Tiểu luận Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp

Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 1 MỤC LỤC PHẦN I: TỔNG QUAN .......................................................................................................... 4 I. GIỚI THIỆU CHUNG...................................................................................................... 4 II. VITAMIN B12 ............................................................................................................. 5 1. Giới thiệu chung .......................................................................................................... 5 2. Tính chất của vitamin B12 ............................................................................................ 5 3. Sản xuất vitamin B12 trên quy mơ cơng nghiệp ....................................................... 7 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT ................................................................................ 9 I. VI SINH VẬT ................................................................................................................ 9 1. Yêu cầu về nguyên liệu ............................................................................................... 9 2. Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 ............................................................................... 9 II. RỈ ĐƢỜNG .................................................................................................................... 14 III. HÈM RƢỢU ................................................................................................................. 15 IV. DỊCH WHEY ................................................................................................................ 16 PHẦN III: SẢN XUẤT .......................................................................................................... 19 I. QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT .... 19 1. SƠ ĐỒ KHỐI .............................................................................................................. 19 2. SƠ ĐỔ THIẾT BỊ ........................................................................................................ 20 II. GIẢI THÍCH C[C GIAI ĐOẠN ................................................................................. 21 1. NHÂN GIỐNG ......................................................................................................... 21 2. CHUẨN BỊ MƠI TRƢỜNG LÊN MEN ................................................................ 24 3. LÊN MEN .................................................................................................................. 26 4. LY TÂM ..................................................................................................................... 30 5. ACID HĨA ................................................................................................................ 31 6. HẤP PHỤ .................................................................................................................. 32 7. GIẢI HẤP .................................................................................................................. 34 8. CƠ ĐẶC ..................................................................................................................... 35 9. KẾT TINH ................................................................................................................. 36 10. LY TÂM ..................................................................................................................... 38 11. SẤY ............................................................................................................................. 39 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 2 Phần IV: SẢN PHẨM ............................................................................................................ 41 Phần V: THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ ............................................................................... 45 I. Nghiên cứu kh{m ph{ ra bí ẩn cuối cùng của qu{ trình sinh tổng hợp ............... 45 II. Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 ......................................... 46 III. Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: ............................ 51 IV. Sản phẩm Tempeh ....................................................................................................... 53 PHẦN VI: PHỤ LỤC ............................................................................................................ 60 I. Folic acid & vitamin B12 injection .............................................................................. 60 II. Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm ........................................................................ 60 III. Viên nén vitamin B12 .................................................................................................. 61 PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 62 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 3 Lời mở đầu Vitamin B12 là một loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con ngƣời. Trong cơ thể, nĩ tồn tại dƣới dạng bốn dẫn xuất m| ngƣời ta gọi là cobalamin và hoạt động nhƣ c{c yếu tố enzyme. Đã cĩ nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của viatmin B12 trong việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính và các bệnh về viêm dây thần kinh. Vitamin B12 chỉ cĩ nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12. Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên quy mơ cơng nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những ngƣời ăn chay trƣờng và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12. Trong cơng nghiệp, vitamin B12 hồn tồn đƣợc tổng hợp bởi các vi sinh vật. Chúng em xin c{m ơn thầy Lê Văn Việt Mẫn đã tạo điều kiện cho chúng em cĩ dịp tìm hiểu và thực hiện đề tài tiểu luận Sản xuất vitamin B12 trên quy mơ cơng nghiệp, để chúng em đ{p ứng yêu cầu và nắm vững hơn những kiến thức của mơn học Cơng nghệ lên men. Trong quá trình thực hiện mặc dù chúng em đã cố gắng hết sức nhƣng cũng khơng thể tránh khỏi sai sĩt, c{m ơn thầy đã tận tình giúp đỡ và sửa chữa để bài làm của chúng em đƣợc hồn chỉnh hơn. Nhĩm thực hiện Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 4 PHẦN I: TỔNG QUAN I. GIỚI THIỆU CHUNG Vitamin l| chất hữu cơ khơng cung cấp năng lƣợng cho tế b|o trong qu{ trình ph{t triển. Tuy nhiên, vai trị của vitamin lại vơ cùng quan trọng cho hoạt động sống của tế b|o: vitamin thúc đẩy c{c qu{ trình trao đổi chất v| l| th|nh phần khơng thể thiếu đƣợc trong cấu tạo của nhiều loại enzym. Do đĩ việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần thiết. Vitamin đƣợc sử dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:  Y học.  Thực phẩm cho ngƣời.  Thức ăn gia súc. C{c nh| khoa học đã {p dụng nhiều phƣơng ph{p kh{c nhau trong cơng nghệ sản xuất vitamin. Bao gồm c{c phƣơng ph{p sau:  Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật v| động vật.  Tổng hợp hĩa học.  Tổng hợp sinh học. Cả ba phƣơng ph{p đều cĩ những ƣu v| nhƣợc điểm riêng, v| mỗi phƣơng ph{p cho ra những vitamin riêng. Do đĩ để sản xuất vitamin từ c{c nguồn nguyên liệu v| phƣơng ph{p kh{c nhau, ngƣời ta thƣờng nhắm v|o hiệu quả của phƣơng ph{p, trong đĩ gi{ th|nh đĩng vai trị quan trọng cho việc quyết định phƣơng ph{p sản xuất. Cơng nghệ sản xuất vitamin theo phƣơng ph{p sinh học chỉ tập trung v|o một số vitamin đặc trƣng v| cĩ hiệu quả nhất, bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhĩm B khác. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 5 II. VITAMIN B12 1. Giới thiệu chung  Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất cĩ chứa cobalamin vì trong ph}n tử của nĩ cĩ chứa kim loại Coban. Tại hội nghị quốc tế về hĩa sinh năm 1961, c{c nh| b{c học đã đề nghị gọi tên nhĩm vitamin B12 là corinoit. Hiện nay ngƣời ta biết khoảng 100 loại chất tƣơng tự vitamin B12 trong số đĩ cĩ c{c chất quan trọng thƣờng gặp nhƣ cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12 ‚b‛), nitritocobalamin (B12 ‚c‛). Hợp chất corinoit bị loại mất coban đƣợc gọi l| corin, cịn acid corinic là corin cĩ cả c{c nh{nh bên. Dạng tự nhiên của những hợp chất cobalamin l| adenosylcobalamin, methylcobalamin và hydroxocobalamin.  Cyanocobalamin, đƣợc định nghĩa l| vitamin B12, l| một hợp chất cobalamin bền vững, đƣợc sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp nhƣng khơng tìm thấy trong tự nhiên. Vitamin B12 l| một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu m{u nguy hiểm v| bệnh viêm d}y thần kinh ngoại biên, đồng thời nĩ cũng l| một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật v| cả con ngƣời.  Bởi vì tổng hợp vitamin B12 bằng phƣơng ph{p hĩa học khĩ khăn v| tốn kém nên ngƣời ta thƣờng sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phƣơng pháp lên men vi sinh vật gi{n đoạn hoặc kết hợp gi{n đoạn và liên tục. 2. Tính chất của vitamin B12  Vitamin B12 cĩ cơng thức hĩa học là C63H90N14O14PCo.  Cấu trúc hĩa học của vitamin B12 bao gồm: - Một mặt phẳng chứa các vịng pyrol và nguyên tử coban chiếm vị trí trung tâm của c{c vịng đĩ. - Phần thứ hai của phân tử là một nhĩm nucleotid thẳng gĩc với mặt phẳng, trên phần nucleotid này bao gồm thành phần bazơ nitơ l| dimetyl benzimidazol và thành phần đƣờng là -D-ribofuranoza. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 6 Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin  Vitamin B12 thƣờng ở dạng kết tinh, cĩ kích thƣớc rất nhỏ, m|u đỏ sẫm, khơng cĩ mùi và vị.  Tan trong nƣớc, trong các dung dịch trung tính, cồn; khơng tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc.  Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhƣng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 khơng bền trong mơi trƣờng pH kiềm. Cĩ thể nĩi vitamin B12 cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong qu{ trình trao đổi chất: nếu thiếu hoặc khơng đủ vitamin B12 trong cơ thể con ngƣời v| động vật sẽ g}y ra hiện tƣợng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon v| axit béo. Cụ thể:  Vitamin B12 tham gia v|o việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye – CoA - mutase v| rất nhiều enzym quan trọng kh{c. C{c enzym n|y tham gia v|o c{c phản ứng chuyển metyl v| qu{ trình tổng hợp methionin, cholin, thimin. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 7  Vitamin B12 tham gia v|o việc đảm bảo hoạt động của c{c cơ quan tạo ra m{u v| l|m tăng cƣờng c{c phản ứng bảo vệ cơ thể. Thiếu vitamin sẽ dẫn tới sự tho{i hĩa mỡ ở gan.  Cùng với methionin, vitamin B12 tham gia v|o qu{ trình trao đổi nhĩm methyl. Vitamin B12 giúp cơ thể tổng hợp methionin từ homosistein. Hình 2. Phân tử vitamin B12 3. Sản xuất vitamin B12 trên quy mơ cơng nghiệp  Khi vitamin B12 đƣợc sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp thì ta phải quan tâm, kiểm so{t đến c{c yếu tố nhƣ giống vi sinh vật, cơ chất sử dụng, qu{ trình phản ứng v| qu{ trình thu nhận, tinh chế sản phẩm. Bản chất của qu{ trình sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp l| sản phẩm của qu{ trình cĩ định hƣớng rõ r|ng, qui trình sản xuất đƣợc kiểm so{t từ kh}u sản xuất giống đến qu{ trình lên men v| cuối cùng l| qu{ trình thu nhận sản phẩm.  Nhƣ vậy qu{ trình lên men cơng nghiệp thực chất l| thực hiện v| kiểm so{t những cơng việc sau:  Tạo giống v| n}ng cao chất lƣợng giống. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 8  Tính to{n, thiết kế, chế tạo c{c thết bị lên men phù hợp với cơng nghiệp v| sản phẩm.  Thực hiện c{c kĩ thuật trong lên men.  T{ch, thu nhận v| tinh chế sản phẩm. - Để l|m đƣợc việc đĩ cần phải giải quyết hai vấn đề sau: a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ƣu trong qu{ trình lên men nhƣ thiết bị, cơng nghệ…nhằm đạt đƣợc hiệu suất cao cho c{c sản phẩm mong muốn. b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men v| chế biến th|nh c{c dạng thƣơng phẩm, nghiên cứu c{c điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu đƣợc c{c chất cĩ hoạt tính sinh học dạng tinh khiết. Nhiều kỹ thuật trong cơng nghiệp hĩa học nhƣ: lọc, kết tủa, ly t}m, kết tinh, hấp phụ, chƣng cất, sấy… đều đƣợc sử dụng ở đ}y. Điều kiện kh{c nhau cần lƣu ý tới l| c{c chất cĩ hoạt tính sinh học thƣờng khơng bền vững với c{c điều kiện nhiệt độ, pH v| c{c yếu tố vật lý khác. - Điều kiện v| phƣơng ph{p nuơi cấy vi sinh vật cĩ ảnh hƣởng đến sự hình thành thành phần và tính chất của chất lỏng canh trƣờng. Các chế độ sinh tổng hợp cần hƣớng tới kết quả thu nhận mơi trƣờng cĩ chất nền và những tạp chất khác cịn lại là tồi thiểu và cĩ nồng độ các sản phẩm mong muốn là cực đại. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 9 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT Sản xuất vitamin B12 trong cơng nghiệp đi từ nguyên liệu vi sinh vật v| rỉ đƣờng hay hèm rƣợu, dịch whey. I. VI SINH VẬT 1. Yêu cầu về nguyên liệu Trong cơng nghệ lên men, giống vi sinh vật đĩng vai trị hết sức quan trọng, ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng v| gi{ th|nh của sản phẩm. Nhƣ vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong cơng nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa mãn những yêu cầu sau:  Giống vi sinh vật đĩ phải cho ra vitamin B12 cĩ chất lƣợng v| số lƣợng cao hơn hẳn c{c sản phẩm phụ kh{c.  Năng suất cao.  Phải cĩ khả năng đồng hĩa c{c nguyên liệu rẻ tiền v| dễ kiếm.  Sản phẩm của qu{ trình phải dễ d|ng t{ch ra khỏi c{c tạp chất mơi trƣờng v| sinh khối vi sinh vật giống.  Vi sinh vật phải thuần khiết.  Vi sinh vật phải cĩ tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất cơng nghiệp, sự ổn định nhiệt độ, {p suất thẩm thấu, pH...  Giống phải cĩ tốc độ sinh sản v| ph{t triển mạnh trong điều kiện mơi trƣờng cơng nghiệp.  Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn.  Giống phải ổn định trong bảo quản v| điều kiện bảo quản dễ d|ng. 2. Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 - Hiện nay, khoa học đã kh{m kh{ ra rất nhiều vi sinh vật cĩ thể tham gia qu{ trình sinh tổng hợp vitamin B12 . Một số quy trình sản xuất vitamin đƣợc biết đến l| quy trình sản xuất vitamin từ vi khuẩn Propionic, từ xạ khuẩn Actinomyces olivacens, v| vi khuẩn sinh khí metan. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 10 - Một số vi khuẩn cĩ khả năng sản xuất vitamin: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium sticklandii, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermoaceticum, Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum, Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri, Propionibacterium freudenreichii, Propionobacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus..., ngồi ra cịn cĩ các giống thuộc xạ khuẩn Actinomyces Hình 3: Vi khuẩn Propionibacterium freudenreichii - Trƣớc đ}y, ngƣời ta sử dụng chủ yếu Streptomyces griseus để sản xuất vitamin trên quy mơ cơng nghiệp nhƣng hiện nay vi khuẩn Propionibacterium shermanii và Pseudomonas denitrificans đã thay thế ho|n to|n vi khuẩn Streptomyces. - Nguyên nhân: Vitamin B12 l| sản phẩm phụ trong sản phẩm Streptomixin nhờ Streptomyces griseus hay l| sản phẩm phụ của qu{ trình sản xuất Clotetracyclin nhờ Str. Aureofaciens. C{c qu{ trình n|y thƣờng tạo đƣợc lƣợng vitamin B12 là 2 mg/l dịch nuơi cấy nên rất khĩ t{ch. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 11 Việc sản xuất dựa v|o Propionibacterium shermanii hay P. freudenreichii cho hiệu suất vitamin cao hơn. Tế b|o của c{c vi khuẩn n|y chứa một lƣợng vitamin khoảng 20 mg/l. 2.1. Vi khuẩn propionic a. Phân loại vi khuẩn propionic - Đặc điểm chung:  Vi khuẩn propionic là loại vi khuẩn Gram dƣơng, khơng di động, khơng sinh bào tử, kị khí khơng bắt buộc.  Chúng cĩ hình cầu, xếp th|nh đơi hoặc chuỗi.  Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của vi khuẩn là 300C.Lƣợng G+C trong DNA của chúng nằm trong khoảng 53-67 mol%. - Phân loại: vi khuẩn Propionic đƣợc phân loại thành 2 nhĩm:  Nhĩm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa. Chúng phát triển trong mơi trƣờng phơmai và sữa. Trên cơ sở tính tƣơng đồng của DNA trong thành phần cấu tạo của thành tế bào, nhĩm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa đƣợc phân loại thành 6 lồi: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.theonii, P.acidipropionici, P.coccoides và P.cyclohexanicum.  Nhĩm vi khuẩn propionic sống trên da. Mơi trƣờng sống chính của giống propionic sống trên da l| da ngƣời.Nhĩm vi khuẩn sống trên da đƣợc phân loại thành 6 lồi: P.acnes, P.avidium, P.granulosum, P.lymphophilums, P.propionicum và Propioniferax innocua. Nhĩm vi khuẩn sống trên da cĩ dạng que, kị khí.  Tr{i ngƣợc với vi khuẩn propionic sống trên da, nhĩm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa khơng sản sinh indole và khơng thể hĩa lỏng gelatin. Hơn thế nữa, hai nhĩm này cĩ thể đƣợc phân biệt rõ dựa vào các đặc điểm sinh lý học của nĩ. Do đĩ, hai nhĩm vi khuẩn propionic này khác nhau chủ yếu dựa trên mơi trƣờng sống tự nhiên của chúng. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 12 b. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium shermanii Hình 4. Vi khuẩn Propionibacterium shermanii Trong các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp vitamin B12 cĩ giống Propionibacterium shermanii là giống cĩ nhiều ƣu điểm nhất và cĩ thể đƣa v|o sản xuất cơng nghiệp. Vi khuẩn này cĩ một số đặc điểm quan trọng đƣợc tĩm tắt nhƣ sau:  Chúng cĩ khả năng lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, manit, lactose.  Khoảng pH hoạt động 4,5 - 7,5, pH tối ƣu cho việc sinh tổng hợp vitamin B12 là 5,8-7,5.  Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28 - 300C.  Các chất dinh dƣỡng cho sự phát triển bao gồm muối amon, nƣớc amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2; các kim loại nhƣ Fe, Cu, Zn, Mn thƣờng làm giảm quá trình sinh tổng hợp vitamin B12.  C{c vitamin l|m tăng hiệu suất tổng hợp B12 bao gồm thiamin, biotin, acid nicotinic, acid tolic. 2.2 Xạ khuẩn Actinomyces Trong tất cả các giống thuộc Actinomyces cĩ giống Actinomyces olivaceus cĩ khả năng tổng hợp vitamin B12 cao hơn cả v| chúng đƣợc sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mơ cơng nghiệp. Một số đặc điểm quan trọng của giống xạ khuẩn n|y đƣợc tĩm tắt nhƣ sau:  Xạ khuẩn Act. Olivacens thuộc loại hiếu khí. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 13  Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong mơi trƣờng chứa glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rƣợu. Trong thành phần mơi trƣờng này cần cho thêm các muối amon, muối coban và CaCO3.  Sinh tổng hợp vitamin B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuơi cấy.  Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rất rõ rệt: o Pha tạo thành sinh khối. o Pha tạo thành vitamin B12.  Thƣờng pha tạo thành vitamin B12 chỉ mạnh khi kết thúc quá trình tăng sinh khối.  pH ban đầu mơi trƣờng nên điều chỉnh vào khoảng 7. Ở pha thứ nhất, pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 v| bƣớc sang pha thứ hai pH sẽ tăng dần lên 8,2 - 8,7.  Thổi khí cĩ ảnh hƣởng rất lớn đến sự tổng hợp vitamin B12, do đĩ trong quá trình lên men bắt buộc phải cĩ thổi khí mạnh.  Nhiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-300C.  Thời gian lên men là 60 - 120 giờ (trung bình là 60 - 96 giờ). 2.3 Vi khuẩn sinh metan Trong thiên nhiên cĩ rất nhiều vi sinh vật tham gia lần lƣợt nhiều phản ứng tạo ra khí metan. Khí metan là loại khí cĩ thể đốt đƣợc, đồng thời nĩ là loại khí tạo ra hiện tƣợng hiệu ứng nhà kính lớn nhất. Cùng với sự tạo thành khí metan, vi sinh vật cịn tổng hợp đƣợc số lƣợng vitamin B12 lớn. Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh khí metan đƣơc tĩm tắt nhƣ sau:  Chúng thuộc vi khuẩn Gram (-).  Chúng khơng chuyển động.  Chúng khơng tạo bào tử.  Chúng khơng thuộc loại kị khí bắt buộc. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 14 Hình 5: Vi khuẩn Bacillus megatherium II. RỈ ĐƢỜNG - Rỉ đƣờng là phế liệu chứa nhiều đƣờng khơng kết tinh trong sản xuất đƣờng từ mía hoặc củ cải đƣờng. Thơng thƣờng tỉ lệ rỉ đƣờng trong sản xuất đƣờng mía chiếm khoảng 3 - 3.5% trọng lƣợng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt , cơng nghệ sản xuất đƣờng…, th|nh phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: o Nƣớc: 15-20% o Chất khơ: 80-85% o Trong đĩ cĩ 60% l| đƣờng (40% l| đƣờng saccharose, 20% là fructose và glucose) và 40% chất khơ cịn lại là chất phi đƣờng (khơng phải l| đƣờng). o Trong thành phần phi đƣờng cĩ khoảng 30 - 32% hợp chất hữu cơ v| 6 - 10% hợp chất vơ cơ. Trong hợp chất vơ cơ gồm cĩ: K2O 3,5%, Fe2O3 0,2%, MgO 0,1%, sulfat 1,6%, CaO 1,5%, SiO2 0,5%, P2O5 0,2%, Cloride 0,4% o Trong những hợp chất hữu cơ gồm cĩ hợp chất cĩ chứa nitơ v| khơng chứa nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leucin, isoleucin. Nitơ tổng chiếm khỏang 0,3 – 0,5% (ít hơn so với lƣợng nitơ cĩ trong rỉ đƣờng củ cải). o Ngồi ra trong rỉ đƣờng cĩ một số vitamin sau: Bảng 1. Thành phần các vitamin trong rỉ đường (tính theo µg/1g rỉ đường) Thiamin 8.3 Riboflavin 2.5 Nicotimic acid 21 Pantothenic acid 21.4 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 15 - Mặt khác, trong rỉ đƣờng luơn cĩ mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thƣờng gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lƣợng của rỉ đƣờng. Vì vậy trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri 20/000 so với trọng lƣợng mật rỉ để bảo quản.  Ƣu điểm của việc sử dụng rỉ đƣờng để sản xuất so với những nguyên liệu khác là:  Gi{ rẻ.  Khối lƣợng lớn, dồi d|o.  Sử dụng tiện lợi.  Nguồn cung cấp kh{ phổ biến.  Đặc biệt ở nƣớc ta, khơng phạm đến chính s{ch lƣơng thực. III. HÈM RƢỢU Hèm rƣợu là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất ethanol bằng phƣơng pháp lên men. Bảng 2. Thành phần hĩa học của hèm rượu: Th|nh phần Nguyên liệu khoai t}y Nguyên liệu khoai mì Chất khơ (%) 6 3,3 Protein thơ (% tổng chất khơ) 27 14,4 Chất béo 2,7 1,8 Chất xơ 8,1 2,8 Chất chiết phi nitơ 49,9 74,2 Folic acid 0.038 Pyridoxin 6.5 Biotin 12 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 16 Tro 12,6 6,7 - Ứng dụng: hèm rƣợu là một nguyên liệu để sản xuất vitamin, phân bĩn, thức ăn gia súc… - Ƣu điểm: rẻ tiền , dễ kiếm, tận dụng đƣợc nguồn phế liệu. IV. DỊCH WHEY - Sự phát triển của sinh vật và sản phẩm vitamin B12 từ dịch Whey dƣờng nhƣ kh{c với mơ hình sản xuất đối với các loại cấu trúc khác. Sinh vật gần nhƣ ph{t triển tối đa trƣớc khi vitamin B12 đƣợc tích lũy. - Trong dịch Whey, lactose cĩ thể làm nguồn cacbon cho vi sinh vật sử dụng để phát triển. Trong dịch Whey và men chiết cĩ đầy đủ các chất dinh dƣỡng cho sự phát triền và hình thành vitamin B12 từ vi sinh vật. - Trên phƣơng diện đĩ, với nhƣợc điểm của dịch Whey nên việc sử dụng để sản xuất vitamin B12 thì nhỏ và rải rác, riêng lẻ, khơng đủ cung cấp cho quá trình sản xuất cĩ lợi của vitamin B12. - Việc sản xuất vitamin B12 từ dịch Whey chỉ cĩ ý nghĩa trên quy mơ cơng nghiệp khi việc chuyên chở dịch Whey thực hiện gần nơi sản xuất và lƣợng Whey tƣơng đối nhiều để cĩ thể kết hợp và sản xuất. Chi phí vận chuyển tăng vì lƣợng dịch Whey thơ chứa khoảng 93,1% l| nƣớc. Chi phí chuyên chở cĩ thể giảm khi cơ đặc dịch thơ thành dạng rắn trƣớc khi chuyên chở. Một lý do khác là dịch Whey cĩ thể sản xuất nếu nhƣ gi{ trị sản phẩm của nĩ tăng bởi qu{ trình lên men nhƣ qu{ trình lên men vitamin B12. Ngay cả khi quá trình chỉ thải ra lƣợng thừa dịch Whey m| khơng tăng gi{ sản phẩm sữa, nĩ sẽ cĩ giá trị vì giúp giải quyết vấn đề chất thải trong quá trình sản xuất phơ mai. Bảng 3. Thành phần whey protein Milk protein (%) Casein 82.2 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 17 Whey protein -lactoglobulin -lactalbumin bovine serum albumin minor ‘proteins’ 9.6 3.8 1.4 3.0 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 18 Bảng 4. Thành phần hố học của dịch whey Th|nh phần Sweet whey (%) Sour whey(%) Tổng h|m lƣợng chất rắn 6.40 6.50 Nƣớc 93.60 93.50 Chất béo 0.05 0.04 Protein 0.55 0.55 Nitơ phi protein 0.18 0.18 Lactose 4.80 4.90 Tro Canxi Photpho Natri Kali Clo Acid lactic 0.5 0.043 0.040 0.050 0.160 0.110 0.050 0.8 0.120 0.065 0.050 0.160 0.110 0.400 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 19 PHẦN III: SẢN XUẤT I. QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT 1. SƠ ĐỒ KHỐI Vi sinh vật Mật rỉ Chuẩn bị mơi trường Nhân giống Lên men Ly tâm Acid hĩa Hấp phụ Giải hấp Cơ đặc Kết tinh Sấy Ly tâm Vitamin B12 Xác tế bào Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 20 2. SƠ ĐỔ THIẾT BỊ Hình 6. Sơ đồ thu nhận chất cơ của vitamin B12 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 21 II. GIẢI THÍCH CÁC GIAI ĐOẠN 1. NHÂN GIỐNG  Mục đích cơng nghệ: - Chuẩn bị: chuẩn bị cho quá trình lên men. Quá trình nhân giống giúp gia tăng số lƣợng tế b|o( tăng sinh khối), tích lũy đủ số lƣợng tế bào cần thiết để cấy giống v|o mơi trƣờng lên men.  Cách thực hiện: - Nhân giống l| qu{ trình tăng dung tích, dịch chứa sinh khối qua nhiều cấp. Mỗi cấp nhân giống thƣờng tăng dung khối từ 10-15 lần. Cứ làm nhƣ vậy cho đến khi tồn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men. - Khi nhân giống giai đoạn phịng thí nghiệm, ngƣời ta sử dụng các dụng cụ thủy tinh nhƣ ống nghiệm, erlenmeyer với các dung tích 750 ml, 1l, 2l kết hợp với tủ ấm, tủ lắc điều nhiệt. Do thể tích mơi trƣờng nhỏ nên việc sử dụng máy lắc cĩ thể đảm bảo đƣợc sự đồng nhất trong canh trƣờng nuơi và cung cấp đầy đủ oxy cho sự sinh trƣởng, phát triển của nhĩm vi sinh vật hiếu khí. - Khi nhân giống ở giai đoạn ph}n xƣởng, ngƣời ta sử dụng những thiết bị với dung tích khác nhau: 100l, 500l, 1m3, 3 m3, 5 m3, 10 m3…hoặc lớn hơn tùy theo dung tích của thiết bị lên men đang sử dụng tại nhà máy. Hiện nay ngƣời ta sản xuất vitamin B12 theo qui mơ cơng nghiệp thƣờng sử dụng lồi Prop.shermanii. Lo|i n|y thƣờng đƣợc giữ giống trong mơi trƣờng thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4. Trong mơi trƣờng, ngƣời ta cho thêm cao ngơ hoặc nƣớc chiết trái cây, nuơi vi khuẩn ở điều kiện nhiệt độ 28 - 320C trong thời gian 7-8 ng|y v| sau đĩ bảo quản lạnh, cấy chuyền định kì mỗi tháng 1 lần. - Nhân giống cho sản xuất thƣờng đƣợc thực hiện trong điều kiện kị khí bắt buộc. - Mơi trƣờng cho nhân giống cĩ lƣợng đƣờng ít hơn mơi trƣờng lên men, cịn các thành phần khác của mơi trƣờng giống nhƣ mơi trƣờng lên men. - Trong mơi trƣờng, ngồi thành phần đƣờng ra, ngƣời ta cịn cho thêm các muối amon, nƣớc amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 22 - Lƣu ý l| trong trƣờng hợp khơng dùng lồi Prop.shermanii để sản xuất vitamin B12, ta dùng xạ khuẩn hoặc các vi khuẩn sinh metan thì phải thay đổi thành phần mơi trƣờng v| điều kiện nuơi cấy. Ví dụ: xạ khuẩn phải nuơi trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, cịn vi khuẩn sinh metan lại nuơi trong điều kiện yếm khí bắt buộc. Bảng 5. Mơi trường nhân giống Glucose 0,5 – 1 % Cao ngơ 1 – 2 % Clorua coban 1,5 – 2 ppm Pepton 0,1 % Dầu đậu nành 0,1 – 2 % pH 6,9 - 7 Nhiệt độ tiệt trùng 1210C Thời gian tiệt trùng 30 phút  Các biến đổi  Sinh học: - Vi khuẩn Prop.shermanii sử dụng cơ chất trong mơi trƣờng để tăng sinh khối. - H|m lƣợng cơ chất trong mơi trƣờng giảm theo thời gian, sinh khối vi khuẩn tăng.  Thiết bị nhân giống - Thiết bị cĩ dạng hình trụ đứng v| đƣợc chế tạo bằng thép khơng rỉ. Bên trong thiết bị cĩ hệ thống cánh khuấy. Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho t{c nh}n điều nhiệt để ổn định nhiệt độ canh trƣờng trong quá trình nhân giống. - Phần trên nắp thiết bị cĩ các cửa với nhiều chức năng kh{c nhau: cửa thơng cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho khơng khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH…Cửa nạp mơi trƣờng v| th{o canh trƣờng ra khỏi thiết bị thƣờng đƣợc bố trí ở phần đ{y. Ngo|i ra trong thiết bị cịn cĩ những đầu dị pH, nhiệt độ, oxy… để nhà sản xuất cĩ thể theo dõi các giá trị này trong quá trình nhân giống. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 23 Hình 7. Thiết bị nhân giống 1. Hệ thống điều nhiệt(nh}n giống trong erlen). 2. Bình nh}n giống trung gian. 3. Thiết bị nh}n giống. 4. Hệ thống lọc t{ch bụi v| vi sinh vật. 5. Valve. 6. Bộ phận lọc hơi. 7. Bộ phận đo pH.  Thơng số cơng nghệ - Dung tích erlen: 1 lít - Dung tích thiết bị nhân giống: 1m3 - Nhiệt độ nuơi cấy: 28-320C - pH=6.9-7 - Thời gian nuơi cấy: 7-8 ngày Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 24 2. CHUẨN BỊ MƠI TRƢỜNG LÊN MEN  Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men.  Thành phần mơi trƣờng Mơi trƣờng lên men bao gồm: Nguồn cacbon, nguồn Nitơ, yếu tố tăng trƣởng, muối dinh dƣỡng, cobalt, glycine và cĩ thể thêm sodium cyanide. - Nguồn cacbon là carbohydrate (dextrose, maltose, xylose, syrup bắp, sucrose, mật rỉ), acid hữu cơ nhƣ l| acid lactic. Khối lƣợng các hợp chất này chiếm từ 0,5% - 10% khối lƣợng mơi trƣờng nuơi cấy. - Nguồn Nitơ l| c{c protein trong soybean, yến mạch, bắp, bột mì, dịch chiết nấm men, nƣớc Whey...Khối lƣợng chiếm 1% - 5% khối lƣợng mơi trƣờng nuơi cấy. - Yếu tố tăng trƣởng cho vi sinh vật nhƣ l| dịch chiết nấm men, dịch khoai tây, bắp. - Muối: ammonium sulfate, magnesium sulfate, potasseum phosphate dibasic, potassium phosphate monbasic. Hợp chất cobalt: cobalt chloride, sulfate, nitrate. Bảng 6. Thành phần mơi trường lên men Mật rỉ 4% Glucose 0,5 - 1% CaCO3 0,1% Clorua coban 1,5 - 10 ppm - Khi thêm glycine v|o mơi trƣờng lên men nhƣ l| 1 chất bổ sung dinh dƣỡng thì h|m lƣợng vitamin B12 sẽ tăng lên. Trong khi một số loại acid amin nhƣ analine, leucine, isoleucine, tyrosine, methionine, acid glutamic khơng l|m tăng m| ngƣợc lại cĩ thể làm giảm h|m lƣợng vitamin B12. - Trong sản xuất ngƣời ta bổ sung thêm 5,6 - dimetylbenzinaldazol l|m tăng sự tổng hợp vitamin B12. Ngồi ra, muối cobalt cũng đƣợc bổ sung v|o mơi trƣờng với nồng độ 3 - 5µg/l. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 25  Các biến đổi: - Sinh học: Các loại vi sinh vật khơng mong muốn nhiễm vào mơi trƣờng bị ức chế, tiêu diệt.  Thiết bị sử dụng: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20  Cấu tạo: gồm thùng chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng, bơm ly t}m, bộ đun nĩng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thơng số của quá trình.  Nguyên tắc hoạt động: Trƣớc khi bắt đầu hoạt động tất cả các thiết bị, đƣờng ống dẫn và phụ tùng YHC đƣợc thanh trùng bằng hơi qu{ nhiệt. Hơi nƣớc đƣợc đƣa v|o bộ đun nĩng theo đƣờng viền của van điều chỉnh tiêu hao hơi, sau đĩ v|o bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt v| theo đƣờng viền của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát. Cùng lúc mở các van xả nƣớc ngƣng v| khi đạt đƣợc nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng. Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của mơi trƣờng dinh dƣỡng, mơi trƣờng mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nĩng.  Thơng số cơng nghệ: - Nhiệt độ: 1210C. - Thời gian tiệt trùng: 30 phút. - pH=6.5-7. - Tốc độ bơm mơi trƣờng: 3.5 m3/s. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 26 Hình 8. Thiết bị tiệt trùng YHC 1- Thùng chứa 2- Bơm 3- Bộ đun nĩng 4- Bộ giữ nhiệt 5- Bộ lấy mẫu 6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát 8- Thiết bị lên men 3. LÊN MEN  Mục đích: Khai th{c: L|m tăng hàm lƣợng vitamin trong tế bào vi sinh vật  Các biến đổi:  Quá trình lên men gồm cĩ 2 giai đoạn: - Giai đoạn đầu kị khí, - Giai đoạn sau hiếu khí.  Thời gian cho mỗi giai đoạn là 72 - 88 giờ. - Vật lý: Nồng độ vitamin B12 sẽ tăng nhanh trong giai đoạn hiếu khí, khoảng 25 – 40 mg vitamin B12/l. - Hĩa học: pH mơi trƣờng thay đổi. Ta điều chỉnh pH bằng cách thêm dextrose, sucrose, hoặc thêm ammonium hydroxide, potassium phosphate dibasic, urea, calcium carbonate. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 27  pH tối ƣu của mơi trƣờng lên men vào khoảng 7 – 7,5. Nếu pH qu{ cao, mơi trƣờng mang tính kiềm, nĩ sẽ phân hủy sản phẩm cuối, hoặc ngăn cản quá trình tạo thành vitamin B12, vì thế h|m lƣợng vitamin B12 sẽ giảm đi.  Nếu pH quá thấp, tốc độ tăng trƣởng của vi sinh vật bị kiềm hãm, dẫn đến giảm h|m lƣợng vitamin B12. Nhiệt độ tối ƣu cho qu{ trình lên men là 28 - 320C. - Sinh học: Vi sinh vật sinh tổng hợp vitamin B12 trong tế bào.  Đ}y l| một quá trình rất phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn khác nhau nhờ sự tham gia của rất nhiều enzym.  Quá trình bắt đầu bằng sự tạo th|nh c{c porphinin, sau đĩ l| gắn nucleotat và các thành phần khác vào. Porphinin của vitamin B12 khác với porphinin của xitocrom, clorofin ở chỗ nĩ chứa rất nhiều nhĩm – CH2CH2COOH và – CH3. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 28  Coban trong cấu tạo vitamin B12 đƣợc gắn vào bằng ba hĩa trị thơng thƣờng và ba hĩa trị phụ. Chính cơban tạo m|u đỏ cho vitamin B12.  Sự tạo thành porphinin bắt đầu từ succinat (đ}y l| sản phẩm trung gian của chu trình Krebs). Dẫn xuất của axit xucxinic là succinyl - CoA sẽ kết hợp với glyxin và tạo thành chu trình succinat-glyxin. Từ đĩ porphinin đƣợc tạo th|nh trên cơ sở acid -  - amino -  - cetoadipic sinh ra đƣợc khử cacboxyl thành monopyrol porphobilinogen  Coenzym B12 là một hợp chất cĩ 5 - dezoxyadenozyl ở vị trí của nguyên tử Carbon trung tâm thay cho nhĩm xianit. Coenzym corinoid tham gia vào phản ứng của các metylmalonyl - mutaza là phản ứng chuyển succinyl - CoA thành metylmalonyl - CoA trong lên men propionic.  Dƣới tác dụng thơng khí, cacbinamit-5-dezoxyadenozin đƣợc chuyển thành 5,6 – dimetyl - benzinmidazol cobanit – 5 - dezoxyadenozin tức là phần quan trọng nhất đối với sự tạo thành vitamin B12.  Bên cạnh acid propionic, acid acetic cũng đƣợc sản xuất trong điều kiện yếm khí, với tỉ lệ 2:1. Acid propionic ở h|m lƣợng thấp cĩ thể ức chế các vi sinh vật nhiễm v|o mơi trƣờng lên men nhƣ vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn acid acetic. Propionibacterium cĩ thể chịu đƣợc nồng độ acid propionic xấp xỉ 20g/l (pH lên men gần bằng 7), đ}y cũng l| nồng độ tại đĩ sự tạo thành acid propionic bị kiềm hãm. Acid propionic khơng phân ly là chất độc đối với Propionibacterium shermanii. Tốc độ sinh trƣởng riêng giảm nhanh khi nồng độ acid propionic trên 5 mM. H|m lƣợng acid propionic lớn nhất chấp nhận đƣợc khi lên men đạt 25 - 35g sinh khối/l. H|m lƣợng acid propionic là 1 yếu tố hạn chế sự tăng sinh khối, và sản xuất vitamin B12.  Thiết bị lên men: Ta sử dụng hệ thống gồm nhiều bình lên men nối tiếp. Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tƣơng tự nhƣ thiết bị nhân giống vi sinh vật. Chúng cũng cũng cĩ dạng hình trụ đứng, đƣợc chế tạo từ vật liệu thép khơng rỉ. Bên trong thiết bị cĩ hệ thống cánh khuấy v| c{c đầu dị nhiệt độ, pH… để cĩ thể theo dõi trực tiếp các thơng số cơng nghệ trong quá trình lên men. Motor cho cánh khuấy thƣờng đƣợc đặt phía trên nắp thiết bị. Cịn Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 29 cửa nạp v| th{o mơi trƣờng đƣợc bố trí phía đ{y. Ngo|i ra thiết bị cịn cĩ cửa quan sát, van lấy mẫu… Hình 8. Thiết bị lên men Hình 9. Thiết bị lên men vitamin B12 trong cơng nghiệp  Thơng số cơng nghệ của thiết bị lên men - Thơng khí bằng cách khuấy đảo liên tục. - Tốc độ thơng khí: 0.5 lít/phút. - Lên men trong 6 - 8 ngày. - Nhiệt độ lên men 28 - 300C. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 30 4. LY TÂM  Mục đích: - Chuẩn bị:Tách sinh khối ra khỏi canh trƣờng lên men, chuẩn bị cho quá trình acid hĩa thu vitamin B12. - Khai thác: Tập trung vi khuẩn thành váng trên bề mặt để thu sinh khối vi sinh vật.  Các biến đổi: - Vật lý: Độ nhớt dung dịch giảm, nhiệt độ dung dịch tăng. Thực tế c{c cobamide đƣợc hình th|nh trong qu{ trình lên men đƣợc tích tụ trong tế b|o. Bƣớc đầu tiên l| t{ch tế b|o từ mơi trƣờng lên men. M{y ly t}m tốc độ cao đƣợc sử dụng để tập trung vi khuẩn th|nh v{ng trên bề mặt, trong khi m|ng lọc đƣợc sử dụng để t{ch tế b|o.  Thiết bị sử dụng: thiết bị ly tâm lọc. Trên thành thùng quay của máy ly tâm lọc cĩ đục lỗ v| đƣợc bọc bằng các lớp lƣới hoặc vải cĩ kích thƣớc lỗ phù hợp với tính chất sản phẩm. Dƣới tác dụng của lực ly tâm pha lỏng bắn ra qua các lỗ, pha rắn nằm lại trên thành máy. Hình 10. Máy ly tâm lọc  Thơng số cơng nghệ - Tốc độ quay: 4000 vịng/phút. - Năng suất nhập liệu: 363 lít/ phút. - Cơng suất động cơ: 30 KW. - Khối lƣợng thiết bị: 1.9 tấn. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 31 5. ACID HĨA Vào lúc kết thúc quá trình thì coenzym B12 trong tế b|o đƣợc giải phĩng nhờ phƣơng ph{p acid hĩa bằng cách bổ sung KCN m| đƣợc chuyển thành cyancobalamin tức là vitamin B12 thật sự.  Mục đích: Khai th{c: Sau khi li t}m để thu tế bào vi sinh vật, ta sẽ tiến hành acid hĩa để giải phĩng vitamin B12 là sản phẩm nội bào của vi sinh vật.  Các biến đổi: Sinh học: Dƣới t{c động của acid, nhiệt, cyanide hoặc c{c phƣơng pháp khác sẽ phá vỡ thành tế bào vi sinh vật, giải phĩng vitamin B12. Biện pháp bổ sung dung dịch cyanide để phân ly coenzyme khỏi vitamin và kết quả là tạo thành cyanocobalamin.  Thiết bị sử dụng: cánh khuấy tháo liệu bộ phận gia nhiệt sinh khối acid Hình 11. Thiết bị acid hĩa  Thơng số cơng nghệ: - Đƣờng kính cánh khuấy: 0.5m - Tốc độ cánh khuấy: 120 rpm. - Nhiệt độ bộ phận gia nhiệt: 550C Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 32 6. HẤP PHỤ Chất lỏng chứa vitamin B12 và tạp chất đƣợc tiếp xúc với 1 chất hấp phụ nhƣ divinylbenzene/styrene copolymer resin ở nhiệt độ 10 - 300C, và vitamin B12 chỉ đƣợc hấp phụ bởi resin.  Mục đích: Khai th{c: l|m tăng h|m lƣợng vitamin B12 bằng cách hấp phụ vitamin trên divinylbenzene/styrene copolymer resin, tách vitamin khỏi tạp chất.  Các biến đổi:  Hĩa lý: Vitamin B12 đƣợc hấp phụ bởi nhựa trao đổi ion cation (cation ion exchange resin), vitamin sẽ bền vững hơn, đặc biệt trong điều kiện cĩ acid và chất bất lợi nhƣ acid ascorbic, kim loại… - pH giảm trong quá trình hấp phụ đến vùng resin hoạt động hiệu quả. - Nhiệt độ quá trình này vào khoảng 15 - 250C, cĩ thể thấp hơn hoặc cao hơn, 1 gam resin cĩ thể hấp thu 1,5 gam vitamin B12. - Tuy nhiên điều này cịn phụ thuộc v|o độ tinh sạch của vitamin, nồng độ của dung dịch, nhiệt độ, resin, pH, và các yếu tố khác. Hình 12. Ion exchange resin Resin là acid polyacrylic hoặc acid polymethacrylic, m| trong đĩ cĩ những phân tử nối với nhĩm divinyl thơm nhƣ l| divinylbenzenne. Resin cĩ tên thƣơng mại là Amberlites.  Vật lý: Sự hiện diện của muối vơ cơ hịa tan trong qu{ trình hấp phụ vitamin B12 bằng resin sẽ làm giảm một cách tích cực tỉ lệ hấp phụ.  Thơng số cơng nghệ: - Kích thƣớc resin: 10-8 – 10-7 m, tối thiểu là 10-4m, diện tích bề mặt riêng: ít nhất là 200m2/g Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 33 - Một số loại resin: Amberlite XAD-2, DIAION HP-20, HP-21, HP-2 mG.  Nguyên nhân của việc lựa chọn resin để hấp phụ vitamin B12 Vitamin B12 đƣợc hấp phụ trên resin thì khơng bị ảnh hƣởng bởi dịch dạ d|y, qua hệ thống dạ d|y, xuống ruột, pH cao hơn, vitamin sẽ tho{t khỏi resin, đi v|o hệ thống ruột. Để kiểm chứng điều n|y ta l|m nhƣ sau:  Pha 1 lít dung dịch chứa 1.4g NaCl, 0.5g KCl, 0.06g CaCl2, 6.94 g acid HCl 36%, 3.2g pepsin.  Hịa tan 2g resin đã hấp thu vitamin B12 vào 200ml dung dịch, để trong 4h. Kết quả là chỉ cĩ dƣới 10% vitamin B12 bị tách khỏi resin, hơn 90% vitamin vẫn cịn lại trên resin.  Tuy nhiên, với dịch ruột gồm NaHCO3 và dịch tụy, thì trong vịng 30 phút, tồn bộ vitamin bị tách khỏi resin. Một thí nghiệm khác là trộn 6.88g resin cĩ chứa vitamin B12 với 7.5g acid ascorbic, 17.82g sucrose, 14.62g lactose, 3.56g bột bắp, thêm 4.5 ml dung dịch gum acacia, sau đĩ sấy ở 1200C, rồi ép thành viên. Sau 4 tuần, ở 500C, hàm lƣợng vitamin B12 vẫn cịn nhiều, khá bền với nhiệt. Hoặc ta cĩ thể trộn 10mg resin-vitamin B12 với 10g vitamin B1, 10g riboflavin, 50g niacinamide, 5g calcium pantothenate, đĩng th|nh viên.  Yêu cầu: Những tế b|o chƣa bị acid hĩa cũng đƣợc hấp phụ trên resin, để tránh làm tổn hại đến những tế bào này, ta phải tiến h|nh trong điều kiện mơi trƣờng trung tính, tránh nhiệt độ quá cao. Dịch lên men phải tƣơng đối tinh sạch: khơng chứa các tạp chất màu, mùi khĩ chịu. Qu{ trình hấp phụ diễn ra ở nhiệt độ phịng, gi{ trị pH tối ƣu v| thời gian tối ƣu tiếp xúc tiếp xúc với resin phụ thuộc v|o chất lƣợng dung dịch chứa vitamin v| h|m lƣợng tạp chất trong dung dịch. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 34 7. GIẢI HẤP  Mục đích: Khai th{c: tăng h|m lƣợng vitamin B12, rửa resin bằng dung dịch đệm pH thu hồi vitamin B12 và thu hồi resin để tái sử dụng.  Các biến đổi: Sau đĩ resin n|y đƣợc đem rửa với nƣớc hoặc dung dịch cồn cĩ độ cồn thấp hơn 20%, hoặc dung dịch acid yếu. Dung dịch thu đƣợc cĩ thể chứa cồn ở nồng độ 20% methanol, 10% ethanol hoặc 5% isoprpanol, hoặc 1 dung dịch acid yếu nhƣ dung dịch acid phosphoric 1%, acid acetic 1%, acid boric 1%, hoặc acid clohydric 0,1%. Quá trình phân tách vitamin B12 bao gồm: 1. Mang dung dịch chứa vitamin B12 và tạp chất tiếp xúc với divinylbenzene/styrene copolymer resin. 2. Vitamin B12 đƣợc hấp phụ trên resin. 3. Dùng chất rửa thích hợp để thu hồi vitamin B12. Chất rửa là dung dịch chứa nƣớc cĩ các hợp chất đƣợc chọn lọc từ ketone mạch ngắn, ester mạch ngắn, ether mạch ngắn. 4. Thu dung dịch rửa.  Thiết bị sử dụng: Ta sử dụng thiết bị hấp phụ kết hợp giải hấp Hình 13. Thiết bị giải hấp Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 35 8. CƠ ĐẶC  Mục đích: - Chuẩn bị cho quá trình kết tinh vitamin B12. - Khai th{c: tăng nồng độ vitamin trong dung dịch đến nồng độ 15- 30%. H|m lƣợng vitamin B12 là 4-7 mg/kg.  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, nhiệt độ tăng. - Hĩa lý: Nƣớc từ trạng thái lỏng chuyển qua trạng th{i hơi v| tho{t ra mơi trƣờng xung quanh.  Thiết bị sử dụng: Qu{ trình cơ đặc đƣợc thực hiện bằng thiết bị cơ đặc chân khơng với buồng đốt cĩ ống tuần hồn ngồi và cĩ kèm theo thiết bị ngƣng tụ Baromet. Hình 14. Thiết bị cơ đặc chân khơng  Thơng số cơng nghệ PCK 720mmHg Phơi  2kg/cm2 Thời gian 23h (khi đạt Bx yêu cầu) Nhiệt độ 800C Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 36  Nguyên tắc hoạt động Dung dịch đi v|o buồng đốt đƣợc đun sơi để tạo th|nh hỗn hợp hơi lỏng đi v|o buồng bốc, ở đ}y hơi thứ đƣợc t{ch ra v| đi lên phía trên. Dung dịch quay về buồng đốt theo ống tuần ho|n ngo|i. Thiết bị hoạt động theo nguyên tắc đối lƣu tự nhiên do sự chênh lệch khối lƣợng riêng ở những vùng nguyên liệu cĩ nhiệt độ kh{c nhau. Ở buồng bốc, nguyên liệu bốc hơi l|m tăng độ Bx, dẫn đến l|m tăng khối lƣợng riêng, ở buồng đốt đƣợc gia nhiệt nên khối lƣợng riêng nhẹ hơn. Do vậy m| nguyn liệu sẽ tuần ho|n từ buồng bốc sang buồng đốt v| đẩy nguyn liệu từ buồng đốt sang buồng bốc. Khi nồng độ chất khơ đạt yêu cầu, dung dịch sẽ đƣợc xả xuống theo từng mẻ. Hỗn hợp lỏng – hơi trong buồng bốc đƣợc ph}n ly nhờ hai yếu tố: chiều cao buồng bốc v| sự thay đổi qu{n tính của hỗn hợp khi v|o bộ phận t{ch bọt. Hơi thứ đi v|o thiết bị Baromet v| đƣợc l|m nguội tại đ}y. 9. KẾT TINH  Mục đích: - Khai th{c: h|m lƣợng vitamin tăng lên - Hồn thiện : độ tinh sạch của vitamin cao hơn  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, độ nhớt giảm, nhiệt độ giảm. - Hĩa lý: trong quá trình kết tinh, biến đổi hĩa lý là chủ yếu.Nƣớc bị bốc hơi l|m độ hịa tan của vật liệu giảm, dung dịch dần đạt đến trạng thái bão hịa và quá bão hịa. Cĩ sự tạo mầm tinh thể, sau đĩ c{c tinh thể vitamin lớn lên theo yêu cầu. - Một phần dung mơi đƣợc bay hơi. Hơi bay ra theo đƣờng bơm ch}n khơng. Nhiệt độ của dung dịch ở trạng thái bão hịa sẽ giảm đến nhiệt độ sơi tƣơng ứng với áp suất chân khơng trong thiết bị. Dung dịch đạt quá bão hịa và kết tinh. Dung mơi bay hơi khơng chỉ do nhiệt độ vật lý của dung dịch mà cịn do sự tỏa nhiệt khi kết tinh. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 37 - Kết tinh tiến h|nh đồng thời bay hơi do hút ch}n khơng v| l|m lạnh sẽ làm quá trình diễn ra nhanh hơn, do đĩ c{c tinh thể sẽ hạn chế dính vào bề mặt thiết bị và thời gian rửa thiết bị sẽ đƣợc rút ngắn.  Thiết bị: thiết bị kết tinh chân khơng Hình 15. Thiết bị kết tinh chân khơng  Thơng số cơng nghệ: - Áp suất chân khơng: 720mmHg - Nhiệt độ: 300C - Thời gian : 2 - 3h Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 38 10. LY TÂM  Mục đích: - Chuẩn bị: chuẩn bị cho quá trình sấy tiếp theo - Khai th{c: tăng h|m lƣợng vitamin - Hồn thiện: độ tinh sạch của sản phẩm vitamin càng cao  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích hỗn hợp giảm do nƣớc và các tạp chất đƣợc tách ra.  Thiết bị: máy lọc ly tâm Hình 16. Thiết bị lọc ly tâm  Thơng số cơng nghệ: - Tốc độ quay: 1000 vịng/phút - Thời gian ly tâm: 6 phút. - Năng suất nhập liệu: 300 lít/phút - Cơng suất động cơ: 30 KW - Khối lƣợng thiết bị: 1 tấn Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 39 11. SẤY  Mục đích: - Hồn thiện: sản phẩm vitamin khơ.  Các biến đổi: - Vật lý: thể tích giảm, nhiệt độ hỗn hợp tăng - Hĩa lý: nƣớc bốc hơi  Thiết bị: thiết bị sấy chân khơng hai nĩn Hình 17. Thiết bị sấy chân khơng 2 nĩn - Thiết bị n|y đƣợc dùng phổ biến để sấy những nguyên liệu nhạy cảm với nhiệt độ. Thiết bị hình trụ cĩ lớp vỏ áo gia nhiệt bằng hơi hoặc dầu. Quá trình gia nhiệt đƣợc thực hiện dƣới điều kiện chân khơng, tốc độ khuấy nhẹ nhàng. - Thiết bị n|y cĩ {p suất cao, ngay cả trong trƣờng hợp dung mơi ít bay hơi, cho sản phẩm cĩ độ ầm thấp. Bề mặt hình học của của lớp {o nhiệt, cho phép giảm thời gian của giai đoạn sấy, l|m tăng tính ổn định v| chất lƣợng của sản phẩm. Bụi sinh ra trong qu{ trình sản xuất sẽ đƣợc khử bởi hệ thống lọc đặt phía trên hệ thống t{ch hơi nƣớc. Thiết bị n|y đƣợc dùng để sản xuất trong điều kiện vơ trùng. - Đối với thiết bị sấy ch}n khơng, ngƣời ta thƣờng dùng thùng hình nĩn. - Hệ thống kiểm so{t bụi bằng thiết bị lọc đặt trên đƣờng ống bơm chân khơng Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 40 Hình 18. Thiết bị sấy chân khơng  Thơng số cơng nghệ: - Nhiệt độ: 40 - 450C - Áp suất chân khơng: 720mmHg Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 41 Phần IV: SẢN PHẨM Tinh thể vitamin B12 tạo th|nh cĩ m|u đỏ do cĩ chứa kim loại coban, cĩ kích thƣớc kh{c nhau. Sau đĩ ngƣời ta sẽ dùng nguyên liệu n|y để tạo thành các sản phẩm dƣợc phẩm chứa vitamin B12 trên thị trƣờng. Hình 19. Tinh thể vitamin B12  Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm Hình 20. Sản phẩm bột vitamin B12 Bảng 7. Chỉ tiêu sản phẩm vitamin B12 Cyanocobalamin 93% khối lƣợng Độ ẩm ≤ 8% Vi sinh Khơng cĩ M|u sắc Sản phẩm m|u đỏ nhạt, bột rời, khơng kết dính Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 42  Quy trình sản xuất viên con nhộng hay viên nén chứa vitamin B12 Hình 21. Sản phẩm viên nén chứa vitamin B12 a. Viên con nhộng hay viên nén vitamin thƣờng chứa các chất phụ gia thêm vào trong quá trình sản xuất để cơ thể cĩ thể hấp phụ đƣợc các vitamin này. Lactose, calci hoặc malto - dextrin đƣợc dùng làm chất độn trong các viên vitamin. Magie stearat hoặc acid stearic thƣờng đƣợc thêm vào viên nén với vai trị là chất bơi trơn. C{c phụ gia này giúp bột vitamin dễ nén thành viên hoặc thành viên con nhộng. Tinh bột hoặc gum cellulose biến tính thƣờng đƣợc cho v|o nhƣ l| một tác nhân làm phân hủy. Nĩ giúp hợp chất vitamin dễ hấp phụ trong cơ thể ngƣời. Viên nén vitamin thƣờng đƣợc bọc một lớp áo ngo|i để tạo màu sắc, hƣơng vị riêng.Điều n|y giúp x{c định cách hấp phụ thuốc trong cơ thể. Những lớp {o n|y đƣợc làm từ cellulose. b. Nhiều loại thảo mộc, chất kho{ng nhƣ canxi, sắt, kẽm đƣợc thêm vào hợp chất vitamin. c. Kiểm tra nguyên liệu Nhà sản xuất vitamin sẽ mua những nguyên liệu vitamin từ các nhà phân phối uy tín. Nguyên liệu vitamin đƣợc cung cấp phải cĩ chứng nhận phân tích thành phần. Trong nhiều trƣờng hợp, nhà sản xuất sẽ gửi mẫu nguyên liệu đến nhiều phịng thí nghiệm độc lập để phân tích. d. Nhào trộn sơ bộ Nếu nguyên liệu khơng đƣợc kết hạt tốt, nĩ sẽ lọt qua máy xay và trở thành cặn. Một v|i vitamin đƣợc nhào trộn sơ bộ với các chất độn nhƣ malto-dextrin. Kỹ thuật viên phịng thí nghiệm cĩ thể kiểm tra nhanh các mẻ Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 43 nguyên liệu khi làm việc với các thành phần mới và quyết định cĩ cần thiết phải nhào trộn khơng. e. Làm ẩm nguyên liệu Đối với viên nén vitamin, kích thƣớc viên thuốc rất quan trọng để x{c định sự tạo hình bằng máy tạo viên nén. Trong nhiều trƣờng hợp, nguyên liệu vitamin đƣợc cung cấp từ các nhà phân phối đã cĩ kích cỡ thích hợp cho sự tạo viên. Tuy nhiên một số trƣờng hợp cần phải làm ẩm nguyên liệu để tạo điều kiện cho quá trình kết hạt. Hình 22. Khuấy trộn thuốc Trong qu{ trình n|y, bột vitamin đƣợc trộn với nhiều loại cellulose, sau đĩ đƣợc l|m ẩm. Sau đĩ, hỗn hợp đƣợc sấy khơ bằng m{y sấy. Sau khi sấy khơ, hỗn hợp đƣợc đi qua m{y nghiền. Dƣới t{c dụng của m{y nghiền, c{c m|nh nguyên liệu lớn sẽ đƣợc l|m nhỏ hơn v| đạt đƣờng kính mong muốn. Sau đĩ hỗn hợp n|y sẽ đƣợc đem c}n v| trộn. f. Cân và trộn Tiếp theo, cơng nhân sẽ đem c}n hỗn hợp nguyên liệu. Sau khi cân, dùng máy trộn để trộn đều hỗn hợp khoảng 15-30 phút. Sau khi hồn tất quá trình trộn, hỗn hợp sẽ đƣợc đem ép th|nh viên nén hay viên con nhộng. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 44 Hình 23. Sơ đồ tạo viên con nhộng và viên nén Hỗn hợp vitamin đƣợc ép th|nh viên, cĩ thể đƣợc bọc {o hoặc l|m th|nh viên con nhộng. g. Đ{nh bĩng v| kiểm tra Viên con nhộng vitamin đƣợc đƣa v|o m{y đ{nh bĩng. Bụi hoặc bột vitamin sĩt lại sẽ đƣợc chải sạch. h. Tạo viên Viên nén vitamin đƣợc tạo th|nh từ m{y ép viên. Sau khi hỗn hợp vitamin đƣợc trộn trong m{y trộn, nĩ sẽ đƣợc đổ v|o phễu gắn phía trên m{y trộn v| đƣợc ép th|nh viên dƣới t{c dụng của {p suất. Tốc độ quay của thiết bị sẽ quyết định năng suất tạo viên. Sau đĩ viên nén đƣợc đƣa qua s|ng rung để loại c{c hạt bụi rồi đƣợc chuyển đến bộ phận bọc {o. i. Bọc áo Việc bọc {o giúp viên thuốc dễ nuốt, giúp {t mùi vị khĩ chịu của thuốc, làm viên thuốc cĩ m|u sắc mong muốn. Việc bọc {o cịn giúp chống lại acid dạ d|y để viên thuốc cĩ thể đƣợc hấp phụ tại ruột. Sau khi đƣợc bọc {o, tiến h|nh sấy thuốc để chuẩn bị đĩng gĩi. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 45 Phần V: THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ I. Nghiên cứu khám phá ra bí ẩn cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp vitamin B12: Ð}y l| biểu đồ hình dải băng của enzym BluB m| c{c nh| nghiên cứu của MIT đã cho thấy việc xúc t{c tạo th|nh DMB ,một đoạn của vitamin B12. Những hình que (m|u v|ng, đỏ v| xanh dƣơng) đại diện cho những cofactor m| enzym bù đắp để tạo nên DMB. (Hiệu đính: phịng thí nghiệm Graham Walker). B12 l| vitamin phức tạp nhất về mặt hĩa học v| cần thiết cho sức khỏe của con ngƣời. 4 giải thƣởng Nobel đã đƣợc trao tặng cho những nghiên cứu liên quan đến B12 nhƣng cĩ 1 đoạn của ph}n tử vẫn cịn l| bí ẩn cho đến ng|y nay. Khoa học đã tìm ra một vi sinh vật đột biến cĩ 1 enzyme ở thể khuyết đƣợc biết đến nhƣ l| BluB l|m cho nĩ khơng thể tổng hợp đƣợc B12. BluB l|m chất xúc t{c cho sự hình th|nh một đoạn B12 v| DMB nối với 1 đoạn kh{c tạo nên vitamin, DMB cũng cĩ thể đƣợc sản xuất theo một c{ch riêng biệt kh{c. Một trong những khía cạnh bất thƣờng nhất trong qu{ trình tổng hợp với chất xúc t{c BluB l| sự bù đắp cofactor lấy từ 1 vitamin kh{c l| B2. Trong suốt qu{ trình phản ứng, cofator B2 t{ch ra th|nh hơn 2 đoạn m| một đoạn trong đĩ sẽ trở th|nh DMB. Bình thƣờng, cofactor bắt nguồn từ B2 sẽ tham gia phản ứng bằng c{ch giữ electron tạm thời v| sau đĩ cho eletron đi. Những cofator đĩ khơng đƣợc dùng trong phản ứng. Sự bù đắp cofactor rất ít đƣợc quan s{t trƣớc khi tổng hợp vitamin hay theo bất cứ con đƣờng tổng hợp sinh học n|o. Hầu nhƣ khơng cĩ một dẫn chứng kh{c về việc cofactor đƣợc dùng nhƣ chất nền. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 46 Một đầu mối ban đầu về chức năng của BluB l| cĩ một gen liên kết với nĩ nằm gần nhiều những gen kh{c liên quan đến sự tổng hợp B12 trong một loại vi khuẩn kh{c.. Vấn đề tại sao vi khuẩn trong đất cĩ thể tổng hợp đƣợc vitamin B12 vẫn đang đƣợc nghiên cứu. Vi sinh vật trong đất khơng địi hỏi phải cĩ B12 để tồn tại, v| c}y n|o m| chúng b{m v|o cũng khơng cần B12, việc tổng hợp B12 cĩ thể giúp vi khuẩn cĩ khả năng chống lại những ‚th{ch thức‛ do c}y cối g}y ra trong suốt qu{ trình hình th|nh mối quan hệ cộng sinh. Cĩ hơn 30 gen liên quan đến quá trình tổng hợp vitamin B12 . II. Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 1. Nguyên lý chung: Kỹ thuật di truyền hiện đại l| kỹ thuật t{i tổ hợp gen. Nếu qu{ trình lai giống trong kỹ thuật di truyền cổ điển bị hạn chế trong c{c qu{ trình chuyển tải di truyền chỉ trong một lo|i thì trong kỹ thuật di truyền hiện đại khơng giới hạn trong một lo|i. Nếu kỹ thuật tạo đột biến(đột biến điểm) bằng c{c t{c nh}n hĩa học hay lý học trong kỹ thuật di truyền cổ điển giới hạn ở sự khơng định hƣớng của c{c biến đổi di truyền, thì trong kỹ thuật di truyền hiện đại ngƣời ta cĩ thể dự đo{n v| thu đƣợc những đột biến theo mong muốn. Nhƣ vậy, cĩ hai đặc điểm quan trọng của di truyền hiện đại l| khơng bị giới hạn lo|i v| c{c biến đổi di truyền cĩ định hƣớng. Kỹ thuật di truyền hiện đại dựa v|o những ph{t hiện quan trọng trong thế giới vi sinh vật a. Plasmid L| một loại DNA nằm ngo|i nh}n(nằm trong b|o tƣơng) đĩng vai trị nhƣ một chiếc thuyền, chuyên chở vật liệu di truyền từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c để tạo lập ra một hệ thống di truyền ho|n to|n mới cho cơ thể nhận. Plasmid chỉ cĩ ở vi khuẩn v| một v|i sinh vật cĩ cấu trúc đơn giản kh{c. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 47 Ngƣời ta sử dụng chúng nhƣ c{c vector chuyển tải vật chất di truyền rất hữu hiệu. C{c plasmid cĩ c{c đặc tính quan trọng sau: Plasmid cĩ kích thƣớc nhỏ hơn DNA trong nh}n. Plasmid cĩ mã di truyền ho|n to|n giống DNA trong nh}n. Plasmid cĩ khả năng truyền lại một số đặc tính di truyền đặc biệt cho thế hệ sau. b. Enzym cắt giới hạn C{c gen n|y thuộc hai loại exonuclease v| endo nuclease. Chúng cĩ khả năng cắt c{c gen cĩ trong DNA ra bắt đầu từ hai đầu của DNA hoặc cĩ thể tỏng DNA ở những vị trí x{c định. c. Enzym liên kết C{c gen đã ph}n cắt lại với nhau theo đúng trình tự đã đƣợc x{c lập. Ngo|i plasmid ra ngƣời ta cịn dùng rất nhiều vector kh{c để chuyển tải c{c gen từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c. 2. Xu hƣớng t{i tổ hợp: Hiện nay cĩ hai xu hƣớng thực hiện t{i tổ hợp: - Xu hƣớng chuyển gen vi sinh vật sang động vật hay thực vật nhằm cải tiến c{c tính trạng hoặc l|m tăng thêm tính trạng m| ta cần cho cơ thể động vật hay cơ thể thực vật. - Xu hƣớng chuyển gen của c{c vi sinh vật kh{c sang cho vi sinh vật v| biến tế b|o vi sinh vật nhƣ những nh| m{y sản xuất c{c chất cần thiết cho con ngƣời. Xu hƣớng n|y hiện nay đang đƣợc nghiên cứu kĩ do c{c nguyên nh}n sau: - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể đơn b|o cĩ chu kì sinh trƣởng rất ngắn, do đĩ chúng bắt buộc phải cĩ một qu{ trình trao đổi chất rất mạnh. Do đĩ sẽ dễ d|ng nghiên cứu chúng v| dễ d|ng thu nhận đƣợc một sản lƣợng lƣớn c{c sản phẩm trong một thời gian ngắn. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 48 - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể dễ đồng hĩa nhiều loại nguyên liệu kh{c nhau. Do đĩ nguyên liệu dùng cho qu{ trình sản xuất rẻ tiền v| dễ kiếm. - Cơ thể vi sinh vật l| cơ thể đơn b|o v| l| cơ thể sinh vật duy nhất cĩ khả năng thực hiện c{c qu{ trình sản xuất cơng nghiệp để sản xuất h|ng loạt v| cĩ kiểm so{t. 3. Thao t{c di truyền: Để thực hiện việc chuyển gen từ cơ thể n|y sang cơ thể kh{c, ngƣời ta thực hiện c{c giai đoạn cơ bản sau: a. T{ch DNA của vật cho Đ}y l| cơng việc đầu tiên đƣợc quyết định bởi tính trạng đặc biệt của một gen n|o đĩ trong DNA vật m| ta quan t}m. Trƣớc khi thu nhận gen n|y ta phải t{ch đƣợc DNA. Việc t{ch DNA đƣợc thực hiện trƣớc tiên bằng c{ch ph{ vỡ th|nh tế b|o. Đối với vật cho l| vi sinh vật, ngƣời ta thƣờng dùng lizozym. Sau đĩ ngƣời ta dùng dosysulfate 1% để loại protein. Sau 2,5 giờ lắc trên m{y lắc, ngƣời ta tiến h|nh ly t}m v| dùng pipet hút lấy phần dịch trên. Sau đĩ cho thêm ete với liều lƣợng tƣơng đƣơng, lắc mạnh v| li t}m trong 5 phút với tốc độ ly t}m 2000 vịng/phút. Khi đĩ DNA nằm ở lớp dƣới của ống ly t}m. Bằng c{ch n|y ta t{ch đƣợc DNA khỏi phenol v| protein. Bỏ lớp dịch trên kết tủa DNA bằng cồn. Ta cĩ thể nhận DNA bằng c{ch dùng đầu đũa thủy tinh cuộn sợi DNA ở đầu đũa thủy tinh. Nếu chƣa sử dụng ngay ta cĩ thể bảo quản DNA bằng cồn 70%/V v| để trong tủ lạnh. b. Chọn vector chuyển gen Vector chuyền gen thƣờng phải cĩ những yêu cầu cơ bản sau: Vector pahir cĩ trình tự sao chép để cĩ khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập. Vector phải cĩ trình tự điều hịa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã gen. Vector phải đảm bảo tính bền vững di truyền của DNA t{i tổ hợp ở dạng độc lập hoặc gắn thêm v|o nhiễm sắc thể của tế b|o chủ. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 49 Vector cĩ những gen đ{nh dấu để dễ d|ng ph{t hiện ra chúng hoặc c{c gen lạ gắn v|o. Vector cĩ những gen l|m vơ hiệu hĩa đoạn DNA khơng mong muốn bị gắn v|o. Vector chứa nhiều bản sao để t{ch đƣợc ra khỏi tế b|o với số lƣợng lớn v| dảm bảo sự khuyếch đại của gen nhƣ chất hoạt hĩa. T{c cĩ thể chọn c{c loại vector l| c{c plasmid, phage, cosmid để chuyển tải c{c đoạn DNA của vật cho sang vật nhận. c. Tiến h|nh việc chuyển gen Qu{ trình chuyển gen đƣợc thực hiện bằng nhiều phƣơng ph{p kh{ nhau. Hiện nay việc chuyển gen v|o tế b|o thực vật v| tế b|o động vật thƣờng đƣợc thực hiện bằng 2 c{ch: - Chuyển gen nhờ vector chuyển gen. - Dùng súng bắn gen Đối với những tế b|o kích thƣớc qu{ nhỏ khơng thể sử dụng phƣơng ph{p bắn gen đƣợc, do đĩ phƣơng ph{p chuyển gen nhờ vector chuyển gen đƣợc thực hiện nhiều hơn. Để thực hiện điều đĩ trƣớc tiên ngƣời ta phải dùng enzym cắt giới hạn c{c gen trong DNA của vật cho v| chuyển chúng v|o vector chuyển gen cĩ sự tham gia của ligase v| một số chất l|m tăng c{c qu{ trình n|y. Sau đĩ nhờ vector chuyển đoạn gen n|y sang cơ thể nhận. Cuối cùng l| kiểm tra tính trạng m| ta quan t}m ở cơ thể nhận cĩ đƣợc biểu hiện khơng.  Hệ thống thao t{c di truyền đối với lo|i vi khuẩn propionic C{c lo|i trong giống vi khuẩn propionic đƣợc sử dụng một c{ch rộng rãi trong việc sản xuất vitamin B12, c{c hợp chất tetrapyrole, acid propionic cũng nhƣ trong cơng nghiệp sản xuất phơmai v| propiotic. Shuttle vector đƣợc ph{t triển trong lo|i propionic để sử dụng replicon từ plasmid nội b|o trong vi khuẩn propionic v| Escherichia coli v| một tế b|o nhận thích hợp. Sự chuyển nạp hiệu quả ho|n th|nh khi vật chủ trung gian đƣợc chuẩn bị từ lo|i Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 50 vi khuẩn Propionic freudenreichii để vƣợt qua hệ thống high restriction modification trong vi khuẩn propionic. Vector chuyển gen với những chất hoạt hĩa tự nhiên đƣợc sử dụng trong lo|i vi khuẩn propionic cũng đƣợc ph{t triển. Sử dụng hệ thống n|y, cholesterol oxidase đƣợc sử dụng nhƣ enzym ph{t hiện, đƣuọc sản xuất nhờ lo|i P.freudenreichii. Gen chứa trong việc sinh tổng hợp acid 5-aminolevulinic(ALA) v| vitamin B12 của vi khuẩn propionic đƣợc ph}n lập. ALA trong vi khuẩn propionic cĩ thể đƣợc tổng hợp bằng cả con đƣờng C4( sự ngƣng tụ của glycin v| succinyl CoA) v| con đƣờng C5( từ glutamat). Gen hem A mã hĩa enzym ALA synthase từ lo|i Rhodobacter spheroides, ALA đƣợc tích lũy trong P.freudenreichii. Do đĩ, hệ thống thao t{c di truyền đối với lo|i vi khuẩn propionic sẽ tạo điều kiện cho việc nghiên cứu di truyền của qu{ trình sinh tổng hợp probiotic v| vitamin B12. Hình 24. Plasmids trong chủng vi khuẩn propionic Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 51 Khoảng 20% vi khuẩn propionic đƣợc tìm thấy mang một hoặc hai plasmid. Hình thù plasmid đƣợc phân biệt dựa trên bản đồ kích thƣớc. Kích thƣớc plasmid nằm trong khoảng 4.4Mdal tới 119Mdal hoặc cao hơn v| đƣợc đặt tên prGO1 tới prGO7, chủng P.freudenreichii chứa thơng tín plasmid đơn giản nhất trong khi chủng P.acidipropionici chỉ chứa plasmid 4.4 Mdal. Plasmid 4.4 Mdal, pRGO1 bình thƣờng đƣợc tìm thấy trong trong chủng P.acidipropionici, P.freudenreichii và P.jensenii. Plasmid pLME106(6.9 kb) và pLME108(3.6 kb) đã đƣợc tìm thấy trong P.jensenii và P. freudenreichii. Các plasmid p545 v| p546, đã đƣợc tìm thấy trong chủng P.freudenreichii LMG16545 và P.freudenreichii LMG16546, cs cùng kích thƣớc 3.6 kb và cĩ mối quan hệ mật thiết với nhau. Chuỗi nucleotit của plasmid pRGO1(số đăng kí AB007909), pLME106( số đăng kí AJ250233), pLME108(số đăng kí AJ006662) và p545(số đăng kí AF291751) đã đƣợc x{c định. Đặc biệt, plasmid pLME106 của P.jensenii chứa 100% chuỗi nucleotit đồng nhất với plasmid pRG01 của P.acidipropionici, trong khi phân tích chuỗi orf1 và orf2, mã hĩa sự sao chép các protein, RepA và RepB của plasmid pRGO1 cĩ 46%-53% tƣơng đồng với plasmid p545. Protein RepA cĩ tính tƣơng đồng với sự sao chép theta tìm thấy trong nhiều lồi vi khuẩn gram dƣơng cĩ h|m lƣợng GC cao, cho thấy plasmid pRGO1, pLME106 và p545 cĩ thể sao chép thơng qua sự sao chép kiểu theta. Thêm v|o đĩ, protein RepB cĩ thể đĩng vai trị trong sự sao chép plasmid ban đầu. III. Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: Trong c{c dƣợc chất, vitamin, đặc biệt l| vitamin B12 rất kém bền vững. Với phƣơng ph{p kiểm nghiệm mới l| phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu năng cao, việc ph{t hiện h|m lƣợng khơng đạt tiêu chuẩn của vitamin B12 trở nên dễ d|ng hơn. Vitamin B12 dễ hút ẩm, nếu tiếp xúc với mơi trƣờng ẩm dễ bị phân hủy đƣa đến giảm h|m lƣợng. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 52 Vì vậy trong thực tế, để sản xuất thuốc dạng viên nén, các nhà sản xuất dùng vitamin B12 bao gelatin kết hợp t{ dƣợc hút ẩm polyvinyl pyrrolidon (PVP) trong cơng thức để ổn định hoạt chất Do thuốc vitamin B1+B6+B12 đƣợc ƣa chuộng sử dụng nhiều nên một nhu cầu đặt ra là cần cải thiện việc sản xuất thuốc loại n|y nhƣ thế n|o để ổn định thuốc, giúp đạt chất lƣợng trong suốt thời hạn sử dụng. Phƣơng ph{p: nghiên cứu cải tiến bào chế vitamin B1+B6+B12 bằng c{ch dùng t{ dƣợc Kollidon CL-M để ổn định thuốc kết hợp với phân tán vitamin B12 ở trạng thái khơ thay vì hịa tan trong cồn nhƣ một quy trình sản xuất trƣớc đ}y đã l|m. Khí hậu nƣớc ta thuộc nhiệt đới ẩm, nên việc bảo quản thuốc tƣơng đối khĩ khăn.Ở thành phố Hồ Chí Minh nhiệt độ trung bình hằng năm l| 270C, độ ẩm trung bình l| 79.5%, l| điều kiện bất lợi cho việc bảo quản thuốc. Kollidon CL-M là sản phẩm thƣơng mại của PVP. Đ}y l| loại crospovidone khơng hịa tan, dạng hạt mịn, cĩ tác dụng ổn định thuốc Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 53 IV. Sản phẩm Tempeh 1. Quy trình sản xuất Tempeh Phơi khơ đậu nành Bĩc vỏ bằng thiết bị nghiền đá mài Lắng tách vỏ Ngâm lần 1 qua đêm ở nhiệt độ phịng Nấu trong 60 phút với nước ngâm Ngâm lần 2 qua đêm ở nhiệt độ phịng Phân loại theo kích cỡ Tháo nước và làm lạnh Cấy hỗn hợp bột “ragi tempeh” và 1 ít sắn hột Đĩng trong túi plastic (khoảng 200g) và bịt kín Tempeh Đặt trong lưới plastic Phun hơi hay nấu trong 30 phút Ủ trong giá tre trong khoảng 36 – 40 giờ Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 54 Sản xuất vitamin B12 trong quá trình lên men sản phẩm Tempeh Tempeh l| sản phẩm lên men truyền thống từ đậu n|nh của Indonesia. Sau khi ng}m, đậu đƣợc nấu hơn một lần. Sau giai đoạn lên men với chất nền dạng rắn, chúng đƣợc cấy chuyền với chủng mốc Rhizopus spp. Theo kiểu truyền thống thì đậu đƣợc ng}m qua đêm, sau đĩ đƣợc acid hĩa tức thời. Trong phƣơng ph{p cơng nghiệp dùng acid lactic. Tempeh quan trọng hơn vì chứa h|m lƣợng cao acid amin, acid béo v| vitamin. Vitamin quan trọng nhất l| B12, thƣờng khơng tìm thấy trong c{c thực phẩm thực vật. Trong c{c vi sinh vật sản xuất ra vit B12 thì giống Citrobacter freundii cho lƣợng vitamin B12 nhiều hơn cả. Giống Klebsiella pneumoniae cũng cho lƣợng lớn vit B12. C{c giống trong họ Enterobacteriaceae đƣợc biết cĩ thể sinh ra độc tố enterotoxin. Khuynh hƣớng ng|y nay l| nghiên cứu ảnh hƣởng của c{c biến số lên men v| cấu trúc của vit B12. 2. Nguyên liệu v| phƣơng ph{p Vi sinh vật: nấm mốc Rhizopus oligosporus đƣợc ph}n lập từ Tempeh, cung cấp lƣợng lớn c{c vitamin hịa tan trong nƣớc đƣợc sử dụng để lên men Tempeh. C.freubdii và K.pneumoniae đƣợc thêm v|o trong giai đoạn đầu lên men vì chúng tạo ra nhiều vitamin B12 suốt qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn. Quá trình lên men Tempeh: phƣơng ph{p hiện đại đƣợc tiến h|nh theo tiêu chuẩn: đậu n|nh (300g) đƣợc cấy v|o 1.8ml giống R. ologosporus (106 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×103 tế b|o/g đậu), đối với giống C.freubdii và K.pneumoniae (107 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×104 tế b|o/g đậu), nhiệt độ 320C trong 34 giờ. Phƣơng ph{p truyền thống đƣợc tiến h|nh (với C.freubdii) nhƣ sau: đậu đƣợc rửa sạch v| nấu với nƣớc đã khử kho{ng (3 lần) trong 30 phút. Trong giai đoạn l|m nguội, nƣớc ng}m ấy đƣợc cấy v|o C.freundii (3×107tế b|o/ml). Nhiệt độ khoảng 300C trong 15 giờ. Sau khi ph}n riêng nƣớc v| đậu, Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 55 đậu đƣợc t{ch bỏ vỏ, nấu lại sau 30 phút, sấy khơ bề mặt v| chia th|nh 2 phần. 1 phần đƣợc tiệt trùng (trong autoclave) trƣớc khi thực hiện qu{ trình SSF với Rhizopus sp , v| phần cịn lại khơng phải tiệt trùng. Một phần của đậu ng}m nh}n tạo v| 2 phần của phƣơng ph{p truyền thống đƣợc chia l|m 3 phần . 1 phần cấy Rhizopus sp và C.freundii, phần thứ 2 chỉ cấy cĩ Rhizopus sp và phần 3 cấy hoặc Rhizopus sp hoặc C.freundii (kiểm chứng). Sự biến đổi các thơng số quá trình lên men: Nhiệt độ cấy khi lên men cĩ thể l| 24, 28 v| 320C. Ảnh hƣởng của số lƣợng kh{c nhau của tế b|o vi khuẩn lên vit B12 đƣợc nghiên cứu từ 103 đến 108 bế b|o trên ml3 (tƣơng đƣơng 7-7×105 tế b|o/g đậu). Phân tích vit B12: mẫu thử nghiệm ph}n tích sự kh{c biệt giữa loại B12 (cobalamin) cĩ thể sử dụng cho ngƣời v| loại khơng thể. Tất cả mẫu ph}n tích vit B12 đƣợc tiến h|nh 3 lần tại 2 nồng độ kh{c nhau. Độ lệch phải dƣới 7.5% 3. C{c yếu tố ảnh hƣởng Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men: với cả 2 lo|i Rhizopus sp và C.freundii, nhiệt độ lên men tại 320C cho lƣợng vitamin B12 nhiều nhất. Nếu giảm nhiệt độ từ 320C xuống 280C hoặc 240C thì cũng giảm lƣợng vit B12. Một ảnh hƣởng nữa của nhiệt độ thấp l| kéo d|i thời gian lên men cho Rhizopus sp từ 34 giờ (320C) lên 50 giờ (280C) v| 67 giờ (240C). Giống C.freundii cho nhiều hơn vit B12 so với giống K.pneumoniae tại bất kỳ nhiệt độ n|o. Nhiệt độ (0C) Cyanocobalamin (ng g/ khối lƣợng khơ) C.freundii K.pneumoniae 24 114 74 28 130 95 32 152 135 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 56 Ảnh hưởng của cobalt và 5,6-dimethylbenzimidazole: sự thêm v|o cobalt l|m tăng vit B12. Lên men với K.pneumoniae đƣợc bổ sung lƣợng nhỏ cobalt (II)-sulfate-heptahydrate l|m tăng nhanh vit B12 từ 73 lên 170 ng g/khối lƣợng khơ. Sự tăng vit B12 khi thêm cobalt của C.freundii thì theo đƣờng thẳng v| đạt đến tối đa tại 290 ng g/khối lƣợng khơ. Tuy nhiên sự dự đo{n thì khơng hiệu quả khi hiệu suất thấp v| đạt tối đa chỉ 0.014 Sự thêm v|o 5,6-dimethylbenzimidazole cũng l|m tăng vit B12 đặc biệt tại h|m lƣợng thấp (0-100mg/l). Tr{i lại lên men với K.pneumoniae, ta dùng C.freundii sẽ cho kết quả tốt hơn với h|m lƣợng lên đến 300 mg/l. Hiệu suất của sự hợp nhất 5,6-dimethylbenzimidazole vào vit B12 cũng rất thấp v| chỉ đạt gi{ trị cao nhất khoảng 0.013. Số lƣợng tế b|o khơng bị ảnh hƣởng bởi việc thêm v|o 2 chất n|y v| cĩ thể so s{nh đƣợc trong tất cả qu{ trình lên men. Ảnh hưởng của số lượng tế bào cấy vào (trường hợp C.freundii): Mặc dù số lƣợng tế b|o ban đầu khoảng 105 đến 106 (g/khối lƣợng ƣớt), sau 27 giờ số tế b|o đã đạt mức 109 đến 1010 (g/khối lƣợng ƣớt). Sự tăng tốc độ ph{t triển khi tăng lƣợng nhỏ vi sinh vật cấy v|o. Sau 27 giờ, lƣợng B12 thu đƣợc trong c{c trƣờng hợp đạt gần một gi{ trị 150-160 ng g/khối lƣợng khơ, phù hợp với sự gia tăng của số lƣợng tế b|o. Ảnh hưởng của các xử lý sơ bộ trong quá trình lên men với chất nền dạng rắn lên lượng B12: Những cơng nghệ kh{c nhau đƣợc so s{nh hiệu quả tạo B12 trong suốt qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn. Lên men đƣợc tiến h|nh ng}m đậu trong lactate, v| cấy v|o giống C.freundii, Rhizopus sp cho kết quả tốt nhất. Tempeh chuẩn bị bằng phƣơng ph{p ng}m truyền thống (ng}m đậu v| cấy vào C.freundii) hoặc cĩ thể cấy thêm Rhizopus sp trƣớc khi thực hiện qu{ trình lên men với chất nền dạng rắn cho lƣợng vitamin B12 thấp nhất. Cũng cĩ sự kh{c biệt giữa tempeh cĩ qua tiệt trùng trong autoclave v| khơng qua tiệt trùng. Mẫu thí nghiệm đậu qua tiệt trùng, chỉ cĩ C.freundii đƣợc ph{t hiện sau khi SSF. Mẫu thí nghiệm khơng qua tiệt trùng đƣợc cấy C.freundii, thì sau khi ph}n lập Bacillus cereus cũng đƣợc ph{t hiện. Tempeh ng}m với phƣơng ph{p truyền thống kết hợp khơng tiệt trùng (cấy v|o Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 57 C.freundii, Rhizopus sp) cho ra nhiều vit B12 hơn tempeh l|m theo phƣơng ph{p truyền thống kết hợp khơng tiệt trùng (chỉ cấy cĩ Rhizopus sp). Bảng : Hàm lƣợng B12 v| số tế b|o trong qu{ trình lên men l|m Phƣơng ph{p lên men H|m lƣợng vitamin B12 (ng g/ khối lƣợng khơ) Số khuẩn lạc từ C.freundii (×109) R.oligosporus + C.freundii Ngâm trong lactate Tiệt trùng Khơng tiệt trùng 53.9 48.8 33.0 50.0 35.0 50.0 R. oligosporus Ngâm trong lactate Tiệt trùng Khơng tiệt trùng ND ND 23.2 ND ND 5.0 Mẫu ‚sạch‛ đối chứng Ngâm trong lactate Tiệt trùng Khơng tiệt trùng ND ND 3.5 ND ND 0.1 Chú thích:  Độ lệch ≤ 7.5%  Đối với khơng tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii và nấu nhƣng khơng tiệt trùng sau khi ngâm  Đối với khơng tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii , nấu và tiệt trùng.  Đối với ng}m trong lactate, đậu đƣợc ngâm với lactate và tiệt trùng sau khi ngâm và nấu. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 58  ND (not detectable): khơng phát hiện đƣợc. Mẫu đối chứng (khơng cấy bất cứ lo|i n|o trƣớc khi lên men với chất nền dạng rắn) ngâm bằng phƣơng ph{p truyền thống (với C.freundii), và khơng tiệt trùng nhƣng cũng thu đƣợc vit B12. Phân lập thu phát hiện đƣợc cả C.freundii, B.cereus và Micrococcus luteus. Lên men tiến h|nh theo phƣơng ph{p ngâm truyền thống và ngâm với lactate, cả 2 đƣợc tiệt trùng sau khi ngâm cho kết quả khơng cĩ vitamin B12 (chỉ cấy Rhizopus sp). 4. Thảo luận Lƣợng vitamin B12 sản xuất bằng C.freundii hoặc K.pneumoniae tăng lên khi ta tăng nhiệt độ lên men tr{i ngƣợc lại với acid amin tự do, acid γ- linolenic trong tempeh chỉ tăng khi nhiệt độ lên men thấp (24-320C). Sản xuất vit B12 luơn đi kèm với sự ph{t triển vi khuẩn. Sự gia tăng vit B12 rất ít khi thêm v|o cobalt cho thấy cobalt chứa trong đậu gần đạt điểm cực đại của h|m lƣợng vit B12 bởi C.freundii hoặc K.pneumoniae. Mặc dù sự thêm v|o cobalt v| 5,6-dimethylbenzimidazole làm tăng vit B12 đối với cả 2 giống vi sinh vật, nhƣng sự hợp nhất của chúng l| kém và cho hiệu suất thấp. Bổ sung những tiền chất n|y l| khơng cần thiết, vì lƣợng vit B12 tạo ra do 2 giống vi sinh vật trên đã đủ nhiều cho nhu cầu hằng ng|y của con ngƣời. Sự cấy v|o số tế b|o kh{c nhau của C.freundii chỉ rằng sản phẩm vitamin B12 liên quan đến sự ph{t triển của vi sinh vật. Điều n|y cũng đƣợc x{c nhận cho Propionibacterium freudenreichii. Hiệu suất thấp của phƣơng ph{p ng}m truyền thống, khơng tiệt trùng cấy v|o C.freundii trước khi lên men với chất nền dạng rắn đƣợc giải thích l| do sự tồn tại của hỗn hợp c{c vi sinh vật trong mơi trƣờng nuơi cấy trong mẫu tempeh. Mơi trƣờng m| cĩ nhiều lo|i vi sinh ngo|i C.freundii thì cho hiệu suất thấp hơn hẳn đối với mơi trƣờng thuần khiết chỉ chứa C.freundii. Sự xuất hiện của C.freundii và B.cereus trong tempeh làm theo phƣơng ph{p ng}m truyền thống, khơng tiệt trùng l| hiển nhiên v| nĩ mơ Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 59 phỏng theo phƣơng ph{p của Indonesia. Kết quả đã nĩi lên rằng vi khuẩn hiện diện trong suốt qu{ trình ng}m v| đƣợc chuyển sang qu{ trình lên men. Rhizopus spp cĩ tác động tích cực lên sự ph{t triển vi khuẩn. Lý do l| khả năng hydro hĩa của nấm mốc lên c{c chất nhƣ l| acid amin (cần cho vi khuẩn ph{t triển). Hơn nữa chất kìm hãm protease nhƣ l| Bowman-Birk đƣợc tìm thấy trong đậu v| cĩ thể kìm hãm protease của vi khuẩn. Tr{i lại protease của nấm (loại aspartate) khơng nhạy với chất kìm hãm, do đĩ cĩ thể ph}n giải acid amin cho dù cĩ sự hiện diện của c{c chất kìm hãm protease. Kết luận trong sự so s{nh của c{c qu{ trình xử lý sơ bộ trƣớc khi thƣc hiện SSF chỉ ra rằng phƣơng ph{p ng}m đậu trong lactate kết hợp cấy C.freundii cho hiệu suất tốt nhất. Họ Enterobacteriaceae chứa nhiều mầm bệnh, nhƣ l| Salmonella typhi, Shigella dysenteriae,K.pneumoniae và Yersinia pestis. Thêm v|o đĩ E.coli, C.freundii g}y ra bệnh tiêu chảy. Mặc dù tempeh chƣa nhiều th|nh viên của họ Enterobacteriaceae, nhƣng khơng cĩ kiểm tra n|o cho thấy c{c vi sinh vật g}y bệnh tiêu chảy n|o cịn lại sau khi ăn tempeh. Tuy nhiên do 2 giống K.pneumoniae, C.freundii cần thiết cho lên men nên phải đƣợc kiểm tra khả năng sinh độc tố enterotoxin, nếu vƣợt qu{ mức sẽ khơng đƣợc sử dụng. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 60 PHẦN VI: PHỤ LỤC Các sản phẩm vitamin B12 hiện cĩ trên thị trƣờng I. Folic acid & vitamin B12 injection Th|nh phần:  Folic acid 15mg/mL  Cyanocobalamin: 500µg/mL II. Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm Cơng thức: Cyanocobalamin ................................................. 1000 mg Kali dihydrophosphat ……………………………....5 mg Natriclorid................................................................2,5mg Nƣớc cất pha tiêm................................................ ..vđ 1ml. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 61 III. Viên nén vitamin B12 Th|nh phần:  Vitamin B12 5000 mcg (83,33%)  Các thành phần khác: magnesium sterate, stearic acid, và microcrystalline cellulose  Khơng cĩ nấm men, đƣờng, màu nhân tạo, chất tạo vị, chất bảo quản. Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 62 PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]: Nguyễn Đức Lƣợng, ‚Cơng nghệ vi sinh tập 2: Vi sinh vật học cơng nghiệp”, Nhà xuất bản ĐHQG TP.HCM, 2002. [2]: Lê Bạch Tuyết, ‚Các quá trình cơng nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm”, NXB GD, 1996. [3] Nguyễn Tiến Thắng. ‚Giáo trình sinh hĩa hiện đại”, NXB GD, 1998. *4+: Ronald R. Eitenmiller and W.O.Landen, Jr, ‚Vitamin analysis for the health and the food sciences”, CRC Press LLC, 1999. [5]: “ Vitamins In Foods Analysis, Bioavailability, and Stability”, Taylor & Francis Group, LLC, 2006. [6]: www.freepatentsonline.com [7]: www.journal@chive.com [8]: www.spingerlink.com [9]: www.sinhhocvietnam.com