Tiểu luận Sắc ký ái lực hiệu năng cao

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Lớp: K13S2 ****** Bài Tiểu Luận: GVHD: ThS CAO NGỌC MINH TRANG. SVTH: Nguyễn Anh Tây. Vũ Thị Hà. Mai Bảo Lâm. Trần Thị Xuân Trang. Nguyễn Phan Hải Yến. Nguyễn Thị Diễm Hương. Lê Văn Hòa. Tháng 11/2010 KHÁI QUÁT: Sắc kí lỏng hiệu năng cao. Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chiết tách riêng các chất trong một hỗn hợp mẫu chất phân tích dựa trên cơ chế của sự phân bố, hấp thu, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử). trong đó pha tĩnh có thể là chất rắn hay là chất lỏng phủ lên bề mặt của một chất mang. Các loại pha tĩnh để nhồi cột: Cột pha thường: Cột pha tạo nối: Cột pha đảo. Cột trao đổi ion. Cột sắc ký gel. Người ta có thể phân loại và gọi tên phương pháp sắc ký theo bản chất của pha động và pha tĩnh: sắc ký rắn - lỏng, có pha tĩnh là các hạt mịn thường là silica . Sắc ký lỏng - lỏng, có pha tĩnh là một chất lỏng được bao phủ lên một giá mang nhờ vào một lực vật lý. Để tránh việc dung môi bị trôi tuột ra khỏi giá mang, thì dung môi giải ly phải được bão hoà với thành phần của pha tĩnh Cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Bình chứa dung môi giải ly cột. Hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ hai bình chứa dung môi. Bình được làm bằng chất liệu trơ, luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào bình, nắp có lỗ hở để thông với khí trời. trong bình có ống dẫn dung môi vào cột sắc ký, ở đầu này của ống có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi Có hai kiểu sử dụng pha động trong việc giải ly: Giải ly dơn nồng độ: một pha động được sử dụng suốt trong quá trình sắc ký Giải ly nồng độ tăng dần theo tuyến tính: trong quá trình sắc ký, tính phân cực của pha động được thiết kế tăng dần theo lên từ từ đều đặn Máy bơm. Bơm của máy sác kí lỏng hiệu năng cao là loại bơm đặc biệt với áp suất cao lên đến 48,3 Mpa để bơm dung môi pha động đi xuyên qua một pha tĩnh với vận tốc không đổi. Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm. Cột sắc ký. Cột thường được làm bằng thép không rỉ. cột sắc kí được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ có đường kính 10.000 mâm lý thuyết /mét. Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được đi ngang qua một cột bảo vệ, sử dụng để lọc bỏ những tạp chất bẩn còn sót lại. Bộ phận chích mẫu vào máy. Máy HPLC có hệ thống chích mẫu đặc biệt: gồm ống chứa mẫu là van có hai cổng, giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau. Khi máy đang hoạt động pha động đi xuyên qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao. Đầu dò. Sắc ký ái lực hiệu năng cao. Sắc ký ái lực được định nghĩa như là một kỹ thuật sắc ký lỏng mà việc sử dụng nó như một "sự tương tác sinh học" cho việc tách và phân tích hỗn hợp các chất có trong một mẫu cụ thể. Những tương tác sinh học này như là mối liên hệ giữa enzyme và chất ức chế, hay của một kháng thể với kháng nguyên. Để thực hiện được phương pháp này cần sử dụng một chất kết dính, được gọi là "cấu tử gắn có ái lực", cấu tử này sẽ chọn lọc tương tác với các chất cần phân tích và sau đó đặt cấu tử gắn này lên một thể mang khác, thể mang này thường là các hạt silica, sau đó phức chất này sẽ được nhồi vào bên trong cột để thực hiện quá trình sắc ký. Trong sắc ký ái lực có : Sắc ký ái lực hiều năng thấp: chất thường được dùng làm pha tĩnh trong cột sắc kí là agarose, dextran hoặc cellulose. Phương pháp thường được sử dụng để khai thác mẫu và xử lý sơ bộ bởi vì nó là tương đối dễ sử dụng và rẻ tiền. Sắc kí ái lực hiệu năng cao: cột thường được nhồi bởi các hạt nhỏ, cứng như silica hoặc các polyme tổng hợp có khả năng chịu được tốc độ dòng chảy  hoặc áp lực đó là đặc trưng của hệ thống HPLC. Với tốc độ dòng chảy tốt hơn và áp lực hỗ trợ sắc kí ái lực hiệu năng cao  dễ dàng kết hợp vào các hệ thống công cụ khác cho kết quả nhanh và chính xác cho việc định lượng chất phân tích. Dựa vào pha tĩnh được sử dụng trong sắc kí, ta có nhiều loại sắc kí khác nhau: Sắc kí ái lực lectins Sắc kí ái lực boronate Sắc kí ái lực protein hay protein G Sắc kí ái lực miễn dịch Sắc ký ái lực được thiết kế để làm sạch một loại protein đặc biệt từ một mẫu hỗn hợp. Hình 1. Cột sắc kí nhồi. Hình 2. Protein sàng thông qua hạt có ái lực. Hình 3. Protein tương tác với mối quan hệ phối tử với một số ràng buộc lỏng lẻo và những người khác chặt chẽ. Hình 4. Rửa protein mà không có được gắn vào hạt. Hình 5. Rửa sạch những protein có liên kết lỏng lẻo. Hình 6. Tách protein có liên kết chặt chẽ với cấu tử gắn và thu thập các protein tinh khiết cần quan tâm  ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ ÁI LỰC. Phân tách Protein. Ứng dụng này dựa vào việc sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein cần tách. Cấu tử gắn thường được cố định qua các liên kết cộng hoá trị vào các giá thể không tan như cellulose hoặc polyacryl-amide. Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách sẽ gắn với giá thể trong khi các protein khác sẽ rửa trôi ra khỏi cột. Sau khi rửa sạch tạp chất, protein cần tách được phản hấp phụ bằng các chất cạnh tranh như cấu tử tự do, hay bằng các chất có khả năng phá vỡ tương tác. Phân tách concanavalin A: Concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột. Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. Các đặc tính đặc trưng của từng loại protein có thể được tận dụng để giúp tinh sạch loại protein tương ứng được thuận tiện và hiệu quả hơn. Giả sử, nếu chúng ta biết một loại protein khi hoạt động liên kết đặc hiệu với ATP, thì có thể dùng cột sắc ký mang vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein đó. Chỉ có protein liên kết với ATP mới được cột giữ lại, và cho phép hầu hết các loại protein không liên kết với ATP được chảy trôi qua cột. Có nhiều hợp chất khác nhau có thể được sử dụng để gắn kết với cột và giúp quá trình tinh sạch protein dễ dàng và hiệu quả hơn. Các hợp chất này bao gồm cả các trình tự ADN (để tinh sạch protein liên kết ADN) hoặc thậm chí là một loại protein để tinh sạch một loại protein khác được biết hoặc được mong đợi có tương tác phân tử với loại protein trên. Như vậy, để bắt đầu tinh sạch một loại protein nào đó, cần phải có những hiểu biết cơ bản về loại protein đó và tìm cách khai thác, ứng dụng các đặc tính có nó cho quá trình tách chiết và tinh sạch. Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch. Trong phương pháp này, người ta gắn kháng thể đặc hiệu với protein đích lên vật liệu làm cột sắc ký. Trong trường hợp lý tưởng, loại kháng thể này chỉ liên kết đúng với loại protein cần quan tâm còn cho phép tất cả các loại protein khác chảy trôi qua cột. Loại protein liên kết sau đó sẽ được thu hồi (hồi lưu) bằng cách sử dụng dung dịch muối hoặc đôi khi là các dung dịch chất tẩy nhẹ chảy qua cột. Khó khăn cơ bản gặp phải đối với phương pháp này là đôi khi liên kết giữa kháng thể và protein khá bền vững đến mức phải gây biến tính protein mới thu hồi được sản phẩm. Trong khi khác với ADN, protein sau khi biến tính thường không có khả năng hồi tính, vì vậy protein thu được theo cách này nhiều khi ở dạng không hoạt động chức năng và mất đi giá trị sử dụng trong nghiên cứu. Để tăng hiệu quả tinh sạch, các protein cũng có thể được cải biến. Những cải biến này có thể là sự bổ sung các trình tự axit amin ngắn hoặc là vào đầu C hoặc vào đầu N của phân tử protein cần phân tích. Những bổ sung này, hay còn gọi là Ptrình tự đánh dấu có thể tạo ra được bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. Các trình tự peptit đánh dấu giúp thay đổi thuộc tính của một phân tử protein mong muốn và giúp tinh chế protein này dễ dàng hơn. Ví dụ như, đối với một số protein người ta tiến hành bổ sung một chuỗi gồm 6 histidin giúp những protein này liên kết với Ni2+ gắn trên cột chặt hơn và dễ phân tách hơn, trong khi thuộc tính này thường không có ở phần lớn các loại protein khác. Ngoài ra việc sử dụng các epitop đặc hiệu (thường là một trình tự peptit có 5 - 7 axit amin đặc hiệu xác định kháng nguyên) cũng có thể được gắn vào phân tử protein cần tinh chế. Các cải biến này cho phép tinh sạch các loại protein trên cơ sở nguyên tắc sắc ký ái lực miễn dịch và sử dụng dị kháng nguyên mang các epitop được bổ sung. Điều đặc biệt là, các kháng thể và epitop này có thể thay đổi tính liên kết kháng thể tùy thuộc vào điều kiện khác nhau của môi trường (chẳng hạn, ái lực tăng khi không có Ca2+, và ái lực giảm khi có Ca2+). Điều này cũng giúp làm giảm ảnh hưởng của các yếu tố gây biến tính khác. Nguyên tắc sắc ký ái lực miễn dịch cũng có thể được dùng để làm kết tủa nhanh một loại protein đặc hiệu nào đó (và mọi loại protein liên kết chặt với nó) từ một dịch chiết thô. Trong trường hợp này, phản ứng kết tủa thu được do kháng thể được gắn vào cùng loại hạt được sử dụng trong sắc ký cột. Do các hạt này có kích thước lớn, nên chúng lắng rất nhanh xuống đáy ống nghiệm mang theo các kháng thể và protein liên kết với chúng. Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật kết tủa miễn dịch, cũng là một kỹ thuật ngày càng sử dụng phổ biến để tinh sạch nhanh protein hoặc phức hệ protein từ các dịch chiết thô. Mặc dù nếu chỉ sử dụng phương pháp này riêng rẽ, hiếm khi thu được sản phẩm protein được tinh sạch hoàn toàn, song phương pháp này thường rất hiệu quả để xác định các loại phân tử protein và các hợp chất khác (ví dụ như ADN) có tương tác với một loại protein đích nào đó. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết.