 10th ed., Elsevier. Conlan J.V., Khamlome B., Vongxay K., Elliot A., Pallant L., Sripa B., Blacksell S.D., Fenwick S. & Thompson R.C. (2012). Soil-transmitted helminthiasis in Laos: a community-wide cross- sectional study of humans and dogs in a mass drug administration environment. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86: 624-34. Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương 203 Diawara A., Halpenny C.M., Churcher T.S., Mwandawiro C., Kihara J., Kaplan R.M., Streit T.G., Idaghdour Y., Scott M.E., Basáđez M.G. & Prichard R.K. (2013). Association between response to albendazole treatment and β-tubulin genotype frequencies in soil-transmitted helminthes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 7(5): 2247. Dinh N.N., Sze F.H., Van-Anh T.N., Trong V.N., Dien V.N. & Rebecca J.T. (2015). Re-evaluation of the species of hookworms infecting dogs in Central Vietnam. Parasites & Vectors. 8: 401. Duong D. H., Bui K. L., Nguyen T. H., Tran T. D., Eiji N., Haruhiko M., Ayako Y. & Nariaki N. (2018). Phylogenetic relationship between Ancylostoma ceylanicum populations found in dogs and humans in Vietnam. Vietnam Journal of Infectious Diseases. 6: 53. Furtado L. F., Bello A.C., Dos Santos H.A., Carvalho M.R., Rabelo E.M. (2014). First identification of the F200Y SNP in the β-tubulin gene linked to benzimidazole resistance in Ancylostoma caninum? Veterinary Parasitology. 206 (3-4): 313-316. Hotez P.J., Brooker S., Bethony J.M., Bottazzi M.E., Loukas A. & Xiao S. (2004). Hookworm infection, The New England Journal of Medicine. 351: 799- 807. Inpankaew T., Schar F., Dalsgaard A., Khieu V., Chimnoi W., Chhoun C., Sok D., Marti H., Muth S., Odermatt P. & Traub R.J. (2014). High prevalence of Ancylostoma ceylanicum hookworm infections in humans, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 20: 976-82. Jolodar A., Fischer P., Buttner D.W., Miller D.J., Schmetz C. & Brattig N.W. (2004). Onchocerca volvulus: expression and immunolocalization of a nematode cathepsin D-like lysosomal aspartic protease. Experimental Parasitology. 107: 145-156. Kwa M.S., Kooyman F.N., Boersema J.H. & Roos M.H. (1993). Effect of selection for benzimidazole resistance in Haemonchus contortus on beta- tubulin isotype 1 and isotype 2 genes Biochemical and Biophysical Research Communications. 191: 413-419. Kwa M.S., Veenstra J.G. & Roos M.H. (1994). Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with a conserved mutation at amino acid 200 in beta-tubulin isotype 1. Molecular and Biochemical Parasitology. 63:299-303. Loukas A., Bethony J.M., Mendez S., Fujiwara R.T., Goud G.N., Ranjit N., Zhan B., Jones K., Bottazzi M.E. & Hotez P.J. (2005). Vaccination with recombinant aspartic hemoglobinase reduces parasite load and blood loss after hookworm infection in dogs. PLOS Medicine. 2: 295. Ngui R., Lim Y.A., Traub R., Mahmud R. & Mistam M.S. (2012a). Epidemiological and genetic data supporting the transmission of Ancylostoma ceylanicum among human and domestic animals. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6: 1522. Ngui R., Ching L.S., Kai T.T., Roslan M.A., Lim Y.A. (2012b). Molecular identification of human hookworm infections in economically disadvantaged communities in Peninsular Malaysia. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86: 837-42. Traub R.J., Inpankaew T., Sutthikornchai C., Sukthana Y. & Thompson R.C. (2008). PCR-based coprodiagnostic tools reveal dogs as reservoirs of zoonotic ancylostomiasis caused by Ancylostoma ceylanicum in temple communities in Bangkok. Veterinary Parasitology. 155: 67-73. Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Prociv P., Berry C., Girdwood K., Pritchard D.I., Fairlie D.P., Hotez P.J., Dalton J.P. & Loukas A. (2002). Cleavage of hemoglobin by hookworm cathepsin D aspartic proteases and its potential contribution to host specificity. The FASEB Journal. 16:1458- 1460. Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Datu B.J., Prociv P., Berry C., Girdwood K., Pritchard D.I, Fairlie D.P., Hotez P.J., Zhan B. & Loukas A. (2003a). Hookworm aspartic protease, Na-APR-2, cleaves human hemoglobin and serum proteins in a host-specific fashionThe Journal of Infectious Diseases. 187: 484-494. Williamson A.L., Brindley P.J. & Loukas A. (2003b). Hookworm cathepsin D aspartic proteases: contributing roles in the host-specific degradation of serum proteins and skin macromolecules. Parasitology. 126: 179-185. Williamson A. L., Paolo Lecchi, Bejamin E.T, Youngchol C., Peter J.H., James H.K, Lewwis C.K., Mohammed S., Charles S.C. & Alex L. (2004). A multi-enzyme cascade of hemoglobin proteolysis in the intestine of blood-feeding hookworms. Journal of Biological Chemistry. 279: 35950-35957.