Tìm hiểu công nghệ vi sinh

PHẦN II CÔNG NGHỆ VI SINH Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 199 XÁC ĐỊNH NHANH Lactobacillus BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) Trần Hoàng Ngọc Ái, Trần Ánh Nguyệt, Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệ t đới MỞ ĐẦU Lactobacillus có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của lactobacillus đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng lactobacillus thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên hiện nay trên thị trường có nhiều thực phẩm, dược phẩm có bổ sung các chủng probiotic c òn sống. Lactobacillus bao gồm trên 25 loài và mức độ đầu tiên để phân biệt chúng là dựa trên thành phần của sản phẩm cuối; một số lactobacillus l ên men đồng hình trong khi một số khác thì lên men dị hình. Ngoài phương pháp phân biệt dựa trên các đặc tính phát triển ở những nhiệt độ, pH và nồng độ muối khác nhau của lactobacillus, c òn có phương pháp khác để phân biệt chúng là dạng lên men carbohydrat, thủy giải arginine, thủy giải peptidoglycan và dạng tương đồng DNA-DNA. Tuy nhiên, do giống với nhiều vi khuẩn lactic khác về các y êu cầu phát triển và dinh dưỡng nên thường khó khi sử dụng phương pháp vi sinh vật truyền thống để xác định chúng ngay cả ở mức giống. V ì vậy, nghiên cứu này tập trung vào ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phân tích dữ liệu trình tự gen rDNA16S để xác định nhanh lactobacillus. Việc sử dụng mồi đặc hiệu cho gen m ã hoá rRNA 16S bằng PCR đã được thực hiện như là một phương pháp để xác định. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy Chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Lactobacillus đ ược dùng trong nghiên cứu này là được thu nhận từ ARS Culture Collection (NRRL) bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobaci llus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei. Ngoài ra còn có chủng Streptococcus faecium, Bacillus subtilis. Các điều kiện nuôi cấy  Môi trường: Vi khuẩn Lactobacillus v à Streptococcus được nuôi cấy trong môi Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007200 trường MRS (de Man-Rogosa-Sharpe); còn B.subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria-Bertani )  Nhiệt độ: Các chủng vi khuẩn này được nuôi ủ ở 37oC Tách chiết DNA (Theo Sambrook J. et al, 1989)  Tế bào vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, còn B. subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37oC qua đêm  Thu sinh khối của 5ml dịch vi khuẩn trong eppendorf bằng cách ly tâm ở 10 000 vòng/ phút trong 2 phút  Thêm 500 l dịch huyền phù phân giải tế bào, vortex mạnh để dịch tế bào đồng nhất  Cho vào mỗi eppendorf 10mg cát trắng, vortex mạnh, để trong đá 30 giây  Thêm 150 l dung dịch Potassium acetat 3M, pH 4.8  Vortex đều, ly tâm ở 10 000 vòng/ phút trong 10 phút, lấy dịch nổi cho vào eppendorf mới  Thêm vào 600 l isopropanol lạnh, đảo ngược eppendorf 1-2 lần để tủa DNA, ly tâm ở 13 000 vòng/ phút trong 10 phút, đổ bỏ dịch nổi một cách nhẹ nhàng  Thêm vào 500 l ethanol 70% để rửa tủa, ly tâm ở 13 000 v òng/ phút trong 10 phút, đổ bỏ dịch nổi một cách nhẹ nh àng, làm khô trên giấy thấm, để khô tự nhiên trong không khí khoảng 20 phút  Thêm vào 50 l dung dịch TE, lắc nhẹ  Thêm vào 2 l RNAase 1mg/ml và ủ ở 37oC trong 3 giờ  Bảo quản DNA ở 4oC hoặc - 20oC  Sau đó xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng cách đo OD ở bước sóng 260nm, 280nm và chạy điện di trên gel agarose 0,8%. Khuếch đại gen bằng PCR Sử dụng hai cặp mồi để khuếch đại gen rDNA 16S (đ ược tổng hợp từ hãng Proligo) với trình tự như sau: - Cặp mồi 1: Mồi xuôi: 5’- GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG -3’ Mồi ngược: 5’- CAC CGC TAC ACA TGG AG -3’ - Cặp mồi 2: Mồi xuôi: 5’- AGC AGT AGG GAA TCT TCC A -3’ Mồi ngược: 5’- ATT CCA CCG CTA CAC ATG -3’ Thành phần phản ứng Khuôn DNA 200ng Taq DNA polymerase 1.25 U Nồng độ mồi 1 M dNTP 200 M Tris-HCl, pH 8.3 20mM KCl 100mM MgCl2 3mM Điều kiện phản ứng 95oC, 5 phút; 30 chu kỳ (95oC, 1 phút; 55oC, 1 phút; 72oC, 2 phút); 72oC, 7 phút. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 201 Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di tr ên gel agarose 1.5% và thu được kích thước gen rDNA 16S (khi được khuếch đại với cặp mồi 1) là 700 bp và kích thước gen rDNA 16S (khi được khuếch đại với cặp mồi 2) l à 340 bp. Khuếch đại gen bằng PCR khuẩn lạc Sử dụng Kit microLYSIS TM theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Microzone Limited với các bước như sau:  Tế bào vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, còn B. subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37oC qua đêm  Trộn 3 l dịch vi khuẩn trên với 17 l dung dịch microLYSIS  Đặt vào máy chu kỳ nhiệt với chế độ: 65oC, 5 phút; 96oC, 2 phút; 65oC, 4 phút; 96oC, 1 phút; 65oC, 1 phút; 96oC, 30 giây; giữ ở 20oC Sau khi chạy với chu kỳ nhiệt trên, tất cả hỗn hợp microLYSIS/DNA có thể đ ược dùng trực tiếp trong PCR hoặc có thể đ ược cất giữ ở - 20oC. Với PCR khuẩn lạc, chỉ sử dụng cặp mồi 2 với tr ình tự như trên để khuếch đại gen rDNA 16S và cho kích thước là 340 bp. Còn điều kiện phản ứng vẫn không thay đổi. Thành phần phản ứng: Hỗn hợp microLYSIS/DNA 5 L Hỗn hợp DNA polymerase 1.2 U Nồng độ mồi 1 M dNTP 200 M Tris-HCl, pH 8.3 10 mM KCl 50 mM MgCl2 1.5 mM Trong đó, hỗn hợp DNA polymerase, Taq DNA polymerase, dNTP v à thang DNA Marker VI được mua từ hãng Roche. KẾT QUẢ Khuếch đại gen bằng PCR Hình 1. Sản phẩm khuếch đại gen rDNA 16S của phản ứng PCR tr ên gel agarose 1,5%. M: thang DNA Marker VI (có 11 vạch với kích thước từ trên xuống: 2.20, 1.80, 1.20, 1.0, 0.65, 0.52, 0.45, 0.39, 0.30, 0.23, 0.22 kb); 1, 4, 6: Lactobacillus acidophilus được khuếch đại với cặp mồi 1; 2, 5, 7: Lactobacillus acidophilus được khuếch đại với cặp mồi 2; 3: B. subtilis được khuếch đại với cặp mồi 1; 8: B. subtilis được khuếch đại với cặp mồi 2 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007202 Từ kết quả trên cho thấy: Khi khuếch đại gen rDNA 16S với cặp mồi 1 v à 2 của L. acidophilus thì đều cho vạch DNA tương ứng là 0.7 kb và 0.34 kb như dự kiến; trong khi đó B. subtilis cho kết quả âm tính. Khuếch đại gen bằng PCR khuẩn lạc Hình 2. Sản phẩm khuếch đại gen rDNA 16S của phản ứng PCR khuẩn lạc tr ên gel agarose 1,5%. M: thang DNA Marker VI; 1: Lactobacillus acidophilus; 2: Lactobacillus johnsonii; 3: Lactobacillus sakei; 4: Lactobacillus bulgaricus; 5: Lactobacillus reuteri; 6: Streptococcus faecium Qua kết quả trên có thể kết luận: Mặc dù khác nhau về loài nhưng cùng là giống Lactobacillus nên khi khuếch đại gen rDNA 16S với cặp mồi 2 th ì sản phẩm PCR đều cho vạch DNA là 0.34 kb; còn Streptococcus faecium thì cho kết quả âm tính. Như vậy, cả hai mồi 1 và 2 đều đặc hiệu cho giống Lactobacillus v à giúp ta có thể phát hiện chúng trong sản phẩm có nhiều giống khác nhau của cùng một nhóm hoặc ngoài nhóm vi khuẩn lactic. KẾT LUẬN Với cặp mồi đặc hiệu cho gen rDNA 16S, chúng tôi đ ã xác định được Lactobacillus ở mức độ giống khi sử dụng ph ương pháp PCR (với khuôn là DNA được tách chiết) và phương pháp PCR khuẩn lạc. Đặc biệt phương pháp PCR khuẩn lạc đã cho kết quả nhanh hơn. Đây là kỹ thuật sinh học phân tử được dùng để xác định, phân loại các vi khuẩn thực (Eubacteria) và dùng để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm, nước, mỹ phẩm,… Do đó, đề tài góp phần cho việc phát hiện và định danh đến mức độ loài của các vi khuẩn lactic nói riêng và vi khuẩn thực nói chung. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Batt CA. (1999). Latobacillus. Introduction. Encyclopedia of Food Microbiology. Academic Press. 2. Dubernet S, Desmasures N, Gueuguen M. (2002). A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiology Letters 214: 271-275. 3. Heilig H, Zoetendal EG, Vaughan E, Marteau P, Akkermans A, and deVos. (2002). Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl Environ Microbiol68:114-123. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 203 4. Reid G. (1999). The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Appl Environ Microbiol 65: 3763-3766. 5. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T . (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY. 6. Tannock GW, Munro K, Harmsen HJM, Welling GM, Smart J, and Gobal PK. (2000). Analyses of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20. Appl Environ Microbiol 66: 2578-2588. 7. Walter J, Hertel C, Tannock GW, Lis CM, Munro K, and Hammes WP . (2001). Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella Species in Human Feces by Using Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Appl Environ Microbiol 67: 2578-2585. SUMMARY The PCR- based rapid identifying method for Lactobacillus Tran Hoang Ngoc Ai, Tran Anh Nguyet, Le Thi Hong Tuyet, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology The sequencing and analysis of the 16S and 23S rDNA genes are considered as one of the cornerstones of modern microbial taxonomy. These sequences are used to define genus-specific PCR primers for a rapid detection of lactic acid bacteria (LA B). Moreover, in recent years, several rapid methods for the detection and identification of lactobacilli have been developed. Traditional microbiological assays for the identification of lactobacillus species are very often time - consuming and can yield rather variable results. LAB strains including Lactobacillus acidophilus , L. johnsonii, L. reuteri, L. bulgaricus, L. sakei were collected from freeze-dried samples of ARS Culture Collection (NRRL). They were activated and incubated in MRS broth medium at 37oC to get biomass; then they were extracted DNA as a template of standard PCR or used directly in colony PCR. Both of this two PCR methods were used to amplify 16S rDNA gene with lactobacillus genus -specific primer. In this work, we used two primers for amplifying 16S rDNA gene and generated PCR product size as 0.7 kb (for primer 1) and 0.34 kb (for primer 2) for five lactobacillus species. Electrophoresis did not reveal any discrete bands when Bacillus subtilis, Streptococcus faecium DNA were used as template. Identification of lactobacillus in colony PCR have a result faster and more high yield than standard PCR because there was a DNA polymerase mixture including Taq DNA polymerase and Tgo DNA polymerase in Expand High Fidelity System designed from Roche Ltd. Thus, we showed that the genus -specific primers could be a useful tool for identification of the members of lactobacilli. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007204 BIẾN NẠP DI TRUYỀN GIÁN TIẾP NHỜ Agrobacterium tumefaciens VÀO NẤM BỆNH CÂY Phytophthora palmivora Trần Hoàng Ngọc Ái và Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Biến nạp di truyền dựa trên khả năng tự nhiên của Agrobacterium tumefaciens là chuyển đoạn DNA từ Ti plasmid của nó, T -DNA, vào tế bào thực vật và nấm và hòa nhập ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể trong nhân. Tiến tr ình chuyển T-DNA phụ thuộc vào biểu hiện của gen vir (gen gây độc) của A.tumefaciens. Sự biểu hiện của gen gây độc này được cảm ứng bởi sự tiết ra của một số chất từ vết th ương thực vật như acetosyringone (AS). Sự có mặt của biên (border) trái và biên phải ở T-DNA là cần thiết trong tiến trình này. Trong tự nhiên có rất nhiều bệnh ở thực vật do nấm gây ra, dẫn đến tình trạng năng suất mùa màng thấp ở nhiều nơi trên thế giới. Vì vậy nấm gây bệnh ở thực vật l à đối tượng cần được nghiên cứu không chỉ về đặc tính nuôi cấy, sinh hóa, bệnh lý m à còn ở mức độ di truyền phân tử để có thể biến đổi di truyền cũng nh ư kiểm soát bệnh gây ra. Trong báo cáo này trình bày các k ết quả thu được về biến nạp di truyền nấm Phytophthora palmivora, nấm gây bệnh chính trên cây cao su và cây ăn trái như s ầu riêng, ca cao, bưởi. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật  Các chủng Escherichia coli DH5 và Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 đã mô tả trong bài báo (3).  Phytophtora palmivora thu nhận từ Trung tâm Kiểm dịch thực vật V ùng II.  Plasmid pPK2 là vector thứ cấp được thiết kế cho biến nạp vi nấm (2). Môi trường  Môi trường LB dùng để nuôi cấy E. coli và A. tumefaciens.  Môi trường V-8 dùng để nuôi cấy nấm P. palmivora.  Môi trường nuôi cấy chung vi khuẩn v à nấm theo (3).  Môi trường chọn lọc thể biến nạp P. palmivora theo (3).  Môi trường nuôi cấy để tách chiết DNA của P. palmivora là môi trường lỏng malt- cao nấm men (MY). Các vật liệu khác Các vật liệu dùng trong thí nghiệm tương tự trong (3). Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 205 Phương pháp Biến nạp plasmid pPK2 vào E.coli bằng phương pháp CaCl2 lạnh theo Sambrook và cs (6). Tách chiết plasmid pPK2 từ E. coli theo bộ kit UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep (hãng MO BIO) Biến nạp plasmid pPK2 bằng xung đi ện vào A. tumefaciens theo (4). Tách chiết plasmid pPK2 từ A. tumefaciens theo Sambrook và cs (6). Biến nạp Phytophthora palmivora gián tiếp qua A. tumefaciens bằng phương pháp nuôi cấy chung (3). Tách chiết DNA genome của nấm P. palmivora:  Cấy nấm vào 30 ml môi trường MY, ủ trong tối trong trạng thái tĩnh 3 ng ày.  Ly tâm thu sinh khối của 5 ml dịch nấm trong eppendorf ở 6000 v/p trong 5 phút.  Cho vào 500 l dung dịch phân giải tế bào và thêm 10mg cát trắng. Vortex mạnh trong 1 phút, đặt trong đá 1 phút, lặp lại 2 lần.  Thêm vào 150 l potassium acetate 3M. Ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút, thu d ịch nổi vào ống eppendorf mới.  Cho vào 600 l isopropanol lạnh, đảo ngược để trộn, đặt trong đá 10 phút, ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, rút nh ẹ nhàng dịch nổi, thu tủa.  Rửa tủa với 500 l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, rút dịch nổi, thu tủa, phơi khô tự nhiên trong không khí.  Hòa tan tủa với 20 l đệm TE. Thêm vào 1 l RNAse 1mg/ml, ủ 370C khoảng 3 giờ. Giữ ở 40C. Nồng độ và độ sạch của ADN kiểm tra bằng quang phổ ở b ước sóng 260 và 280 nm. Ngoài ra DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kiểm tra sự hiện diện của gen hph (gen khánh hygromycin B) tr ong DNA genome của P.palmivora bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen hph l à hph-F và hph-R trong điều kiện: 940C, 5 phút; 30 chu kỳ (940C, 1 phút, 600C, 1 phút, 720C, 2 phút); 720C, 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % và cho kích thư ớc gen hph dự kiến 1 kb. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biến nạp Agrobacterium tumefaciens : Sau khi tách chiết plasmid pPK2 mang gen kháng kanamycin từ E. coli và biến nạp vào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện kết quả cho thấy những khuẩn lạc biến nạp mọc được trên môi trường LB có bổ sung 50 g/ml kanamycin, trong khi chủng hoang dại thì không (Hình 1). Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007206 Hình 1. Biến nạp pPK2 vào tế bào A.tumefaciens. Chủng A.tumefaciens LBA 4404 biến nạp với plasmid pPK2 mọc tr ên môi trường LB có kanamycin (phải), chủng không biến nạp (trái) Quan sát sự gắn kết A. tumefaciens lên tơ nấm P. palmivora A. tumefaciens và P. palmivora được nuôi trên môi trường nuôi cấy chung. Quan sát trên kính hiển vi cho thấy trong giai đoạn đầu của quá tr ình nuôi cấy chung diễn ra sự tiếp xúc của tế bào A. tumefaciens lên bề mặt của tơ nấm (Hình 2). Điều này có ý nghĩa quan trọng trong quá tr ình chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào nấm. Các thí nghiệm tiếp theo sẽ tiếp tục làm sáng tỏ quá trình này. Hình 2. Gắn kết của A.tumefaciens lên tơ nấm P.palmivora (40 X) Biến nạp Phytophthora palmivora Chọn nồng độ hygromycin B thích hợp để chọn lọc P.palmivora biến nạp. Cấy P.palmivora hoang dại vào môi trường V8-agar có bổ sung nồng độ hygromycin B là 0, 50, 100, 150, 200, 250 g/ml. Kết quả cho thấy ở nồng độ 250 g/ml nấm không mọc được (số liệu không công bố), v ì vậy nồng độ 250 g/ml hygromycin B được dùng để chọn lọc thể nấm biến nạp. Các khuẩn lạc nấm biến nạp xuất hiện tr ên môi trường chọn lọc sau 6 ngày nuôi cấy, sau đó cấy sang môi trường V8-agar có bổ sung 250 g/ml hygromycin B. Các kết quả chọn lọc thể hiện trên Hình 3. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 207 Hình 3. Biến nạp P.palmivora nhờ A.tumefaciens mang plasmid pPK2. Các th ể biến nạp P.palmivora mọc trên môi trường có 250 g/ml hygromycin (B) , thể hoang dại (A) Kiểm tra sự hiện diện của gen hph trong genome của P.palmivora bằng PCR. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu v à DNA mạch khuôn là DNA genome nấm. Sản phẩm PCR điện di tr ên gel agarose cho band có kích thư ớc tương đương với kích thước đoạn gen hph có trong đoạn T -DNA của plasmid pPK2. Điều đó chứng tỏ T-DNA của pPK2 đã hòa nhập vào trong DNA genome của nấm P.palmivora. 21 3 4 5 6 1.0 kb Hình 4. Kiểm chứng dòng P.palmivora biến nạp có mang gen hph bằng PCR. 1, Thang DNA marker VI (Roche ); 2, Sản phẩm PCR từ khuôn plasmid pPK2; 3, sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng hoang dại; 4, 5, 6, sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng biến nạp Đây là những kết quả đầu tiên về biến nạp di truyền nấm gây bệnh thực vật P.palmivora gián tiến nhờ A. tumefaciens. Nói chung biến nạp di truyền vào vi nấm gặp nhiều khó khăn cho nên sự phát triển của biến nạp di truyền nhờ Agrobacterium giúp ích rất nhiều cho việc đưa vào các gen mong muốn, hoặc tạo ra các đột biến có định hướng giúp cho việc nghiên cứu cơ chế gây bệnh trên thực vật (2, 5). Đồng thời, qua các thí nghiệm biến nạp nhờ Agrobacterium cho thấy kỹ thuật n ày tương đối đơn giản và tốn ít công sức so với các kỹ thuật biến nạp khác. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007208 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cassago A., et al. (2002). Cellophane based mini -prep method for DNA extraction from the filamentous fungus Trichoderma reesei. BMC Microbiology (xem: -2180/2/14). 2. Covert S. F., et al. (2001). Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Fusarium circinatum. Mycological Re search 105: 259-264. 3. Hoàng Quốc Khánh, Trần Hoàng Ngọc Ái (2003). Chuyển gen kháng hygromycin B vào vi nấm Trichoderma harzianum bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens. Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống: 930-934, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 4. McCormac A. C., et al., (1998). A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology 9:155-159. 5. Mullins E. D. and Kang S., (2001). Transformation: A tool for studying fungal pathogens of plants. Cell Mol. Life Sci. 58: 2043-2052. 6. Sambrook J., et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press. SUMMARY Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the phytopathogen Phytophthora palmivora Tran Hoang Ngoc Ai and Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation has been successfully applied to the phytopathogen Phytophthora palmivora. The T -DNA was integrated into the genome and was stable through cell division. The presence of hph gene in P.palmivora genomic DNA was checked by PCR. These findings should facilitate future analysis of P.palmivora pathogenicity and stimulate wider use of this valuable transformation method in fungal research. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 209 BIẾN NẠP DI TRUYỀN NẤM R ƠM Volvariella volvacea BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GIÁN TIẾP NHỜ Agrobacterium tumefaciens Trần Hoàng Ngọc Ái, Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Nấm rơm Volvariella volvacea là một nấm ăn được nuôi trồng phổ biến ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Mặc dù hiện nay nấm rơm chiếm 1/5 lượng sản xuất hàng năm trên khắp thế giới nhưng hiệu quả sinh học (phát triển trên cơ chất để hình thành quả thể) thì thấp so với các loài nấm nuôi trồng phổ biến khác như Agaricus bisporus, Lentinula edodes và Pleurotus sajor - caju (Chen et al., 2003; Ding et al., 2001). Nấm rơm được nuôi trồng trên nhiều dạng chất thải có lignocellulose nh ư rơm của các cây ngũ cốc, lá chuối, bã mía đường, vỏ quả cọ dầu… (Cai et al., 1999). Giống với nhiều vi nấm có khả năng phân giải cellulose, V. volvacea sản xuất ra một hệ thống nhiều enzym gồm -glucosidase, endo-1,4--glucanase, cellobiohydrolase chuyển hoá cellulose thành glucose (Cai et al., 1998). Ngoài ra, V. volvacea còn tạo ra laccase là một enzym phân giải lignin và oxy hoá các hợp chất phenol. Do tầm quan trọng của nấm rơm về mặt sinh học, có giá trị kinh tế v à cũng là một loài nấm lớn phổ biến ở nước ta nên việc tìm hiểu sự di truyền của chúng là cần thiết. Bước đầu, chúng tôi đã chuyển gen kháng hygromycin B vào V. volvacea bằng phương pháp biến nạp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens dựa trên đặc tính tự nhiên của vi khuẩn này là chuyển T-DNA từ Ti plasmid của chúng vào nhiễm sắc thể trong nhân của tế bào chủ như thực vật hoặc vi nấm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật Escherichia coli DH5 [F- endA1 hsdR17(rk-/mk-) supE44 thi- recA1 gyrA96 ∆ lac U 169(80 lacZ∆ M15)] mang plasmid pPK2. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 được dùng làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, nhân plasmid và chuyển T-DNA từ plasmid vào Volvariella volvacea . Volvariella volvacea là đối tượng cần chuyển gen. Plasmid Plasmid pPK2 mang gen hph (gen kháng hygromycin B) có kích thư ớc là 10,77 kb và chiều dài của gen hph là 1 kb. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007210 Môi trường Môi trường LB (Luria - Bertani): nuôi cấy vi khuẩn E. coli và A. tumefaciens; PDA (Potato Dextrose Agar): nuôi cấy nấm rơm V. volvacea; IM: nuôi cấy chung A. tumefaciens và V. volvacea; M-100agar: chọn lọc thể biến nạp V. volvacea; CYM-R: môi trường CYM (glucose 20g; cao nấm men 2g; peptone 2 g; MgSO4. 7 H2O 0,5g; KH2PO4 0,46g; K2HPO4 1g trong 1 lít nước cất ) chứa 0,6 M Sucrose d ùng để chọn lọc thể biến nạp V. volvacea lần 2; MY ( Malt-Yeast extract): nuôi cấy nấm rơm V. volvacea để tách chiết DNA. Các vật liệu khác Giấy lọc (Prolabo) Các hoá chất dùng cho biến nạp vi khuẩn và điện di gel agarose của hãng Merck Các hoá chất dùng cho phản ứng PCR của hãng Roche Mồi đặc hiệu cho gen hph: Mồi xuôi (hph-F): 5’-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3’ Mồi ngược (hph-R): 5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC -3’ Phương pháp Tách chiết plasmid pPK2 từ E.coli theo hướng dẫn của bộ kit Ultra Clean TM 6 Minute Mini Plasmid Prep Kit TM của hãng MO BIO. Biến nạp plasmid pPK2 bằng xung điện v ào A.tumefaciens Tách chiết plasmid pPK2 từ A.tumefaciens theo Sambrook và cộng sự (Sambrook J et al.,1989) Biến nạp V. volvacea gián tiếp qua A. tumefaciens bằng phương pháp nuôi cấy chung:  Dùng 5ml nước cất để thu dịch bào tử và tơ nấm V. volvacea đã mọc 1 tuần trên môi trường PDA.  Dùng kẹp vô trùng chuyển các miếng giấy lọc (1,5 x 1,5cm) lên môi trường IM agar có 200 M AS. Bơm 20 l dịch bào tử và tơ nấm V. volvacea trực tiếp vào giữa các miếng giấy lọc; ủ ở 28 oC trong 3 ngày.  Cấy A.tumefaciens - pPK2 vào 10 ml môi trường LB lỏng có 50 g/ml kanamycin, nuôi cấy lắc ở 200 vòng/ phút qua đêm ở nhiệt độ phòng.  Đo OD600 của dịch vi khuẩn. Pha loãng dịch vi khuẩn với môi trường IM có chứa 200 M AS để có OD = 0,15.  Nuôi cấy lắc ở 250 vòng/ phút khoảng 4 giờ ở nhiệt độ phòng để có OD600 = 0,6-0,8.  Bơm 50 l dịch vi khuẩn đã được cảm ứng với AS vào giữa mỗi miếng giấy lọc có nấm; ủ ở 28oC trong 4 ngày.  Sau 4 ngày, chuyển các miếng giấy lọc sang môi tr ường M-100 agar có 500 g/ ml cefotaxime và 70 g/ ml hygromycin B; ủ ở 28oC, loại bỏ các miếng giấy lọc sau 1 ngày và ủ tiếp trong 10 ngày nữa.  Các khuẩn lạc nấm xuất hiện trên môi trường M-100 agar có 70 g/ ml hygromycin Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 211 B được cấy chuyền sang môi trường CYM-R cũng có 70 g/ ml hygromycin B để chọn lọc thể nấm biến nạp. Tách chiết DNA bộ gen của nấm V. volvacea: DNA bộ gen của nấm chưa biến nạp và nấm biến nạp được tách chiết từ sợi nấm đã được phát triển trong 30ml môi tr ường MY; nuôi ủ ở trạng thái tĩnh trong 7 ng ày và tiến hành tách chiết DNA theo Sambrook và cộng sự (Sambrook J et al.,1989). Nồng độ và độ sạch của DNA plasmid và DNA bộ gen được kiểm tra bằng cách đo OD260 nm và OD280 nm. Ngoài ra, DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kiểm tra sự hiện diện của gen hph (gen kháng hygromycin B) trong DNA bộ gen của V. volvacea bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen hph l à hph-F và hph-R trong điều kiện: 940C, 5 phút; 30 chu kỳ (940C, 1 phút; 600C, 1 phút; 720C, 2 phút); 720C, 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và cho kích thước gen hph dự kiến là 1 kb. KẾT QUẢ Biến nạp Agrobacterium tumefaciens Plasmid pPK2 mang gen kháng kanamycin đư ợc tách chiết từ E.coli và biến nạp vào A. tumefaciens, đã cho kết quả: những khuẩn lạc của chủng vi khuẩn đ ược biến nạp đã xuất hiện trên môi trường LB có bổ sung 50 g/ ml kanamycin, trong khi chủng hoang dại (đối chứng) thì không mọc trên môi trường có kháng sinh. Hình 1. A. tumefaciens trên môi trường LB-Kanamycin (50 g/ ml). Chủng hoang dại (trái); chủng biến nạp (phải) Biến nạp Volvariella volvacea  Chọn nồng độ hygromycin B để chọn lọc V. volvacea biến nạp: Cấy V. volvacea hoang dại vào môi trường M-100 agar có bổ sung nồng độ hygromycin B l à 0, 20, 40, 50, 60, 70, 80 g/ ml. Kết quả cho thấy ở nồng độ 70 g/ ml hygromycin B và Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007212 cao hơn , nấm không mọc được; vì vậy chọn 70 g/ ml hygromycin B làm nồng độ để chọn lọc thể biến nạp.  Các khuẩn lạc nấm biến nạp đã xuất hiện trên môi trường M-100 agar có 70 g/ ml hygromycin B sau 10 ngày nuôi c ấy (hình 2), được cấy sang môi trường CYM-R cũng có bổ sung 70 g/ ml hygromycin B, kết quả thể hiện qua Hình 3. A B Hình 2. Volvariella volvacea trên môi trường M-100 agar - Hygromycin B (70 g/ ml) A: Chủng hoang dại; B: Chủng biến nạp A B Hình 3. Volvariella volvacea trên môi tr ường CYM-R - Hygromycin B (70 g/ml) A: Chủng hoang dại; B: Chủng biến nạp Kiểm tra sự hiện diện của gen hph (gen kháng hygromycin B) trong DNA b ộ gen của V. volvacea bằng phản ứng PCR Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen hph v à DNA mạch khuôn là DNA bộ gen của nấm, sản phẩm PCR đ ược điện di trên gel agarose cho band 1 kb tương đương với kích thước đoạn gen hph có trong T -DNA của plasmid pPK2. Như vậy, T-DNA của plasmid pPK2 đã hoà nhập vào trong DNA bộ gen của nấm Volvariella volvacea .  1 kb Hình 4. Sản phẩm khuếch đại gen hph của phản ứng PCR trên gel agarose 1,5% M: thang DNA Marker VI (có 11 v ạch với kích thước từ trên xuống: 2.20, 1.80, 1.20, 1.0, 0.65, 0.52, 0.45, 0.39, 0.30, 0.23, 0.22 kb); 1: plasmid pPK2; 2: DNA c ủa Volvariella volvacea hoang d ại; 3,4: DNA của Volvariella volvacea biến nạp Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 213 KẾT LUẬN Chúng tôi đã thu nhận được chủng nấm rơm Volvariella volvacea chuyển gen kháng hygromycin B bằng phương pháp biến nạp gián tiếp nhờ A. tumefaciens. Phương pháp biến nạp này cho hiệu quả biến nạp cao, nhanh chóng v à ít tốn kém. Nấm rơm là một nấm ăn có giá trị kinh tế n ên nghiên cứu này là sự mở đầu cho những nghiên cứu chuyên sâu về di truyền để có thể làm biến đổi hiệu quả sinh học của nấm n ày cũng như góp phần cho sự nghiên cứu những đặc tính di truyền của các nấm lớn khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cai YJ, Chapman S, Buswell J and Chang S. (1999). Production and distribution of endoglucanase, cellobiohydrolase and - glucosisade components of cellulo lytic system of Volvariella volvacea , the edible straw mushroom. Appl Environ Microbiol 65(2): 553-559. 2. Cai YJ, Buswell J and Chang S. (1998). - glucosisade components of cellulolytic system of the edible straw mushroom, Volvariella volvacea . Enzyme and Microbial Technology 22: 122-129. 3. Chen S, Ma D, Ge W and Buswell J. (2003). Induction of laccase activity in the edible straw mushroom, Volvariella volvacea . FEMS Microbiology Letters 218:143-148. 4. Covert SF, Kapoor P, Lee M, Briley A and Nairn CJ. (2001). Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Fusarium circinatum . Mycological Research 105: 259-264. 5. De Groot MJA, Bundock P, Hooykaas PJJ and Beijersbergen AGM. (1998). Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of filamentous fungi . Nature Biotechnology 16: 839-842. 6. Ding S, Ge W and Buswell J. (2001). Endoglucanase I from the edible straw mushroom, Volvariella volvacea - Purification, characterization, cloning and expression. Eur. J. Biochem. 268: 5687-5695. 7. Hoàng Quốc Khánh, Trần Hoàng Ngọc Ái (2003). Chuyển gen kháng hygromycin B vào vi nấm Trichoderma harzianum bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens . Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, 930-934, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 8. Jia JH, Buswell JA and Peberdy JF. (1998). Transformation of the edible fungi, Pleurotus ostreatus and Volvariella volvacea. Mycological Research 102 (7): 876-880. 9. Mikosch TSP, Lavrijssen B, Sonnenberg ASM and van Griensven LJLD. (2001). Transformation of the cultivated mushroom Agaricus bisporus (Lange) using T- DNA from Agrobacterium tumefaciens . Current Genetics 39: 35-39. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007214 10. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T . (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY. SUMMARY Agrobacterium tumefaciens -mediated genetic transformation of the edible straw mushroom Volvariella volvacea Tran Hoang Ngoc Ai, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology Agrobacterium tumefaciens is known to transfer parts of its tumor -inducing plasmid, the T-DNA, to plants, yeasts and filamentous fungi; therefore, we have used this system to transform germinating basidiospores and vegetative mycelium of the cultivated basidiomycete Volvariella volvacea . Strain LBA4404 of A. tumefaciens was provided by Plant Genetic Engineering Laboratory (Institute of Tropical Biology). Plasmid pPK2, containing hygromycin B phosphotransferase( hph) gene with the Aspergillus nidulans Pgpd. (promoter glyceraldehyd - 3 - phosphate dehydrogenase ), was provided by Dr. Sarah F.Covert, University of Georgia, USA. Hph gene which is 1 kb long was designed between LB and RB of T -DNA in this plasmid DNA. Out of T - DNA is kanamycin resistant gene used to select transformed bacteria. Spores of V. volvacea were collected on glass Petri dishes. The standard growth medium for V. volvacea was PDA and incubation was performed at 28 oC. pPK2 was transformed into A. tumefaciens via electroporation. Bacterial cultivation was performed as describes in De Groot et al. (1998). For induction of virulence and T -DNA transfer, A. tumefaciens was grown on induction medium (IM) with 200 M AS and, for negative controls, without AS. Selection for transformed mycel ial colonies was performed on M -100 agar containing cefotaxime (500 g/ml) and hygromycin B (70 g/ml) and on CYM -R containing hygromycinB (70 g/ml). Hph gene sequence of T -DNA which integrated genomic DNA of V. volvacea was checked by PCR. Analysis of t ransformants shows that the T-DNA integrates at random sites into the host genome and that the selective marker is stable during mitosis and meiosis. The transformation technique decribed herein provides a practical method for using transgenic technology i n the genetic improvement of this commercially important mushroom and represents an important tool for the molecular genetic analysis of biological processes in this species. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 215 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH HỆ NẤM MEN TẠI VƯỜN QUỐC GIA NAM CÁT TIÊN Ngo Duc Duy, Pham Tran To Nhu, Hoang Quoc Khanh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới Sasitorn Jindamorakot National Center for Genetic Engineering and Biotechnolog, Thailand MỞ ĐẦU Nấm men có rất nhiều ứng dụng, ngoài những sản phẩm lên men truyền thống, ngày nay chúng được ứng dụng trong công nghiệp hiện đại nh ư là sản xuất enzym, vitamin, acid hữu cơ và thuốc sinh học (Domain 1998), đều này cho thấy nấm men là một trong những vi sinh vật rất quan trọng trong đời sống, kinh tế và sức khỏe. Gần đây nấm men được ghi nhận như là nấm đơn bào, hầu hết được xác nhận “Nấm men thuộc bộ nấm Ascomycetous và Basidiomycetous trong đó tế bào sinh dưỡng sinh sản bằng cách nảy chồi và phân đôi, trong sự hình thành giới tính không kèm theo giai đoạn tạo quả thể” (Boekhour và Kurtman 1996). Trước đây, trong thời gian dài các đặc điểm kiểu hình được sử dụng như là những tiêu chuẩn quan trọng trong định danh nấm men, tuy nhi ên các đặc điểm này thường không ổn định bởi sự thay đổi do điều kiện môi tr ường và đòi hỏi nhiều thời gian khảo sát. Do đó, các đặc điểm n ày thường trái với kết quả trong nghiên cứu sinh học phân tử, để khắc phục những vấn đề này, kỹ thuật định danh vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng đã được dùng trực tiếp phương pháp sinh học phân tử. Đặc biệt là phân tích trình tự 26S của Ribosomal DNA trong phạm vi vùng D1/D2 cho sự phân lớp loài của nấm men đã xử dụng phổ biến rộng rãi và dữ liệu cho thấy rằng hầu hết các loài nấm men có thể định danh bằng trình tự này. Nấm men không những đóng góp rất nhiều cho nghi ên cứu khoa học cơ bản bao gồm định danh, sinh lý, sinh hóa và đa dạng sinh học mà có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và sử lý môi trường, đặc biệt tế bào nấm men là mô hình nghiên cứu của tế bào Eukaryotes (Graeme M. Walker, 1998). Rất ít những báo cáo và tính đa dạng của nấm men ở Việt Nam hiện nay (Lương et al., 2000), trong phạm vi nghiên cứu, với mục đích là ứng dụng các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh và phân loại vi sinh vật cùng với quá trình khảo sát sự đa dạng sinh học của nấm men tại Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vi sinh vật; các chủng nấm men được phân lập từ lá, phân con tr ùng, hoa và trái cây tại Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên tỉnh Đồng Nai. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007216 Ly trích trình tự 26S rDNA trong phạm vi v ùng D1/D2; nấm men nuôi trong môi trường YM agar trong 48giờ ở nhiệt độ 25 0C. Thu nhận tế bào và hòa tan trong 200µl của dung lịch đệm ly trích (100mM tris (pH 8.0), 30nM EDTA (pH 8.0, 0.5% SDS) đun sôi trong 15 phút. Thêm vào 200µl c ủa 2.5M potasium acetate, pH 7.5, và đặt chúng trong đá lạnh khoảng 1 giờ, sau khi li tâm 13000prm trong 5 phút và thu nhận dịch nổi phía tr ên, tiếp tục thêm vào một lượng thể tích chloroform:isoamyl alcohol (24:1) b ằng thể tích dịch ly trích v à lắc nhẹ, thu nhận DNA sau khi thêm một thể tích isopropanal v à ly tâm 14,000prm trong 16 phút. Phản ứng PCR được thiết lập thể tích 50µl bao gồm 1X Taq buffer, 2mM MgCl 2, 200M dNTP, 0.3pM của mỗi cặp mồi, 1.25U Taq polymerase v à 5l DNA mẫu cho chu trình PCR là 940C trong 1 phút, 52oC thời gian 1.30 phút và 72oC trong 2.30 phút cho khoảng 30 chu trình. Sản phẩm DNA được làm sạch bằng QIAquick (QIAGEN) v à giải trình tự bằng automate ABI. Hai cặp mồi được ứng dụng cho tr ình tự này như sau; mồi xuôi F63 (5’- GCA TAT CAA GCG GAG GAA AAG -3’) và mồi ngược LR3 (5’- GGT CCG TGG TTC AAG ACG -3’). Phân tích BLAST (BLAST analysis); trình t ự thu nhận được sẽ so sánh với các trình tự khác trong ngân hàng gen (Genbank) và s ử dụng công cụ BLAST của NCBI (National Center for Biotechnology Information - USA). Phân tích cây phả hệ (phylogenetic analysis); sử dụng các tr ình tự tương đồng với các loài liên quan bằng cách sử dụng ch ương trình ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997). Cấu trúc cây phả hệ đ ược cấu tạo từ khoảng dữ liệu tiến hóa theo Kimura. M (1980) bằng cách sử dụng phương pháp neighbor -joining (Saitou và Nei., 1987), phân tích bootstrap (Felsentien, 1985) đư ợc hình thành từ 1000 sự tái lấy mẫu ngẫu nhiên. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ những mẫu thu được chúng tôi phân lập được 85 chủng nấm men từ là, hoa, và phân con trùng tại Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên tỉnh Đồng Nai. Hình 1. Các tế bào sinh dưỡng nấm men trong môi trường YM broth, 2 ngày ở nhiệt độ 250C (Scale 10m, 100X) P5 H7 L60 L52 L10 L5 L29P2L53H9L40H5 L24 L67 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 217 Dựa trên các khảo sát và phân tích sinh học phân tử chúng tôi ghi nhận 14 chủng (P2, P5, H5, H7, H9, L10, L5, L24, L29, L40, L52, L53, L60 và L67) có kh ả năng là loài mới và tiếp tục khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng này, 56 loài đã biết và 15 loài chưa xác định rõ ràng. Mười bốn chủng nấm men nuôi cấy trong môi tr ường YM borth ở nhiệt độ 25 0C trong 2 ngày, sau đó quan sát dưới kính hiển vi cho thấy đa số các chủng này tái sinh bằng nảy chồi, chúng có dạng hình cầu, hình ovan và các tế bào tạo khuẩn ty giả hình thon dài v.v. (hình 1). Bên cạnh sự sinh sản bằng cách nảy chồi, nấm men c òn có khả năng hình thành một số khuẩn ty giả giống như sự hình thành sợi nấm (hình 3). Hình 3. Khuẩn ty giả tạo ra trên môi trường PDA sau 1 tuần ở nhiệt độ 250C bằng kỹ thuật đĩa Dalmau Từ kết quả thu nhận được 14 chủng khác nhau từ tất cả những lo ài đã biết bởi 5 nucleotitdes hoặc nhiều hơn trong phạm vi vùng D1/D2 thuộc trình tự 26S rDNA. Các chủng này được đề nghị là hiện diện loài mới theo như thảo luận của Kuztman và Robnett (1998), và 14 chủng này được phân lớp trong 9 loài, từ những loài gần chúng nhất (bảng 1). Bảng 1. Danh sách các chủng (H7, H5… L24) cùng với các chủng so sánh trong ngân hàng dữ liệu gen Strain GenBank Accession No. Nearest Species with Accession No. of DNA DataBank Nucleotide Identity (%) No. of Nucleotide Difference (gap) Ascomycetes H7 AM076407 Candida naeodendra partial 520/530 (98.1) 10(2) L5 AM076407 Candida naeodendra partial 520/530 (98.1) 10 (0) L10 AM076407 Candida naeodendra partial 519/530 (97.9) 11(3) H5 AF530612 Candida sp. UWO(PS)00-147.3 552/582 (94.8) 30(6) P5 U74598 Pichia hampshirensis 525/553 (94.9) 28 (0) H9 AF017412 Pichia lachance 513/572 (89.7) 59(11) L67 AJ508573 Pichia sydowiorum 570/580 (98.3) 10 (1) L60 AJ508573 Pichia sydowiorum 562/575 (97.7) 13 (1) L52 AJ508573 Pichia sydowiorum 564/572 (98.6) 8 (0) L53 AJ508573 Pichia sydowiorum 563/572 (98.4) 9 (0) Basidiomycetes L40 DQ640492 Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490 588/591 (99.5) 11 (0) L29 AF444704 Cryptococcus sp. CBS 8368 594/603 (98.5) 9(2) P2 AF387128 Sporidiobolus ruineniae strain IGC 5692 574/580 (98.9) 6 (0) L24 AF453938 Ustilago maydis 601/608 (98.8) 7(2) L24 L29 H2 H7 H9P2 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007218 Quá trình định danh đã dựa trên trình tự của phạm vi vùng D1/D2 của trình tự 26S rDNA theo như sự hướng dẫn của Kuztman và Robnett (1998), kết quả cho thấy 14 loài mới hoàn toàn riêng biệt dựa trên sự phân tích cây phả hệ cho sự h ình thành loài mới trong nghiên cứu này đã được tạo thành trong phạm vi vùng D1/D2 thuộc trình tự 26S rDNA cùng với các chủng đã biết gần nhất theo sự tương đồng trong ngân hàng dữ liệu gen (hình 2). Hình 2. Cây phát sinh loài c ủa 14 chủng và các loài liên quan dựa trên trình tự 26S rDNA trong phạm vi vùng D1/D1 Ngoài những dữ liệu mà sinh học phân tử cho chúng ta xác định sự phát hiện lo ài mới và loài đã biết trong ngân hàng giống và ngân hàng gen cho việc định danh vi sinh vật nói chung và nấm nem nói riêng, thì việc khảo sát các dữ liệu về h ình thái, sinh lý, và sinh hóa cũng như thông tin cấu trúc sinh học khác sẽ giống chúng ta xác định v à thông tin đầy đủ về loài mới. KẾT LUẬN Dựa trên trình tự 26S rDNA trong phạm vi vùng D1/D2, 85 chủng nấm men được xác định từ các mẫu là, hoa và phân con trùng tại Vườn Quốc gia Nam Cát Tiên tỉnh Đồng Nai theo nhóm nấm men Ascomycetous và Basidiomycetous như sau;  56 chủng là loài đã biết (21 chủng thuộc nhóm Ascomycetous v à 35 chủng thuộc nhóm Basidiomycetous) Saccharomyces cerevis iae Williopsis saturnus var. mrakii Williopsis saturnus KCTC 1724 Pichia meyerae Pichia lachancei Candida sp. CBS 5303 Pichia hampshirensis Pichia strasburgensis H5 Candida quercuum Candida sp. Candida ulmi Pichia myanmaensis Pichia anomala strain VTT C -04565 Pichia lynferdii Pichia subpelliculosa. L53 Pichia sydowiorum L52 H7 Candida naeodendra Candida diddensiae Pichia sp. ST-335 Ustilago maydis Pseudozyma prolifica Ustilago vetiveriae Cintractia sorghi-vulgaris L29 basidiomycete yeast sp. BG02-7-16-015A-1-1 Cryptococcus sp. CBS 8368 Cryptococcus sp. CBS 8365 Cryptococcus sp. CBS 8364 Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K -493 Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K -490 Cryptococcus liquefaciens strain UWFP -357 Sporidiobolus ruineniae var. ruineniae Sporobolomyces sp. TY-228 Sporidiobolus ruineniae L24 L40 P2 L5 L10 P5 L60 L67 0.05 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 219  14 chủng là loài mới (10 chủng thuộc nhóm Ascomycetous v à 4 chủng thuộc nhóm Basidiomycetous)  15 chủng chưa được xác định (8 chủng thuộc nhóm Ascomycetous v à 7 chủng thuộc nhóm Basidiomycetous) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. A. L. Demain, H. J. Phaff and C. P. Kurtzman. (1998). The industrial and agricultural significance of yeasts. In: Kurtzman C. P and Fell J. W (eds), The Yeasts, a Taxonomy Study Eleevier, Amsterdam, p. 13. 2. Graeme M. Wallker. (1998). Yeast physiology and biotechnology, pp. 1- 8. 3. Cletus P. Kurtzman and Christie J. Robnett. (1998). Identification and phylogeny of ascomycetous yeast from analysis of nuclear subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek 73, 311 -371. 4. Jack W. Fell, Teun Boelkhout, Alvaro Fonseca, Gloria Scorzetti and Adele Statzell - Tallman. (2000). Biodiversity and systematics of basidiomycetous y easts are determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (50): 1351 -1371. 5. Dao, T. L., M. Takashima, Pham, V. T., Nguyen, L. D and Nakase, T. (2000). Four new species of Kockovaella isolated from plant leaves collected in Vietnam. J. Gen. Appl. Microbiol., 46, 297-310. 6. Nagatsuka, Y., Kawasaki, H., Limtong, S., Mikata, K. and Seki, T. (2002). Citeromyces siamensis sp. nov., a novel halotolerant yeast isolated in Thailand. In t. J. Syst. Evol. Microbiol., 52, 2315 -2319. 7. Suzuki, M., Nakase, T., Daengsubha, W., Chaowsangket, M., Suyanandana, P. and Komagata. K (1987). Identification of yeasts isolated from fermented foods and related materials in Thailand. J. Gen. Appl. Microbiol ., 33, 205-220. 8. Suzuki, M., Nakase, T. and Komagata, K. ( 1994). Candida stellimalicola, a new species of anamorphic yeast isolated from star apple in Thailand. J. Gen. Appl. Microbiol., 40, 115-121. 9. Saito, K., Hasuo, T., Sugano, N., Kitamoto, K., Watanabe , S., Tadenuma, M., Nakamura, K., Sato, M., Akiyama, H., Vongsuvanlert, V., Karuwanna, P. and Kumnuanta, J. (1983) Microorganisms isolated in Thailand. Rept. Res. Inst. Brew., 155, 24-41. 10. Jindamorakot, S. (2000). Identification, preservation and polyols p roduction of halotolerant yeasts isolated in Thailand. MSc. Thesis, Kasetsart University. 225 pp. 1-225. 11. Jindamorakot, S. (2006). The species diversity of yeasts in some natural habitals of Thailand. Thesis of Graduate school, Kasetsart University 2006. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007220 12. Leda. C. M, Eli. A. T. G, Allen. N. H (1998). Yeast communities associated with sugarcan in Campos, Rio de Janeiro, Brazil. International microbiology. Vol. 1 1998, pp. 205-208. 13. Kimura, M., (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111-120. SUMARY Isolation and identification of Saccharomyces sp. collected from Cat Tien national park Ngo Duc Duy, Pham Tran To Nhu, Hoang Quoc K hanh(1), Sasitorn Jindamorakot(2) (1)Institute of Tropical Biology, (2)BIOTEC, Thailand Eighty five strains of yeasts were isolated from insect frass (5 strains), leaves (67 strains) and flowers (13 strains) which were collected from Cat Tien National Pa rk in the Southeast of Vietnam. Based on sequences of D1/ D2 domain of 26S ribosomal DNA, 39 strains belong to ascomycetous yeasts and 46 strains belong to basidiomycetous yeasts. In these study, 14 new species (16.5%) differed by 6 to 59 nucleotides, according to discussed by Kurtzman and Robnett (1998) that these strains are suggested to represent new species, 15 strains (17.6%) differed by 2 to 4 nucleotides are not yet identified and the remaining 56 strains (65.9%) were identified as known species. The eighty five species were identified as 7 genera of basidiomycetous yeasts; Cryptococcus, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Rhotosporidium, Rhodotorula, Ustilago, Pseudozyma and 4 genera of ascomycetous yeasts; Pichia, Candida, Metschnikowia and Saccharomyces . Fourteen strains assigned to new species these strains close to the genera Candida (H5, H7, L5 and L10), Pichia (H9, P5, L52, L53, L60 and L67), Sporidiololus (P2), Cryptococcus (L29, L40) and Ustilago (L24). The phylogenetic tree were constructed based on D1/D2 domain of 26S rDNA sequences of 14 new species found in this study and related species, the characteristics cell morphylogy, the production of ascospore, pseudomycelium, true mycelium and maximu growth temperature were examined. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 221 SẢN XUẤT VÀ THƯƠNG MẠI HOÁ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Trần Thạnh Phong Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Năm 2006, ngành thủy sản hướng tới mục tiêu xuất khẩu 2,8 tỷ USD . Diện tích nuôi trồng thủy sản thâm canh và bán thâm canh ở nước ta đang gia tăng nhanh, sự ô nhiễm môi trường nước ao nuôi tôm do lượng thức ăn thừa, chất thải hữu c ơ càng ngày càng nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nuôi trồng, tăng khả năng nhiễm bệnh cho tôm. Kháng sinh và hóa chất được sử dụng nhiều trong ph òng trị bệnh cho các đối tượng thủy sản nuôi trồng sẽ gây ra hiện t ượng “lờn thuốc” và sự tồn dư kháng sinh trong các mặt hàng chế biến là rào cản cho việc xuất khẩu các sản phẩm n ày. Một giải pháp đã được chấp nhận rộng rãi trên thế giới là sử dụng các chế phẩm probiotics chứa các vi sinh vật sống hữu ích có khả năng làm sạch môi trường nước ao nuôi tôm, điều chỉnh pH, giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh cho tôm. Trên thị trường hiện có nhiều chế phẩm probiotics của n ước ngoài dùng để xử lý ao nuôi tôm được đóng bao tại Việt Nam có giá thành cao. Từ thực tế trên, chúng tôi đã nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm các chế phẩm sinh học probiotics như BIOII, VEM và PB trên các ao nuôi tôm sú ở các tỉnh miền Nam . Từ kết quả đạt được, chúng tôi mạnh dạn kết hợp với các công ty sản xuất thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản để đưa các chế phẩm này ra thị trường với tên thương mại của các công ty. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Giống vi sinh vật: Các chủng Bacillus spp., Lactobacillus spp., Saccharomyces spp., Rhodopseudomonas, Rhodospirillum được phân lập và chọn lọc tại Việt Nam Thiết bị: Nồi lên men (fermenter) 100 lít, máy ly tâm siêu tốc 20,000 vòng/phút, máy sấy phun, máy đông khô, Tủ sấy tĩnh, máy xay, máy trộn siêu tốc KBC-ST-20, tủ lạnh âm ... Môi trường (MT) sản xuất chế phẩm BIOII và PB: MT dịch chiết ngũ cốc dùng sản xuất sinh khối vi khuẩn Bacillus spp; MT MRS dùng để thu sinh khối vi khuẩn Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007222 Lactobacillus spp; MT Malt - Cao nấm men dùng để thu sinh khối Saccharomyces spp; Môi trường Norbert Pfennig dùng để nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng. Sản xuất -amylase và protease: từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp lên men bán rắn. Sản xuất chế phẩm VEM: Cải tiến qui trình sản xuất EM (Effective Microorganisms) của giáo sư Teruo Higa, Nhật Bản để sản xuất VEM có mật độ vi sinh vật hữu ích : Bacillus spp., Lactobacillus spp., Saccharomyces spp. Và vi khuẩn quang hợp để tạo ra chế phẩm VEM. Sản xuất chế phẩm PB: Nuôi cấy vi khuẩn Rhodopseudomonas và Rhodospirillum trong môi trường Norbert Pfennig dưới ánh sáng mặt trời, sau 2 tuần nuôi cấy, đem đóng chai và bảo quản trong tối. Xác định các chỉ tiêu sinh hóa: Mật độ vi sinh vật bằng ph ương pháp đếm khuẩn lạc; hoạt lực -amylase bằng phương pháp Smith và Roe; hoạt lực enzym protease bằng phương pháp Anson cải tiến; Định lượng NH3-N, H2S, NO2-N bằng phương pháp so màu. Thử nghiệm hiệu quả chế phẩm BIOII tr ên ao nuôi tôm: Trên ao tôm sú 45 ngày tuổi tại các ao nuôi tôm bán thâm canh ở tỉnh B à Rịa-Vũng Tàu với nồng độ 0,2-0,5 ppm. Sử dụng chế phẩm BRF2 của Mỹ cho ao đối chứng với nồng độ 0,5 ppm. Theo d õi các chỉ tiêu như màu nước, pH, NH3-N, H2S, NO2-N và mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước ao. Thử nghiệm ở các tỉnh Kiên Giang, Tiền Giang với liều lượng 100g/1000m2/tuần, Thử nghiệm hiệu quả chế phẩm VEM tr ên ao nuôi tôm: Chế phẩm VEM được thử nghiệm trên các ao nuôi tôm t ại Bà Rịa-Vũng Tàu; theo dõi trọng lượng trung bình, tỉ lệ sống và hệ số FCR (food conversion ratio), đối chứng l à sản phẩm Pond-Clear. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chế phẩm probiotics BIOII Bảng 3.1: Thành phần chế phẩm probiotics BIOII Thành phần Định lượng Lactobacillus spp. Bacillus spp. Sacchromyces spp. -amylase Protease 109 CFU/g 1010 CFU/g 107 CFU/g 2000 UI/g 20 UI/g Kết quả thử nghiệm chế phẩm BIOII trên ao nuôi tôm Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 223 Bảng 3.2. Thử nghiệm tại Bà Rịa - Vũng Tàu Các đợt xử lý Xử lí đợt 1 (BIOII 0,2ppm; BRF20,5ppm) Xử lí đợt 2 (BIOII 0,5ppm; BRF2 0,5ppm) Xử lí đợt 3 (BIOII 0,5ppm; BRF2 0,5ppm) Xử lí đợt 4 (BIOII 0,5ppm; BRF2 0,5ppm) Thời gian (ngày) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 BIOII 1.3 1.12 1.22 0.6 1.3 0.95 0.85 1.45 0.45 0.75 0.70NH3-N (mg/l) BRF2 0.63 0.53 0.35 1.40 0.90 0.95 0.45 1.50 0.90 0.75 0.72 BIOII 0.074 0.126 0.098 0.008 0.045 0.000 0.000 0.000 0.000 0.005 0.002NO2-N (mg/l) BRF2 0.001 0.002 0.005 0.000 0.001 0.000 0.000 0.0005 0.002 0.002 0.001 BIOII 0.023 0.013 0.013 0.051 0.016 0.049 0.023 0.011 0.013 0.011 0.007H2S (mg/l) BRF2 0.031 0.023 0.020 0.067 0.005 0.002 0.001 0.002 0.002 0.002 0.002 BIOII 6083 560 340 1140 2000 700 450 270 300 300 200Vibrio (CFU/ml) BRF2 430 295 300 1350 1300 1000 500 400 300 200 200 BIOII 7.3 - 8.5 C ác ch ỉ ti êu lí hóa pH BRF2 7.6 - 8.2 Khi tăng nồng độ BIOII từ 0,2 ppm lên 0,5 ppm ở các đợt xử lí thứ 2, 3 và 4, nồng độ NH3-N, NO2-N, H2S sau 30 ngày giảm xuống ở mức cho phép. Các chỉ ti êu pH, COD ổn định, thích hợp cho sự phát triển của tôm. Mật độ Vibrio giảm còn 200 CFU/ ml bằng với ao đối chứng xử lí với BRF2 sau 30 ngày. Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BIOII (100 g/1000 m 2/tuần) trên ao tôm tại Kiên Giang, Tiền Giang Kiên Giang Tiền Giang Các chỉ tiêu Thử nghiệm Đối chứng Thử nghiệm Đối chứng Chất lượng nước Tốt, không có mùi hôi Xấu, có mùi hôi Màu nước, độ trong được cải thiện Xấu, có mùi hôi pH 7,8 - 8,1 8,5 – 9,3 7,5 – 8,3 7,5 – 9,5 Tỉ lệ bệnh Không đáng kể 15- 20% Không đáng kể 15% Năng suất (tấn/ha) 7,8 6,4 5,7 4,7 Năng suất tăng (%) 121.9 100 119,1 100 Bảng 3.3 cho thấy: Năng suất tôm b ình quân tăng từ 19,1%- 21,9% Chế phẩm VEM Bảng 3.4. Thành phần vi sinh vật trong chế phẩm VEM Vi sinh vật Chế phẩm VEM Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus spp Vi khuẩn quang dưỡng Nấm men 1x109 CFU/ml 1x1010 CFU/ml 1x105CFU/ml 1x107 CFU/ml Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007224 Thử nghiệm hiệu quả chế phẩm VEM trên ao nuôi tôm Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm chế phẩm VEM tr ên các ao nuôi tôm tại Bà Rịa-Vũng Tàu Chỉ tiêu Pond-Clear VEM Tỉ lệ sống (%) Trọng lượng trung bình (g/con) Kích cỡ tôm (Số con/kg) Sản lượng bình quân (kg/ha) Tổng lượng thức ăn (kg) Hệ số FCR 63,96 28,2 35,5 4.545 3.502 1,75 62,73 28,9 34,5 4.546 2.671 1,78 Bảng 3.5 cho thấy: trọng lượng trung bình và tỉ lệ sống của tôm thu hoạch ở hai ao sử dụng chế phẩm VEM không khác biệt nhiều so với ao sử dụng sản phẩm Pond-Clear. Chế phẩm PB Qua thử nghiệm chế phẩm PB trên các ao nuôi tôm sú, kết quả cho thấy có tác dụng phân giải thức ăn dư thừa và chất thải tích tụ dưới đáy ao, giảm BOD, COD, ổn định chất lượng nước, giúp cân bằng sinh thái, giảm tỉ lệ bệnh cho tôm. Thương mại hóa các chế phẩm dùng trong nuôi trồng thủy sản Chúng tôi đã kết hợp với các công ty thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản để thương mại hóa chế phẩm BIOII và VEM mang thương hiệu của các công ty. Bảng 3.6. Thương mại hóa chế phẩm BIOI, BIOII và VEM STT Tên sản phẩm Nguồn gốc Đối tượng Công ty sản xuất 1 NAVET Biozym BIO II Tôm, cá Thuốc thú y Trung ương 2 3 Enzym subtilis Enzymmin subtilis Bacillus subtitis Bacillus subtitis Tôm, cá Tôm, cá Thuốc thú y Sài Gòn 4 Biolactizym BIO II Tôm, cá Thuốc Thú y Long An II 5 NP-Lactizym BIO II Tôm, cá Thuốc thú y NAPHA 6 7 L-AKL B-AKL BIO II BIO II Tôm, cá, (nước kiềm) Tôm, cá, (nước phèn) CP NTTS Khánh Long 7 8 9 10 11 BACILLUS MAZAR BS@ BACTERI LASA Bacillus subtitis VEM VEM Pb VEM Tôm, cá Tôm, cá Tôm, cá Tôm, cá Tôm, cá Đat Viet Co.LTD 12 13 BIOLAS-2 BIOLAS- Pb BIOII VEM Tôm Tôm Đại Trường Sơn KẾT LUẬN Chế phẩm BIOII, PB và VEM có hiệu quả trong việc làm sạch môi trường nước ao nuôi tôm, cân bằng pH, giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh cho tôm. Năng suất tôm b ình Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 225 quân thu hoạch tăng 19,1 % - 21,9% so với sản phẩm BRF2, hệ số FCR thấp h ơn so với sản phẩm Pond-Clear, trong khi giá thành của chế phẩm BIOII thấp hơn gần 10 lần. Chúng tôi đã kết hợp với các công ty thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản để thương mại hóa chế phẩm BIOII và VEM mang thương hiệu của các công ty. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Havenaar, R., Ten Brisk, B., Selection of strains for probiotic use . In: R. Fuller (ed.), Probiotics the scientific basic, Chapman and Hall, Londo n. P. 209-224, 1992. 2. Võ Thị Hạnh và cs (2003). Nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi tr ồng thủy sản. Báo cáo nghiệm thu đề tài, Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM SUMMARY Production and commercialize the bio-products using for aquaculture Vo T Hanh, Le Bich Phuong, Tran Thanh Phong, Le Tan Hung, Truong T Hong Van Institute of Tropical Biology The bioproducts such as BIOII, VEM and PB have been studying and producing; these bioproducts have been using for aquaculture effectively. The BIOII and VEM had effect on cleaning water, pH stability, reducing pathogenic bateria on shrimp. The average yield increased 19,1% - 21,9% compared with BRF2 products, FCR (food conversion ratio) lowered compared with Pond-Clear product, meanwhile, price of BIOII lower 10 times BRF2. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007226 GIẢM THIỂU Ô NHIỄM MÙI HÔI CHUỒNG TRẠI VÀ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH TỪ PHÂN CHUỒNG BẰNG CHẾ PHẨM SINH HỌC Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Ngành chăn nuôi Việt Nam đang chuyển dần từ chăn nuôi truyền thống, phân tán, quy mô nhỏ sang chăn nuôi trang trại (TT), tập trung, qui mô lớn và sản xuất hàng hoá chất lượng cao. Tuy nhiên, trong quá trình phát tri ển, chăn nuôi trang trại đã bộc lộ một số hạn chế như: phát triển tự phát, thiếu quy hoạch. Trong đó vấn đề ô nhiễm môi trường cần phải được quan tâm. Ở các TT chăn nuôi heo, lượng phân và nước thải thải ra với khối lượng rất lớn (khoảng 5 tấn/ 15.000 đầu heo), phân tươi được bán với giá rẻ (khoảng 5.000 đồng/ 40 kg). Do không được xử lý hoặc xử lý không đúng cách đ ã gây ô nhiễm mùi hôi cho khu vực lân cận. Do đó, chúng tôi đưa ra giải pháp sử dụng chế phẩm VEM-K làm giảm mùi hôi; chế phẩm BIO-F dùng sản xuất phân vi sinh từ phân v à nước thải. Các chế phẩm sinh học trên chứa tập đoàn vi sinh vật hữu ích được phân lập và chọn lọc, chịu được điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng Việt Nam, do vậy không phải phụ thuộc v ào nguồn giống vi sinh của nước ngoài. Qua giải pháp trên, chúng đã nhận được giải thưởng “Ngày sáng tạo Việt Nam” với chủ đề “Hành động vì môi trường” do Ngân hàng Thế giới tại Việt Nam tổ chức năm 2005. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Giống vi sinh vật: Các chủng Bacillus spp., Lactobacillus spp., nấm men Saccharomyces spp., Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, xạ khuẩn Streptomyces sp. và nấm sợi Trichoderma sp được phân lập và chọn lọc tại Việt Nam Sản xuất chế phẩm VEM -K: Cải tiến qui trình sản xuất EM (Effective Microorganisms) của giáo sư Teruo Higa, Nhật Bản để sản xuất VEM-K có mật độ vi sinh vật hữu ích cao và khoáng đa vi lượng dễ tan. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 227 Thử nghiệm chế phẩm VEM -K trên heo, gà và sản xuất phân vi sinh theo sơ đồ sau: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chế phẩm VEM-K Bảng 3.1. Thành phần vi sinh vật trong chế phẩm VEM -K Chế phẩm VEM-K được thử nghiệm trên heo thịt giai đoạn từ 20 kg đến 50 kg, tại trại heo Gia Kiệm ở tỉnh Đồng Nai . Kết quả theo dõi các chỉ tiêu sau 55 ngày cho uống (1lít VEM-K/500 lít nước sạch) ghi nhận được ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm VEM -K (1lít/500 lít nước sạch) trên heo thịt. Chí tiêu theo dõi Lô thí nghiêm Lô đối chứng Chênh lệch sovới đối chứng Trọng lượng trung bình đầu vào (Kg) 19,10 19,30 -0,20 Tổng trọng lượng của lô đầu vào (Kg) 191,00 193,00 -2,00 Trọng lượng trung bình đầu ra (Kg) 48,10 42,70 5,40 Tổng trọng lượng của lô đầu ra (Kg) 481,00 427,00 54,00 Tổng tăng trọng/lô (Kg) 290,00 234,00 56,00 Tăng trọng bình quân/con (Kg) 29,00 23,40 5,60 Tiêu thụ thức ăn bình quân/ngày (Kg) 0,99 0,90 0,09 Tổng lượng thức ăn tiêu thụ/lô (Kg) 546,50 493,00 53,50 FCR (Kg thức ăn/kg thể trọng) 1,88 2,11 -0,23 Tăng trọng tuyệt đối (g/con/ngày) 527,30 425,50 101,80 Thời gian nuôi (ngày) 55,00 55,00 0 Vi sinh vật Chế phẩm VEM-K Lactobacillus spp. Bacillus spp Saccharomyces spp. Vi khuẩn quang dưỡng Khoáng dễ tiêu 109 CFU/ml 1010 CFU/ml 107 CFU/ml 105 CFU/ml 500 mg/ml VEM pha loãng Cho heo, gà uống hằng ngày Phân giảm mùi hôi của Xử lý bằng chế phẩm BIO-F Phân hữu cơ vi sinh Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007228 Kết quả bảng 3.2 cho thấy, chỉ tiêu tăng trọng bình quân tăng 20% và chỉ tiêu tiêu tốn thức ăn ở lô thí nghiệm giảm 11% so với đối chứng, mùi hôi của phân và ruồi nhặng ở lô thí nghiệm ít hơn và phân thải của heo ở lô thí nghiệm rắn h ơn so với lô đối chứng. Chế phẩm VEM-K được thử nghiệm trên gà (giống HIGRO, trang trại Trần Quốc Tuấn, xã Mỹ Xuân, Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu) với liều lượng 1lít VEM-K/1000 lít nước sạch rồi cho khoảng 4000 con gà giai đoạn từ 21 đến 39 ngày tuổi uống. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu tăng trọng bình quân và tỷ lệ tiêu tốn thức ăn sau thời gian cho uống được ghi nhận trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm chế phẩm VEM -K (1lít/1000 lít nước sạch) trên gà. STT Chỉ tiêu thí nghiệm Lô đối chứng Lô thí nghiệm 1 Số lượng gà thí nghiệm bắt đầu (con) 3522 (100%) 3518 (100%) 2 Trọng lượng bình quân lúc 21 ngày tuổi (g/con) 765 766 3 Tăng trọng bình quân (g/con/ngày) 75,83 80,0 4 Trọng lượng cuối kỳ (g) 2130 2206 5 Tiêu tốn thức ăn (FCR = Kg thức ăn/kg thể trọng) 1,88 1,80 6 Tỷ lệ sống (%) 98,18 98,49 7 Thời gian thí nghiệm (ngày) 18 18 Bảng 3.3 cho thấy, các chủng vi sinh giúp tăng trọng bình quân tăng 5,5%, giảm lượng thức ăn tiêu tốn, những con gà được uống VEM-K hàng ngày có tỷ lệ tiêu tốn thức ăn là 1,80 so với những con không được uống VEM-K (1,88). Sản xuất phân vi sinh (PVS) Phân chuồng được xử lý ẩm độ, sau đó ủ với chế p hẩm BIO-F. Sau ba ngày, các vi sinh vật hữu ích nói trên bắt đầu phát triển mạnh, phân giải các hợp chất hữu c ơ và làm mất mùi hôi. Nhiệt độ trong khối ủ cũng tăng l ên tới 60-700C, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh và trứng giun trong phân. Sau 7 -10 ngày, sản phẩm thu được là phân bón vi sinh chất lượng cao. Bảng 3.4. Các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm phân bón HCVS Chỉ tiêu Hàm lượng Chỉ tiêu Hàm lượng Ẩm độ(%) Ntổng số (%) P2O5 (%) K2O (%) Humic acid (%) Mùn, chất hữu cơ (%) 25 0,78 1,06 0,61 2,61 4,65 Trichoderma spp. Bacillus spp. Streptomyces spp. 107 CFU/g 107 CFU/g 108 CFU/g Loại phân bón hữu cơ vi sinh nói trên có giá thành chưa t ới 1.000 đồng/kg. Thử nghiệm PVS trên cây con dưa leo Sản phẩm phân HCVS được Bộ môn Bảo vệ thực vật, Tr ường Đại học Nông lâm Tp. HCM thử nghiệm trên ruộng dưa leo. Kết quả được ghi nhận như sau: Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 229 Tỉ lệ (%) bệnh héo cây con dưa leo sau 25 - 30 ngày gieo hạt là 0 - 1% thấp hơn so với đối chứng (3-3,5%). Loại nấm gây bệnh chết được xác định là Fusarium sp. Chiều cao (18,43cm) và số lá (6,2/cây) của cây dưa leo trên các nghiệm thức thí nghiệm ở giai đoạn 24 - 31 ngày sau gieo hạt tăng so với đối chứng (chiều cao: 17,56cm, số lá: 5,44/cây) Thương mại hóa chế phẩm VEM-K và BIO-F Chúng tôi đã kết hợp với các công ty thuốc thú y và công ty sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thương mại hóa chế phẩm VEM-K và BIO-F mang thương hiệu của các công ty. Bảng 3.7. Thương mại hóa chế phẩm VEM-K và BIO-F STT Tên sản phẩm Nguồn gốc Đối tượng Công ty sản xuất 1 BIOLAS-789V VEM-K Heo, gà Công ty TNHH - TMSX Đại Trường Sơn 2 3 4 MAZAR BS@ LASA VEM-K VEM-K VEM-K Heo, gà Đat Viet Co.LTD 5 Phân hữu cơ vi sinh BIO-F Cây mía Nhà Máy đường Tây Ninh 6 Phân vi sinh Tricho BIO-F Cây hoa màu Công Ty TNHH TM & SX Mai Xuân - Tp. HCM 7 Phân hữu cơ vi sinh BIO-F Cây hoa màu CTy Giống cây trồng Đông Tây - Tp. HCM 8 Phân hữu cơ vi sinh BIO-F Cây công nghiệp Công Ty Hoàng Thành - Đaklak KẾT LUẬN Từ các phụ phế phẩm công nông nghiệp v à các chủng vi sinh vật chọn lọc được, sản xuất được chế phẩm VEM-K và chế phẩm BIO-F. Chế phẩm VEM-K được thử nghiệm trên heo thịt (1 lít VEM-K/500 lít nước sạch) cho heo uống trong 30-60 ngày, kết quả heo tăng trọng trung bình tăng 20%, sự tiêu hao thức ăn giảm 11%; và trên gà (1lít VEM-K/1000 lít nước) cho gà uống, gà tăng trọng trung bình tăng 5,5%, sự tiêu hao thức ăn giảm 4,4%; cả trên heo và gà, VEM - K có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh đường ruột và giảm mùi hôi của phân. Phân hữu cơ vi sinh được sản xuất từ phân chuồng và BIO-F có tác dụng giảm tỉ lệ bệnh héo cây con dưa leo do Fusarium sp., giúp cây tăng trư ởng về chiều cao và số lá nhanh so với đối chứng. Với quy trình đơn giản, rẻ tiền có thể áp dụng đại tr à cho các trại chăn nuôi công nghiệp với đàn heo từ 10.000 - 100.000 con. Ngoài ra, quy trình còn có th ể áp dụng cho các hộ chăn nuôi với quy mô gia đ ình từ nhỏ hơn 2.000 con. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fuller R. (1989). Probiotic in man and animal, J. Applied. Bacteriol. 66: 365 -378 2. Havenaar, R., Ten Brisk, B. (1992). Selection of strains for probiotic use . In: R. Fuller (ed.), Probiotics the scientific basic, Chapman and Hall, London, pp209 -224 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007230 3. Võ Thị Hạnh và cs (2003). Nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi tr ồng thủy sản. Báo cáo nghiệm thu đề tài, Sở Khoa học và Công nghệ THCM 4. Thomashow LS., (1996). Biological control of plant root pathogens. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 343-347 5. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân (2004), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm BIO -F dùng phòng trị nấm bệnh hại cây trồng và sản xuất phân bón vi sinh, Giải III Hội thi Sáng tạo Khoa học Kỹ thuật tỉnh Bình Dương 6. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng và Trần Thạnh Phong, Dự án “Giảm thiểu ô nhiễm mùi hôi và sử dụng phân chuồng sản xuất phân bón vi sinh chất lượng cao tại trang trại nuôi heo”, Giải th ưởng Ngày sáng tạo Việt Nam" năm 2005 do Ngân hàng Thế giới tổ chức. SUMMARY Reducing odour pollution at farms and producing biofertilizer from manure by bio -products Vo Thi Hanh, Le Thi Bich Phuong, Tran Thanh Phong, Le Tan Hung, Truong Thi Hong Van Institute of Tropical Biology The VEM-K and BIO-F bioproducts are produced from agri -industrial by-products and selected useful microorganisms. The VEM -K product prevent livestock and poultry from intestinal diseases and reduce bad odour pollution at farms compared with controls. By using biofertilizer produced from manure and BIO -F, the result of test showed that the disease ratio on young cucumber caused by Fusarium s p. and other pathogenetic fungi decreased and the growth of cucumber better compared with control. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 231 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus SINH TỔNG HỢP polyhydroxybutyrate (PHB) Nguyễn Duy Long, Phạm Trần Tố Nh ư, Nguyễn Minh Nhựt, Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Polyhydroxybutyrate (PHB) là m ột dạng polymer thuộc họ Polyhydroxyalkanoate (PHA). Các polymer thuộc họ PHA đều có khả năng phân hủy bằng con đ ường sinh học. Tuy nhiên, với đặc tính ưu việt của PHB có độ bền vật lý cao, nhiệt độ nóng chảy 171-1820C, độ bền với tia uv tốt , các đặc điểm này gần như tương đồng với các loại polymer thông dụng như PP (polypropylene), PE (polyethylene) [4]. PHB được tổng hợp và tích lũy trong vi sinh vật rất đa dạng, sự tích l ũy này xảy ra trong điều kiện giới hạn của nguồn dinh dưỡng và sự dư thừa của nguồn carbon. PHB đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp trên Alcaligenes eutrophus bởi công ty ZENECA [ 2] được dùng làm bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, làm vỏ bọc cho thuốc dược, làm chất đệm và thay thế xương trong giải phẫu, Tuy nhiên việc giảm giá thành cho sản xuất ở quy mô lớn vẫn còn là một vẫn đề đang được quan tâm và nghiên cứu. Các nghiên cứu tập trung vào thay đổi công nghệ, điều kiện lên men, kỹ thuật di truyền và sự đa dạng PHB trong thế giới vi sinh vật. Lactobacillus l à một vi khuẩn được sử dụng trong các quy tr ình lên men sản xuất acid lactic, lên men rau, củ quả… trong một số kết quả nghi ên cứu cho thấy sự tích lũy PHB trong các loài Lactobacillus trong tự nhiên có thể đạt đến hơn gần 30% [5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn lọc các chủng Lactobacillus từ các nguồn l ên men thực phẩm, khảo sát các điều kiện dinh d ưỡng và điều kiện ly trích hiệu quả cho quá trình thu hồi PHB từ vi sinh vật. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn Yaourt, đậu n ành ngâm, các loại dưa muối chua, nem chua, sữa lên men, một số loại rau quả, ngũ cốc lên men…[1] trên môi trường MRS agar và nuôi cấy trên MRS Broth, môi trường Elliker (pepton 10g, cao nấm men 5g, dextrose 5g, saccharose 5g, NaCl 1,5g, acid ascorbic 0,5g, nước cất 1000ml) và môi trường dịch chiết cà chua (dịch chiết cà chua 20g/l, glucose 10g/l). Quá trình xác định các chủng Lactobacillus đ ược thực hiện trên môi trường carbonat agar, quan sát hình thái, xác định khả năng lên men glucose (peptone 10g, NaCl 5g, cao thịt 1g, glucose 10g, nước cất 1000ml, phenol red 0.018g), xác định khả năng sinh acid lactic bằng thuốc nhuộm Uphenmen, quan sát h ình thái, nhuộm gram và thực hiện phản ứng “String test” [1] xác định gram vi khuẩn. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007232 Các khuẩn lạc Lactobacillus trên các môi trường MRS agar, Elliker agar, dịch chiết cà chua agar được nhuộm với Sudan Black B để xác định khả năng sinh tổng hợp PHB. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB tr ên nguồn carbon glucose 1%. sucrose 2%, lactose 2%, manitol 1%, hỗn hợp nguồn carbon (môi trường Elliker), dịch chiết cà chua và nguồn nitơ peptone, cao nấm men, (NH4)2SO4 0,4 % và glycine 2% [6, 7, 9, 10]. PHB được li trích và xác định hàm lượng theo phương pháp Law Slepecky [14], quá trình khảo sát các điều kiện li trích PHB đ ược thực hiện với Sodiumhypochlorite 5% và SDS 3% dưới hàm lượng thay đổi của tỉ lệ sinh khối từ 0.5% đến 6% (w/v). Đồng thời khảo sát các điều kiện nhiệt độ li trích từ 40 0C - 900C, theo thời gian từ 20 phút - 120 phút. KẾT QUẢ 1. Kết quả phân lập và xác định PHB trong tế bào vi khuẩn lactic Từ kết quả phân lập, 78 chủng vi khuẩn lactic đ ã được chọn lọc cho nghiên cứu khả năng tích lũy PHB. Đa số các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic, gram dương, hiếu khí tùy ý, catalase âm tính, có kh ả năng lên men glucose với 57 chủng Lactobacillus được xác định. Các chủng còn sót hiện diện của PHB trong tế bào khi kiểm tra với thuộc nhuộm Sudan Black B là 30 chủng chiếm 38,5% trong toång soá vi khuẩn lactic phân lập nên. [bảng 1, hình 1, 2]. Hình 1. Kết quả nhuộm gram và hình thái một số chủng vi khuẩn lactic. H1a. Đối chứng: E.coli (gram âm) bắt màu thuốc nhuộm bổ sung nên có màu hồng, B. subtillis (gram dương) giữ được phức màu giữa tím kết tinh và glugol nên có màu tím. H1b, c, d, e, f: là kết quả nhuộm gram của các chủng N8, CK1, B3, DG5, M1. Hình 2. Kết quả định tính PHB; 2a: DG5, 2b: DG5 + E.coli, 2c PHB from DG5 1a 1b 1c 1d 1e 1f 2b2a 2c Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 233 Bảng 1: Kết quả phân lập và xác định sự hiện diện PHB trong tế bào vi khuẩn. [*]: kết quả dương tính của khuẩn lạc với thuốc nhuộm Sudan Black B Nguồn phân lập Lactobacillus Pediococcus Streptococcus Entorococcus Chưa xác định Dưa cải chua C1, C2,C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14*, C15*, C16*, C17, C18, C19 C9, C11 Ya-ua Y3, Y4,Y5, Y7 Y2* Y1, Y6 Đậu nành N1*, N3, N4*, N5*, N6*, N7*, N8*, N9* N2 Dưa kiệu CK1*, CK2*, CK3*, CK4*, CK6* CK5, CK7 Dưa giá DG1*, DG5*, DG6, DG7, DG8 DG2, DG3*, DG4* Nem chua NC1*, NC2*, N3C*, NC4*, NC5*, NC6*, NC7, NC8 Dưa cà F3, F6, F7*, F8* F1*, F2*, F4, F5 Ngó sen chua S5 S3 Dưa hành CH1*, CH2* Phân trẻ sơ sinh B41, B3* BB8 Mẻ M1*, M2 2. Kết quả khảo sát nguồn dinh d ưỡng ảnh hưởng đến khả năng tích lũy PHB trong tế bào Các chủng vi khuẩn cho kết quả dương tính cao DG5, M1, N8, CK1, B3, N1, NC3, NC4, DG4, N4, CH5, N9 và NC2 đư ợc chọn để xác định hàm lượng PHB trong tế bào. Qua kết quả thí nghiệm, chủng DG5, N8 v à M1 cho hàm lượng PHB cao hơn các chủng còn lại tương ứng 27.870 %, 26.230% và 26.600% theo trọng lượng khô tế bào và được chọn làm đối tượng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo. Hầu hết 3 chủng đều thích hợp với glucose cho sự sinh tổng hợp PHB. Tuy nhi ên, đối với chủng M1 đạt hàm lượng PHB 32,302% trong môi tr ường bổ sung lactose, peptone là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp PHB, chủng DG5 đạt h àm lượng PHB cao nhất với peptone 27,870% (h ình 3 và hình 4) Hình 3: Ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự sinh tổng hợp PHB: 3a; DG5, 3b; M1, 3c; N8 Hình 4: Ảnh hưởng của nguồn nito tới sự sinh tổng hợp PHB: 4a; DG5, 4b; M1, 4c; N8 DG5 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Peptone yeast extract NH42SO4 glycyne PH B (% ) 0 5 10 15 20 25 30 Si nh k ho ái( g) sinh khoái PHB M1 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Peptone yeast extract NH42SO4 glycyne PH B (% ) 0 5 10 15 20 25 30 Si nh k ho ái( g) sinh khoái PHB N8 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Peptone yeast extract NH42SO4 glycyne PH B (% ) 0 5 10 15 20 25 30 Si nh k ho ái (g ) sinh khoái PHB 4a 4b 4c Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007234 3. Kết quả khảo sát điều kiện li trích PHB Ảnh hưởng của tác nhân li trích: Sodiumhypochlorite (SH) 5%, Sodiumdodecylsulfate (SDS) 3% được sử dụng làm tác nhân phá vỡ tế bào theo hàm lượng sinh khối. Đối với tác nhân sodiumhypochlorite cho hi ệu suất phá vỡ tế bào cao nhất ở hàm lượng 1% sinh khối tế bào đạt 85,635% và thu được 32,865 % PHB theo trọng l ượng khô tế bào. Đối với tác nhân SDS 3% cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất ở hàm lượng 5% sinh khối tế bào đạt 85,124% và thu được 34,635 % PHB theo trọng l ượng khô tế bào. Tác nhân SDS 3% có khả năng ly trích PHB ở h àm lượng sinh khối cao hơn tác nhân Sodiumhypochlorite 5%. Ảnh hưởng của nhiệt độ li trích: Thí nghiệm đ ược thực hiện với 2 tác nhân sodiumhypochlorite và SDS theo dãy nhiệt độ từ 400C đến 900C. Đối với tác nhân sodiumhypochlorite đạt hàm lượng PHB cao nhất (32,182 %) tại 600C với hiệu suất phá vỡ tế bào 85,462%. Đối với tác nhân SDS đạt hàm lượng PHB cao nhất (35,623%) tại 800C với hiệu suất phá vỡ tế bào 85,253% [hình 6]. Kết quả cho thấy, đối với tác nhân Sodiumhypochlorite 5% nhiệt độ càng cao quá trình phá vỡ tế bào càng giảm đối với các chủng lactobacllus. Ngược lại, hiệu suất phá vỡ tế bào càng mạnh khi nhiệt độ tăng lên đối với tác nhân SDS 3% , tuy nhiên lại ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc của PHB và cho hàm lượng thấp xuống. Hình 5: Khảo sát sự phá vỡ tế bào với tác nhân sodiumhypochlorite 5% v à SDS 3% theo hàm lượng sinh khối tế bào Hình 6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá tr ình li trích PHB với tác nhân sodiumhypochlorite 5% v à SDS 3% S od ium hypoch lo rite - S DS 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0.50% 1% 2% 3% 4% 5% 6% Sinh kho ái (% ) P H B )% ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 H ie äu su aát PH B(% )-SH 5 % H ie äu su aát (% )-SH 5 % PH B(% )-SD S 3 % H ie äu su aát (% )-SD S 3 % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 40 50 60 70 80 90 N hie ät ñ o ä (o C ) P H B )% ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 H ie äu su aát PH B(% )-SH 5 % H ie äu su aát (% )-SH 5 % PH B(% )-SD S 3 % H ie äu su aát (% )-SD S 3 % Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 235 Ảnh hưởng của thời gian li trích: Thời gian trong quá tr ình ly trích PHB được thiết lập trong khoảng thời gian từ 20 phút đến 120 phút cho 2 tác nhân Sodiumhypochlorite tại nhiệt độ 600C và SDS tại 800C. Kết quả khảo sát cho thấy quá tr ình ly trích PHB với tác nhân Sodiumhypochlorite đ ạt hàm lượng PHB cao nhất tại thời điểm 60 phút ly trích với 32,246% PHB, hiệu suất ly trích là 85,642% và với tác nhân SDS đạt hàm lượng PHB cao nhất tại thời điểm 80 phút ly trích với 34,575 % PHB, hiệu suất ly trích là 95,563% (hình 7). Hình 7: Khảo sát thời gian li trích ảnh h ưởng đến quá trình li trích PHB với tác nhân sodiumhypochlorite 5% và SDS 3% KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi có một số nhận xét như sau: Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp PHB, đã phân lập được 78 chủng vi khuẩn lactic với h ơn 50 chủng thuộc nhóm Lactobacillus . Các chủng có sự hiện diện của PHB trong tế b ào là 30 chủng chiếm 38,5% trong tổng số vi khuẩn lactic phân lập đ ược. Trong đó chủng DG5, M1, N8 đã có khả năng sinh tổng hợp PHB cao nhất. Glucose v à peptone là 2 nguồn dinh dưỡng thích hợp cho cả 3 chủng D G5, M1 và N8 sinh tổng hợp PHB. Riêng chủng M1 đường lactose hoc ho hàm lượng cao hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy với môi trường dịch chiết cà chua bổ sung 1% glucose cũng thích hợp cho quá tr ình sinh tổng hợp PHB của cả 3 chủng. Đề t ài nghiên cứu đã xây dựng được quá trình tách chiết PHB dựa trên 2 tác nhân Sodiumhypochlorite 5% và SDS 3 %. Quá trình tách chiết với tác nhân Sodiumhypochlorite 5% thích h ợp ở hàm lượng sinh khối tế bào là 1%, nhiệt độ ly trích 600C và thời gian ly trích là 60 phút. Đối với quá trình tách chiết bằng tác nhân SDS 3% thích hợp với hàm lượng sinh khối là 5%, nhiệt độ ly trích là 800C và thời gian ly trích là 80 phút. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Thị Thu Lý (2003). Phân lập và chọn giống vi khuẩn lactic để l àm yaourt đậu nành. Luận văn Thạc sỹ sinh học. Đại học Khoa học Tự nhi ên - TPHCM. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 20 40 60 80 100 120 phuùt PH B )% ) 0 20 40 60 80 100 120 H ie äu su aát PHB(%)-SH 5%- Hieäu suaát (%)-SH 5% PHB(%)-SDS 3% Hieäu suaát (%)-SDS 3% Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007236 2. Kolybaba M. A.. Tabil L. G.. Panigrahi S. A. (2004). Recent Developments in the Biopolymer Industry. The society for Engineering in agricultural food and biological systems. pp. MB04 - 301. 3. Law. John H. & RalpH A. Splepecky (1960). Assay of Poly--hydroxybutyric acid. J. Bacterial. Vol. 82. pp. 33 - 36. 4. Lee S. Y. (1996). Bacterial Polyhydroxyalkanoate. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 49. pp. 1 - 14. 5. Liddell J. M. (1999). Process for the recover y of polyhydroxyalkanoic acid. United states Patent. Patent Number 5894062. 6. Luengo J. M.. Garcia B.. Sandoval A.. Naharro G. and Olivera E. R. (2003). Bioplastics from microorganisms. Current Opinion in Microbiology . Vol. 6. pp. 251-260. 7. Mahishi L. H.. Tripathi G.. Rawal S. K. (2003). Poly (3--hydroxybutyrate) synthesis by recombinant Escherichia coli harbouring Streptomyces aureofaciens PHB biosynthesis genes: Effect of various carbon and nitrogen sources. Microbial Research. Vol. 158. pp. 19 - 27. 8. Saledizadeh. Loosdrecht (2004). Production of polyhyd roxyalkanoates by mixed culture: Recent trends and biotechnological importance. Biotechnology Advances. Vol. 22. pp. 261 - 279. 9. Steinbuchel A. (1996). PHB and Other Polyhydroxyalkanoic Acids. Biotechnology. Vol. 6. pp 403 - 464. 10. Ugur. Sahin. Beyati (2002). Accumulation of Poly -- hydroxybutyrate in Streptomyces Species: During Growth with Different Nitrogen Sources. Tur J Biol. Vol. 26. pp. 171 - 174. SUMMARY Screening of lacyobacillus strains for biosynthe sis of polyhydroxybutyrate (PHB) Nguyen Duy Long, Phạm Tran To Nhu, Nguyen Minh Nhut, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology In this study, we found 3 Lactobacillus strains (DG5, M1, N8) with a h igher concentration of PHB than 78 strains collected with 27.87%, 26.23%, 26.60% corresponding. Glucose and peptone are investigated and determined as nutrient factor for produce PHB. For the accumulation of PHB from DG5, M1, and N8, the tomato extract solution was found as a cheeper nutrient resourse to produce PHB. The processing of PHB extraction was followed by Sodiumhypochlorite (SH) 5% in cell mass 1% at 600C during 60 minutes and Sodiumdodecylsulphate (SD Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 237 PHÂN LẬP VÀ THU NHẬN enzym phytase TỪ MỘT SỐ NẤM MỐC Aspergillus TRÊN MÔI TRƯỜNG NÊN MEN BỀ MẶT Nguyễn Duy Long, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, Ho àng Quốc Khánh Phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Photpho là nguyên tố thiết yếu cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của động vật. Tuy nhiên, có khoảng 60-75% photpho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức ăn của động vật được tìm thấy ở dạng phytat (inositol hexaphosphat) hoặc axit phytic. Động vật không thể hấp thụ photpho trong phyta t vì chúng không có enzym phytase trong đường ruột. Vì thế phần lớn photpho được tìm thấy trong phân của động vật. Ngoài ra những chất dinh dưỡng khác như protein, Fe2+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ cũng sẽ bị liên kết vào cấu trúc của axit phytic. Do đó cơ thể động vật không thể hấp thụ được các ion này. Photpho trong phân của động vật được hấp thụ vào đất, chúng cần thiết cho sự phát triển của thực vật. L ượng photpho dư thừa không được cây hấp thụ sẽ bị cuốn trôi ra ao, hồ, sông, suối kích thích sự phát triển của phiêu sinh thực vật (tảo) gây ra hiện tượng phú dưỡng hoá. Ngoài ra, sự thiếu hụt oxy sẽ làm cá chết và giảm sự đa dạng của hệ sinh vật có lợi trong n ước. Phytase là một trong số các enzym hiện đang rất đ ược quan tâm. Phytase thủy phân liên kết giữa photpho và vòng phytat sẽ phóng thích photpho vô cơ. Việc bổ sung phytase vào thức ăn gia súc giúp tận dụng tối đa nguồn photpho trong các loại nguy ên liệu chế biến vì hệ vi sinh vật đường ruột của động vật hầu như không có khả năng sinh tổng hợp phytase, và đồng thời giúp giảm chi phí bổ sung lượng photpho vô cơ cần thiết vào thức ăn gia súc. Hơn thế nữa, phytase còn giúp giảm thiểu ô nhiễm photpho vào môi trường do chất thải động vật. Enzym phytase được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn nhưng nhiều nhất vẫn là trên các loại nấm mốc đặc biệt là Aspergillus sp. vì khả sinh tổng hợp enzym phytase cao và có thể chịu được pH thấp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng Aspergillus được phân lập từ các loại men rượu (men cơm rượu, men rượu) và một số chủng Aspergillus khác (A.aculeatus, A.awamori, A.carbonarius, A.ellipticus, A.ficuum, A.flavus, A.niger NRRL-363, A.ochraceus A175, A.oryzae, A.phoenisis, A.tubingensis) từ bộ sưu tập giống của phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới trên môi trường PGA . Quá trình nuôi cấy và tách chiết enzyme phytase được thực hiện theo quy trình dưới (Hình 1). Enzym phytase được phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. Hoạt tính enzym phytase được xác định trên cơ chất sodium phytate (một đơn vị hoạt tính phytase (U) được định nghĩa là lượng phytase giải phóng được 1 µmol photphat vô cơ trong Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007238 một phút từ sodium phytat ở 37oC, pH5,5). Quá trình khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính enzym phytase được thực hiện trong dải nhiệt độ từ 30-950C, trong đệm Glycin: 2,5pH, trong Sodium acetat: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5, trong đệm Imidazol-HCl: 6,0; 6,5; 7,0, trong đệm Tris-HCl: 7,5; 8,0; 8,5; 9,0. Enzym phytase được phân tích trên gel polyacrylamide theo phương pháp SDS -PAGE. KẾT QUẢ 1. Phân lập nấm Aspergillus từ men rượu Trong số 14 loại men rượu thu nhận từ các nơi khác nhau cho thấy sự phân bố các chủng nấm mốc không có sự khác biệt nhiều. trong đó chúng tôi đ ã xác định được 4 chủng nấm mốc khác biệt nhau rõ rệt về hình thái là Aspergillus.MCR1 (hình 2.1; 2.2; 2.3), Aspergillus.MCR2(hình 3.1; 3.2; 3.3), Aspergillus. MR5 (hình 4.1; 4.2; 4.3), Aspergillus.MR2 (hình 5.1; 5.2; 5.3), Ống PGA giữ giống Aspergillus + 5ml nước cất vô trùng Hút 1ml dung dịch bào tử vào các bình lên men bề mặt (Trấu:Bột m ì:Khoáng)[Tỉ lệ Trấu:Bột mì 1:2, 60% Khóang] 370C, 2 ngày Bổ sung 200ml dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.5 Lắc 200rpm, 3h Lọc dịch qua vải mỏng Dịch chiết enzym thô Cấy truyền sang các ống nghiệm PGA Hình 1: Quy trình lên men bề mặt aspergillus sinh tổng hợp enzyme phytase Hình 2.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MCR1; X 6 Hình 2.1. Hình thái chủng MCR1 mọc trên môi trường PGA Hình 2.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MCR1 (conidia); X 100 Hình 3.2. Hình thái và kích thước conidiophores chủng MCR2; X 6 Hình 3.1. Hình thái chủng MCR2 mọc trên môi trường PGA Hình 3.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MCR2 (conidia); X 100 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 239 Hình 4.1. Hình thái chủng MR5 mọc trên môi trường PGA Hình 4.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MR5; X 6 Hình 4.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MR5 (conidia); X 100 Hình 5.1. Hình thái chủng MR2 trên môi trường PGA Hình 5.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MR2 (conidia); X 100 Hình 5.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MR2; X 6 2. Xác định hoạt tính enzyme phytase của các chủng Aspergillus Trong 4 chủng được phân lập từ các loại men th ương mại, có 3 chủng Aspergillus có khả năng sinh phytase là A.MCR2, A.MR2, A.MR5 và 1 chủng không sinh phytase là A.MCR1. Trong số 3 chủng có hoạt tính phytase th ì A.MR2 cho hoạt tính cao nhất. Ngoài ra, 1 chủng trong Bộ sưu tập giống- Phòng Vi sinh ứng dụng cũng không có khả năng sinh phytase là A.ochraceus. Hai chủng Aspergillus cho hoạt tính phytase cao nhất là A.niger NRRL-363 và A.oryzae. A.niger NRRL-363 có hoạt tính tổng (Ut) cao hơn A.oryzae nhưng A.oryzae lại cho hoạt tính riêng cao hơn. Enzyme từ các chủng còn lại có hoạt tính trung bình hoặc thấp (hình 6a, 6b). Đối với A.flavus, một loại nấm mốc sinh độc tố anfatocin cũng có khả năng sinh enzym phytase, do đó cần t hận trọng trong việc tuyển chọn nấm mốc. Từ các chủng tr ên, chọn ra 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 cho hoạt tính phytase cao nhất để khảo sát phổ nhiệt độ, pH. 3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme phytase Từ đồ thị cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính phytase cao đối với cả 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 là 50-550C so sánh với các kết quả đã nghiên Hình 6a: Hoạt tính tổng Ut (U/g mẫu) của các chủng nấm mốc 0 50 100 150 200 250 300 Chuûng H oa ït tí nh t oån g U t (U /g m aãu ) A.MCR1 A.MCR2 A.MR5 A.MR2 A.aculeatus A.awamori A.carbonarius A.ellipticus A.ficuum A.flavus A.niger NRRL-363 A.ochraceus A175 A.oryzae A.phoenicis A.tubingensis Ñoái chö ùng 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Chuûng H oa ït tí nh r ie ân g U s (U /m g m aãu ) A.MCR1 A.MCR2 A.MR5 A.MR2 A.aculeatus A.awamori A.carbonarius A.ellipticus A.ficuum A.flavus A.niger NRRL-363 A.ochraceus A175 A.oryzae A.phoenicis A.tubingensis Ñoái chö ùng Hình 6b. Hoạt tính riêng Us (U/mg mẫu) của các chủng nấm mốc Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007240 cứu đa số phytase có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 44-600C [6,10]. Tại khoảng nhiệt độ tối ưu này, A.niger NRRL-363 cho hoạt tính enzym phytase tổng Ut cao nhất nhưng lại có hoạt tính riêng Us thấp nhất trong 3 chủng. A.niger NRRL-363 có hàm lượng protein cao, hoạt tính tổng cao, hoạt tính ri êng thấp chứng tỏ chủng này cho ít enzym phytase hơn trong t ổng số nhiều loại protein được sinh ra, hình (7a, 7b). Trong sản xuất, hoạt tính ri êng cao được quan tâm nhiều h ơn. A.oryzae và A.MR2 đáp ứng được yếu tố này, cả 2 chủng đều có hoạt tính enzym phytase tổng thấp hơn A.niger NRRL-363 nhưng lại có hoạt tính riêng cao hơn hẳn nhất là A.oryzae. Từ kết quả khảo sát ảnh h ưởng của nhiệt độ đến hoạt tính phytase từ A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2, chúng tôi có kết luận và nhận xét như sau: Các tính chất này của phytase từ 3 chủng nấm mốc tr ên rất thích hợp cho các ứng dụng công nghiệp, đặc biệt trong chế biến thức ăn gia súc. 4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme phytase Từ đồ thị cho thấy, cả 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 có pH tối ưu cho hoạt tính phytase cao là 2,5 và 5,0-5,5. Hầu hết enzym phytase từ vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối với phytase từ nấm mốc [10,11]. Tính chất này rất cần thiết trong các ứng dụng công nghiệp v à phù hợp với điều kiện trong dạ dày (pH 2,0-4,0) và ruột non (pH 4,0-6,0) của động vật [9]. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nhieät ñoä (ñoä C) H oa ït tín h to ång U t (U /g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nhieät ñoä (ñoä C) H oa ït tín h ri eân g U s (U /m g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 Hình 7a. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính tổng của enzym phytase của A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Hình 7b. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính tổng của enzym phytase của A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Hình 8a. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính tổng enzym phytase chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 pH H oa ït tín h ri eân g U s (U /m g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 0 50 100 150 200 250 300 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 pH H oa ït tín h to ång U t (U /g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 Hình 8b. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính tổng enzym phytase chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 241 Hình 9: Phân tích enzym phytase trên gel polyacrylamide b ằng phương pháp điện di SDS PAGE. 5. Phân tích enzyme phytase trên gel polyacrylamide Mục đích cuả thí nghiệm nhằm xác định một số th ành phần protein có trong dịch chiết enzym phytase của ba chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, Aspergillus MR2. Kết quả xác định được trình bày ở hình 9 dưới đây: Band 1: chứa các protein marker có trọng l ượng phân tử là 200.000, 116.250, 97.400, 66.200, 45.000, 31.000, 21.500, 14.400, 6.500 Daltons. Band 2: m ẫu đối chứng (control). Band 3: dịch chiết enzym thô của A.or yzae chứa các protein có trong lượng phân tử là 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Band 4: d ịch chiết enzym thô của A.MR2 chứa các protein có trong lượng phân tử là 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Band 5: dịch chiết enzym thô của A.niger NRRL -363 chứa các protein có trong lượng phân tử là 116.250, 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Phytase t ừ các chủng A.niger có hai loại l à PhyA và PhyB. PhyA có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 66 -128 kDa. PhyB có trọng lượng phân tử khoảng 58-65 kDa [2]. Phytase từ các chủng A.oryzae cũng cho hai loại phytase là PhyA và PhyB. PhyA có trọng lượng phân tử khoảng 65-120 kDa. PhyB có trọng lượng phân tử khoảng 58 kDa [19]. Qua kết quả phân tích enzym phytase sinh tổng hợp từ các chủng A.niger NRRL -363, A.oryzae, A.MR2 trên gel polyacrylamide bằng phương pháp SDS - PAGE, các band protein xuất hiện tương đối rõ trong vùng kích thước của phytase so với kết quả nghi ên cứu trước [2,19]. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Thị Tuyết (2003). Thu nhận v à khảo sát enzym phytase của nấm Asperg illus niger NRRL-363 trong môi trường lên men bán rắn. Khóa luận Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM, 5-27. 2. Mullaney E. J. and Ullah A. H. J. (2003). The term phytase comprises serveral different classes of enzymes. Biochemical and Biophysical Researc h Communications 312 , 197-184. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007242 3. Barbara, George Szakacs, Ashok Pandey, Sabu Abdulhameed, James C. Linden, và Robert P. Tengerdy (2003). Production of phytase by mucor racemosus in solid - state fermentation. Biotechnol Prog. 19 (2), 312 -319. 4. Wodzinski R. J. and Ullah A. H. J. (1996). Phytase. Advances in Applied Microbiology, vol 42, 263-298. 5. Lei X. G. and Porres J. M. (2003). Phytase enzymology, applications, and biotechnology. Biotechnology Letters, 25 (21), 1787 -1794. 6. Oh B. C., Choi W.-C., Park S., Kim Y.-O., Oh T.-K. (2004). Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases. Appl Microbiol Biotechnology , 63 (4), 362 -372. 7. Zimmermann B., Lantzsch H.-J., Langbein U. and Drochner W. (2002). Determination of Phytase activity in cereal grains by direct incubation, J Anim Physiol Anim Nutr (Berl), 86 (9 -10), 374-352. 8. Bogar B., Szakacs G., Linden J. C., Pandey A. and Tengerdy R. P. (2003). Optimization of phytase production by solid substrate fermentation. J Ind Microbiol Biotechnol., 30 (3), 183-189. 9. Casey A. and Walsh G. (2003). Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresour Technol, 86 (2), 183 -188. 10. Vohra A. and Satyanarayana T. (2003). Phytases: Microbial Sou rces, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology, 23 (1), 29-60. 11. Kerovuo J. (2000). A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of the Enzyme, 1-66. 12. McKee T. and McKee J. R. (1999). An Introduction to Chemical Biology. Biochemistry, vol 2. 13. Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki và Stuart J. Edelstein (1996). Protein Methods. Wiley, Chichester. 14. Nagashima T., Tange T., and Anazawa H. (1999). Dephosphorylation of Phytate by Using the Aspergillus niger Phytase with a High Affinity for Phytate. Appl Environ Microbiol, 65 (10), 4682-4684. 15. Budy J. Hidayat, Niels T. Eriksen and Marylin G. Wiebe (2006). Acid photphatase production by Aspergillus niger N402A in continuous flow culture. Federation of European Microbiologycal Societ8ies Microbioal Lett , vol 254, 324 -321. 16. Chantasartrasamee K, Duangnetre Israngkul Na Ayuthaya, Sunthum Intarareugsorn, Saovanee Dharmsthiti (2004). Phytase activity from Aspergillus oryzae AK9 cultivated on solid state soybean meal medium. Process Biochemistry, 1 -5. 17. Shieh T. R. and Ware J. H. (1968). Survey of microorganisms for production of extracellular phytase. Applied Microbiology, 16 (9), 1348 -1351. 18. Howson S. J. and Davis R. P. (1983). Production of Phy tase – hydrolysing enzyme by some fungi. Enzyme Microbiol Technol., 5, 377 -382. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 243 19. Fujita J., Seiko Shigeta, Yu-Ichi Yamane, hisashi Fukuda, Yasuzo Kizaki, Saburo Wakabayashi, and Kazuhisa Ono (2003). Production of two phytase from Aspergillus oryzae during industrial Koji making. Journal of Bioscience and Bioengineering, 95 (5), 460-464. 20. Wyss M, Brugger R, Kronenberger A, Rémy R, Fimbel R, Oesterhelt G, Lehmann M, and Van Loon A. P. G. M. (1999). Biochemical Characterization of fungal phytases (myo-Inositol hexakisphophate phosphohydrolases): catalytic properties, 65 (2), 367-373. SUMMARY Isolation and investigation of phytase from A spergillus in solid-state fermentation Nguyen Duy Long, Nguyen Thi My Hanh, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology Phytases are acid phosphatase enzymes have been found as a supplement to increase not only the growth rate of monogastric animals but also the efficiency of phosphate utilization in feeds, which significantly reduces phosphorus excretion effect to environmental pollutants. In this study, phytases are extracted from Aspergillus species are isolated from original raw material of fermented glutinous rice. Three species A.MCR2, A.MR2, A.MR5 are found with a high positive of phytase activity. The effects of pH and temperature conditionals are researched and compared with others species of Aspergillus genus. Phytases are also assayed on polyacrylamide gel by SDS-PAGE method and the results appearing with 65 kDa and 58 kDa respective to phyA and phyB from A.MR2. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007244 TỐI ƯU HOÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP enzyme cellulase CỦA Tricoderma reesei TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium, …Trong đó hai giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast & Saha, 1997). Cellulase là enzym đa c ấu tử gồm: exoglucanase hay C 1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) và -glucosidase (EC 3.2.1.21), hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose. Cellulase được ứng dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đ ường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol. Việt Nam có lượng phụ phế liệu nông nghiệp thải ra rất dồi d ào, trong đó lượng bã mía thải ra từ các nhà máy đường chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu, trong bã mía có hàm lượng cellulose khoảng 50% và hemicellulose khoảng 25% nên có thể sử dụng như nguồn carbon để cảm ứng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nấm sợi:Chủng T. reesei VTT-D-80133 nhận được từ bảo tàng giống Roal Oy, Phần Lan. Cơ chất: Bã mía và cám mì. Xác định hoạt tính các enzym: Carboxymethyl cellulase (CMCase), FPU (Filter Paper Unit), xylanase, α-amylase, protease. Thủy phân giấy: cho dịch enzym cellulase (5 FPU/ml) vào giấy xay nhỏ (10%) ủ ở 500C, pH 5 trong 24 giờ. Hiệu suất (%) = lượng đường khử (g)*0,9*(100/lượng giấy in (g)) Ñieän di protein: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel (SDS -PAGE) ñö ôïc thö ïc hieän treân gel ñö ùng chö ùa 10% (w/v) polyacrylamide. Tối ưu hóa thành phần môi trường: Tỷ lệ BM: CM, độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy là 4 yếu tố có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. reesei nên được tối ưu theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tối ưu hóa thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 245 Các kết quả thí nghiệm trước đây, chúng tôi đã xác định được thành phần môi trường cơ sở cho chủng T. reesei VTT-D-80133 sinh ra cellulase: tỷ lệ BM: CM (4:6), độ ẩm ban đầu 54%, 5 lần nồng độ dinh dưỡng, thời gian nuôi ủ 7 ngày, tỷ lệ giống 6x106 bào tử/g môi trường, hoạt tính cellulase đạt đ ược là 251,43 IU/g. Tuy nhiên, thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy mới chỉ được nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng rẽ. Trong năm yếu tố trên thì bốn yếu tố là tỷ lệ BM:CM, độ ẩm ban đầu, nồng độ dinh d ưỡng và thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. reesei VTT-D-80133 nên được chọn để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui ho ạch thực nghiệm. Qui hoạch được thực hiện với ma trận đầy đủ với số thí nghiệm N = 2 4 = 16 Bảng 1. Mã hóa các biến số Các biến số Mức dưới (-) Mức trung bình (0) Mức trên (+) X1: Tỷ lệ BM:CM 2:8 4:6 6:4 X2: Nồng độ dinh dưỡng (lần) x2 x5 x8 X3: Độ ẩm ban đầu (%) 50 54 58 X4: Thời gian nuôi cấy (giờ) 3 7 11 Tiến hành nuôi cấy T. reesei trong các môi trường mà có đủ các yếu tố khảo sát ở trên hai mức (theo bảng 1). Kết quả xác định hoạt tính cellulase được ghi nhận trong bảng 2. Các hệ số trong phương trình hồi qui được xác định như sau: - Tính b0: 16 16 1 0 y b i i   , b0 = 87,30 - Tính bi: 16 16 1 yx b i i ji j   , b1 = 2,2; b2 = 5,82, b3 = 29,1, b4 = 49,8 - Tính bij:   16 16 1   i iiljjl yxx b , b12 = 9,66, b23 = 2,08, b13 = 31,32, b14 = 9,71, b24 = 16,17, b34 = -0,24, b123 = 13,58,b124 = - 21,27, b134 = 32,03, b234 = 6,17, b1234 = -10,19. Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện: t b t lt j j Sbj  , Với t lt : p = 0,05, f = n – 1 = 2 t )2;05,0( = 4,3 (Tra bảng tiêu chuẩn Student) Sbj (phương sai của các hệ số): N SS thbj  = 4 03,1 = 0,26 (N = 16, S th2 1 3 1 0 0      n i i yy = 1,07 (với n = 3)  S th 1,03)) Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007246 So sánh các hệ số tj với tlt ta thấy, các hệ số của phương trình đều có nghĩa, ngoại trừ các hệ số t 34. Vậy hàm mục tiêu có dạng: ^ y = 87,3 + 2,2x1 + 5,82x2 + 29,1x3 + 49,8x4 + 9,66x1x2 + 31,32x1x3 + 9,71x1x4 + 2,08x2x3 +16,17x2x4 + 13,18x1x2x3 – 21,57x1x2x4 + 32,03x1x3x4 + 6,17x2x3x4 – 10,19x1x2x3x4 Từ phương trình hồi qui thu được, ta thấy rằng thời gian nuôi ủ, độ ẩm ban đầu và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính cellulase hơn tỷ lệ bã mía:cám mì. Kiểm tra sự tương thích của mô hình theo tiêu chuẩn Fisher. Điều kiện để mô hình tương thích là: FF lttn  , Flt: giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05; f1 = N – l; f2 = n-1; trong đó N = 16, l: số hệ số có ý nghĩa = 15, n = 3), FF lt 5,18)2;1;05,0( (Tra bảng tiêu chuẩn Fisher) Ftn: 87,107,1 00075,2 2 2  S SF th tt tn ( lN i ii tt yy S         16 1 2 ^ 2 ). Ta có: FF lttn  (vì 1,87 < 18,5) Vậy: Phương trình hồi qui thu được tương thích với thực nghiệm Kết quả tối ưu hóa theo kế hoạch leo dốc: ở môi trường có tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm 60%, thời gian nuôi cấy 7 ng ày cho hoạt tính cellulase cao nhất: CMCase 280,64 IU/g và FPU 5 UI/g, thấp hơn 3,2 và 37 lần so với chế phẩm Amano T. Canh trường còn chứa α-amylase 368,75 UI/g, protease 12,43 UI /g và xylanase 10073,25 BXU/g Kết quả đường hóa giấy in đã qua sử dụng Dịch chiết enzym cellulase (5 FPU/ml) đ ường hóa khoảng 20% giấy in đ ã qua sử dụng (10%) trong 24 giờ thủy phân ở 50 0C, pH 5,0; dịch đường hóa chứa 23,62 mg đường khử/ml có thể được sử dụng để lên men ethanol hoặc lên men sản xuất các sản phẩm có giá trị. T TN X1 X2 X3 X4 y y^ 1 2:8 x2 50 3 28,67 28,92 2 6:4 x2 50 3 0,15 0,4 3 2:8 x8 50 3 1,24 1,48 4 6:4 x8 50 3 2,57 2,8 5 2:8 x2 58 3 144,48 143,72 6 6:4 x2 58 3 18,07 17,82 7 2:8 x8 58 3 5,62 5,38 8 6:4 x8 58 3 99,18 98,94 9 2:8 x2 50 11 130,64 130,4 10 6:4 x2 50 11 58,36 58,12 11 2:8 x8 50 11 188,73 188,48 12 6:4 x8 50 11 55,23 55 13 2:8 x2 58 11 51,94 52,72 14 6:4 x2 58 11 219,5 219,74 15 2:8 x8 58 11 129,45 129,7 16 6:4 x8 58 11 262,94 263,18 17 4:6 x5 54 7 154,03 18 4:6 x5 54 7 155,07 19 4:6 x5 54 7 156,1 Bảng 2. Hoạt lực CMCase từ T. reesei theo thực nghiệm và theo phương trình hồi qui. Với y: Hoạt tính CMCase (UI/g) theo thực nghiệm; y^: hoạt tính CMCase (UI/g) theo phương trình hồi qui Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 247 Kết qu